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Durch das Entstehen von neuen Infektionskrankheiten und das Auftreten von Resistenzen können bisher verwendete Medikamente ihren pharmazeutischen Nutzen verlieren. Daher ist eine konstante Weiterentwicklung von bioaktiven Pharmazeutika lebensrettend. Viele pflanzli-che und mikrobielle Sekundärmetabolite besitzen gesundheitsfördernde Wirkungen und kön-nen als Ressourcen für die Entwicklung neuer Arzneimittel herangezogen werden. Da Pflan-zen und Mikroorganismen ein sehr umfangreiches Repertoire an pharmazeutisch-interessanten Intermediaten besitzen, soll im Rahmen dieser Arbeit die Produktbildung von pflanzlichen und mikrobiellen Sekundärmetaboliten vorgestellt werden, die für weiterführende medizinische Studien von Interesse sind.
Die in dieser Arbeit präsentierten mikrobiellen Sekundärmetabolite sind β-Lactam Antibiotika der Gruppe der OA-6129 und besitzen antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive als auch gramnegative Mikroorganismen. Durch die Kultivierung des filamentösen Actinobakteri-ums Streptomyces fulvoviridis A933 17M9 1501 können diese sehr wirksamen Antibiotika gebildet werden. Für eine erfolgreiche Produktbildung wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweistufiger Prozess im Bioreaktor etabliert, der sich über einen Zeitraum von neun Tagen erstreckt. Durch Optimierung und Variation des Mediums, sowie durch die Veränderung der Rührergeometrie, kann die maximale Antibiotikakonzentration um 385 % gesteigert werden.
Neben der zu optimierenden Produktbildung ist auch die Stabilität der Antibiotika im wässrigen Milieu von Interesse. Die Untersuchungen erfolgten am Produktanalogon Imipenem. Es zeig-te sich, dass durch Interaktionen der Imipenemmoleküle der Zerfall mit steigender Antibiotik-akonzentration beschleunigt wird. Ein dazugehöriger Zerfallsweg des Imipenems in deionisie-rem Wasser bei pH 7 konnte durch die Auswertung der HPLC und Massenspektrometrie-Analytik beschrieben werden. Bioaktive Zerfallsprodukte, wie das sehr aktive β-Lactam Thienamycin, können aus dieser Zerfallsreaktion resultieren. Auch im Fermenta¬tionsmedium kann ein konzentrationsabhängiger Zerfall nachgewiesen werden, was für eine wirtschaftli-che, fermentative Herstellung problematisch wäre. Durch die Verwendung von Morpholino-sulfonsäurepuffern ist eine Stabilisierung des Antibiotikums im Wasser und im Fermentati-onsmedium realisierbar. Eine Steigerung der Halbwertszeit von über dem 10fachen gegen-über einer reinen Imipenemlösung im Wasser kann durch die Verwendung dieser Puffersub-stanzen erzielt werden.
Bei den zweiten, in dieser Arbeit behandelten Sekundärmetaboliten, handelt es sich um die pflanzlichen Triterpene Oleanol- und Ursolsäure, von denen antibakterielle, antivirale, entzün-dungshemmende und Krebs vorbeugende Aktivitäten bekannt sind. Neben anderen Pflanzen bilden Spezies von Salbei und Basilikum diese interessanten Sekundärmetabolite. Da bei ei-ner Freilandkultivierung die Produktkonzentrationen jährlichen Schwankungen durch abioti-schen und biotischen Faktoren unterliegen, kann durch eine in situ Kultivierung eine reprodu-zierbare Produktbildung erzielt werden. Im Zuge der Arbeit wurden Kalluskulturen von Salvia officinalis und Ocimum basilicum in verschiedenen Reaktortypen und mit verschiedenen Pro-zessstrategien eingesetzt und betreffend ihrer Produktbildung untersucht. Eine Oleanol- und Ursolsäurebildung durch eine Kalluskultur von Ocimum basilicum konnte durch diese Arbeit zum ersten Mal präsentiert werden.
Im Vergleich zu Kultivierungen in Erlenmeyerkolben fördert eine Kultivierung im Wavebag-Reaktor das Wachstum und die Produktbildung, sodass die maximale Triterpenkonzentration um 210 % gesteigert werden kann. Durch Variation der batch-Prozessstrategie in ein repea-ted-batch-Verfahren kann eine signifikante Steigerung der Oleanolsäurebildung um das 16fache und der Ursolsäurebildung um das 35fache erzielt werden. Es wird angenommen, dass auftretende Substratlimitierung zu einer Steigerung der Produktbildung führt.
Durch eine nachfolgende Biotransformation ist es möglich, die beiden Triterpene zu modifizie-ren. Eine Derivatisierung kann neben einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Triterpene auch in einer Erhöhung der pharmazeutisch-interessanten Aktivitäten resultieren. Aus diesem Grunde wurden neun Organismen betreffend ihrer biokatalytischen Aktivität untersucht. Mit-tels des Actinobakteriums Nocardia iowensis werden die Oleanol- und Ursolsäure zunächst in ihre korrespondierenden Methylester transformiert. Des Weiteren entstehen bei der Biotrans-formation von Oleanolsäure zwei weitere, bisher unbekannter Derivate, welche durch HPLC, HPLC-ESI-MS und HPLC-1H-NMR charakterisiert werden konnten. Anhand dieser Resultate kann ein neuer Biosyntheseweg für eine Oleanolsäuretransformation mittels Nocardia iowen-sis beschrieben werden.
Um die Abtrennung der Biotransformationskultur von Medium zu vereinfachen und die Wirt-schaftlichkeit zu fördern, kann N. iowensis in Natriumalginat immobilisiert werden. Während kein signifikanter Unterschied zwischen immobilisierten und freien Bakterienzellen betreffend der Substrataufnahme detektiert wird, wird durch die Immobilisierung die Produktbildung re-primiert. Dabei besitzt die Matrixdichte, die aus der Behandlung der Natriumalginatpartikel mit der Calciumchloridlösung resultiert, einen entscheidenden Einfluss auf die Biotransformati-onseffizienz.
Auch eine Zusammenführung von Pflanzenzellkultivierung und Biotransformation in einem Gesamtprozess wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Durch den direkten Einsatz der immobilisierten Biotransformationskultur im verdünnten Zelllysat umgeht man eine Aufarbei-tung der Produkttriterpene aus dem Pflanzenzelllysat, was die Wirtschaftlichkeit des Prozes-ses erheblich verbessert. Bis zu einem Mischverhältnis von 50 % Referenzmedium und Zell-lysat kann keine Inhibierung oder Reprimierung der Biotransformation durch vorhandene Pflanzenzellbestandteile, wie z. B. Phenolen, detektiert werden.
Optisches On-line-Verfahren zur Trockengewichtsbestimmung bei Fermentationen von filamentösen Pilzen
(2002)
In der vorgelegten Arbeit wurde eine neue Technik untersucht, mit deren Hilfe das Myzeltrockengewicht bei Fermentationen von filamentösen Pilzen im On-line-Verfahren über optische Messungen bestimmt werden kann. Das Verfahren beruht auf der Messung der Lichtstreuung resp. der diffusen Reflexion des Myzels in einem Fermenter. Eine theoretische Beschreibung der diffusen Reflexion resp. der Lichtstreuung großer und völlig unregelmäßiger Partikel, wie man sie bei den filamentösen Pilzen findet, kann im Augenblick nicht gegeben werden. Aus diesem Grund muss für die Anwendung das Verfahren über empirische Befunde abgesichert werden. Um externe Eichkurven erstellen zu können, wurde ein Probengefäß von der Form eines "Hornes" resp. der Form einer klassischen Lichtfalle und ein Rührsystem für die Off-line-Messungen entwickelt, in dem die Fehler der Eichmessungen durch die Reflexionen von den Glaswänden des Probengefäßes und des Rührsystems stark reduziert werden. Die Verfälschung der Intensität der Reflexion und der Lichtstreuung konnte dabei um den Faktor 62 vermindert werden. d.h. der Fehler bei kleinen Teilchenkonzentrationen wurde dadurch reproduzierbar um mehr als 100 % verringert. Die Einsatztauglichkeit des entwickelten Probengefäßes und des Rührsystems wurde mit Streulichtmessungen an Polystyrolteilchen der Firmen Duke Scientific Corporation und BASF mit einer den Pellets ähnlichen Größe überprüft. Für die Interpretation der gemessenen Intensitätstkurven ergab sich der wichtige Befund, dass bei diesen Polystyrolteilchen keine wesentliche Wellenlängenabhängigkeit der Streulichtintensität gefunden wurde. Es wurden sieben verschiedenen filamentöse Pilze mit der entwickelten Streulicht/diffusen Reflexionsmethode untersucht, um deren Verwendbarkeit zur Trockengewichtsbestimmungsmethode abzusichern. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine On-line-Trockengewichtsbestimmung bei Fermentationen von filamentösen Pilzen über Streulichtintensitäten/diffuse Reflexionsintensitäten möglich ist. Diese Methode ist nur anwendbar, wenn die Intensitätsveränderungen des Anregungslichtes sich während der Fermentation nicht wesentlich ändert, d.h. innerhalb der Fehler der Methode liegt. In einer Arbeit von Koch wurde bei Bakterien gezeigt, dass die Streulichtintensität proportional zum Volumen der Bakterien und nicht zur Bakterienanzahl ist. Die Analyse der Pelletgrößenverteilungen bei filamentösen Pilzen hat auch gezeigt, dass die Streulichtintensität proportional zum Myzeltrockengewicht unabhängig von der vorliegenden Größenverteilung ist. Trotz dieser Befunde bleiben die Ursachen der Intensitätsveränderungen bei der Fermentationen von verschiedenen Pilzen, d.h. die unterschiedlichen Steigungen im linearen Zusammenhang zwischen Myzeltrockengewicht und Intensität, ungeklärt.