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Das aktuelle Design von Wirkstoffen ist fokussiert auf die Entwicklung von Molekülen, die das Tumorzellwachstum durch Inhibition mehrerer Signalwege unterdrücken können. Indirubin wurde als Hauptwirkstoff von Dangui Longhui Wan, einem Mittel der Traditionellen Chinesischen Medizin identifiziert, welches in China zur Behandlung vieler Krankheiten wie Leukämie benutzt wurde. Indirubine wurden als potente ATP-kompetitive CDK-Inhibitoren identifiziert, die in der ATP-Bindungstasche binden, Apoptose induzieren und das Wachstum von Tumorzellen effizient hemmen. Darüber hinaus zeigten Indirubin-Derivate Hemmwirkungen auf eine ganze Reihe anderer Kinasen wie z. B. GSK-3ß, VEGFR und c-Src, die beim Tumorzellwachstum eine entscheidende Rolle spielen. Ziel war es, Substituenten am Indirubingrundgerüst in die 5-, 5’- und 3’-Position einzuführen, um die Wasserlöslichkeit weiter zu verbessern, die metabolische Stabilität zu erhöhen, ohne jedoch Antitumorwirksamkeit abzuschwächen. Durch Einführung weiterer N-Atome in das Indirubingrundgerüst sollten CYP450-induzierte Hydroxylierungen am Kern vermieden werden, die zur Wirkungsabschwächung führten, wie frühere Arbeiten gezeigt haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 neue Indirubin-Derivate und 3 neue Aza- und Diazaindirubine hergestellt und mittels CHN-Analyse und NMR-spektroskopisch charakterisiert. Für das bei der Kondensation zu 7-Aza- und 7,7’-Diazaindirubin benötigte 7-Azaisatin wurde eine neue Synthesemethode entwickelt. Die Wasserlöslichkeit der neuen Indirubine wurde photometrisch und ihre Zytotoxizität mit Hilfe von SRB-Assays an LXFL529L-Tumorzellen bestimmt. Durch Inkubation mit Rinderlebermikrosomen wurde der Phase-I-Metabolismus von Indirubin-5- carboxamiden und Indirubin-3’-oximethern untersucht. Die Hauptmetaboliten von E748, E857, E857a, E860 und E860a wurden mittels HPLC, HPLC-NMR und LC-MS/MS identifiziert. Weitere Untersuchungen zum Wirkmechanismus ausgewählter neuer Verbindungen, wie z. B. die Hemmung von Topoisomerasen und die Erstellung eines Hemmprofils an 30 verschiedenen Kinasen wurden durch andere Institute durchgeführt. Im Vergleich zu Indirubin-5-carboxamiden zeigen Indirubin-5’-carboxamide mit gleichem Substituenten eine 2 – 15 fache schwächere Wachstumshemmung an LXFL529L-Zellen und trotz basischem Zentrums auch keine signifikant verbesserte Wasserlöslichkeit. 5,5’-Disubstituierte Indirubine mit Carboxyl- oder Carboxamid- Gruppe als Substituent zeigten sogar bis zu einer Konzentration von 100 μM keine Hemmwirkung mehr. Eine Erklärung hierfür könnte der knapp bemessene Raum der ATP-Bindungstasche im Bereich der 5’-Position sein. Die Oximether E857 und E860, sowie die Hydrochloride E857a und E860a zeigten eine sehr potente Proliferationshemmung an LXFL529L-Zellen mit IC50-Werten von ca. 1 μM. Die Hydrochloride wiesen hervorragende Werte für die Wasserlöslichkeit mit über 25000 mg/L auf, so dass in vivo Applikationen ohne weitere Formulierungen durchführbar sind. 7,7’-Diazaindirubin (E864) zeigte eine äußerst potente Wachstumshemmung von humanen Tumorzellen. Die IC50-Werte im SRB-Assay von E864 lagen im unteren nanomolaren Bereich an verschiedenen Tumorzellen. 7-Azaindirubin (E866) zeigte im Vergleich mit Indirubin eine erhöhte Wasserlöslichkeit und verbesserte antiproliferative Wirkung, insbesondere löst es sich in vielen organischen Lösungsmitteln. E865 ist das 7’-Aza-Analoge von E857, einem 3’-Oximether mit basischen Zentrum und zeigt 7-fach verbesserte Wasserlöslichkeit ohne Abschwächung der Hemmwirkung an der Tumorzelllinie LXFL529L. Ergebnisse des Kinaseprofilings ergaben jedoch, dass die ATP-Bindungsstelle von Proteinkinasen vermutlich nicht das Haupttarget dieser Wirkstoffe sind. Beim Testen von 277 Proteinkinasen konnte keine Proteinkinase als Target für E864, dem potentesten Inhibitor der Tumorzellproliferation, identifiziert werden. Bei Inkubationen mit Rinderlebermikrosomen von E748, einem Indirubin-5- carboxamid, fand eine Hydroxylierung an der 7’-Position statt. Weil eine Hydroxylierung an dieser Position eine Bindung des Moleküls in der ATP-Bindungstasche erschwert oder verhindert, ist der Metabolit vermutlich ein schwächerer Tumorzellwachstumsinhibitor. Zur Vermeidung einer derartigen Hydroxylierung erschien es sinnvoll, die Substituenten zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit in 3’-Position anzubringen, was die Ergebnisse der Metabolisierung von E857 und E857a bestätigten. Nach Inkubation mit Lebermikrosomen fanden die Metabolisierungen nicht am Indirubin-Gerundgerüst statt. Als Hauptmetaboliten konnten das N-oxid (E867) und ein Hydroxymethylpiperazin-Derivat identifiziert werden. Das Kinaseprofiling, das Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus ermöglicht, zeigte, dass E857 nicht nur CDKs und GSK-3ß hemmt (IC50 = 1-10 μM), sondern auch andere für eine Tumorentstehung relevante Targets wie z. B. FAK und IGF1-R (IC50 < 1 μM). Damit scheinen E857 und E857a die bisher am besten geeigneten Indirubine für eine Weiterentwicklung zum Antitumortherapeutikum zu sein und weitere Untersuchungen sollen in vivo durchgeführt werden, um die Ergebnisse mit den in vitro-Daten zu vergleichen und abzusichern.
Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Verbindungen aus imperfekten Pilzen zu selektieren und zu isolieren, die ueber die Hemmung des JAK2-STAT-1alpha-Signalweges die Induktion der iNOS-Expression in humanen A549/8-Zellen, humanen Lungen-Alveolarepithel-Karzinom-Zellen, negativ beeinflussen. Es konnten drei Verbindungen aus unterschiedlichen Penicillium-Staemmen isoliert werden, die durch Reportergen-Analysen betreffend der Wirkung der Rohfermentationsprodukte auf die iNOS-, eNOS-Promotor-Aktivitaet sowie der STAT-1alpha-abhaengigen Promotor-Aktivitaet selektiert wurden. Die Substanzen Sporogen-A01, S-Curvularin sowie S14-95 zeigten in den Reportergen-Analysen aehnliche Aktivitaeten, die sich nur in der Potenz unterschieden. Waehrend Sporogen-A01 und S-Curvularin eine, wenn auch konzentrationsunabhaengige, Hemmung auf die NF-kappaB-abhaengige Promotor-Aktivitaet in HeLa-S3-Zellen zeigten, so ergab sich fuer S14-95 kein Einfluss auf diesen Signaltransduktionsweg. Bei S14-95 scheint es sich um eine spezifisch die IFN-gamma-abhaengigen Wege der transkriptionellen Aktivierung der iNOS hemmende Verbindung zu handeln. Die Effekte dieser Substanz auf den humanen TNF-alpha-Promotor liegen wie auch fuer S-Curvularin bei 80% Hemmung und auch der humane COX-2-Promotor wurde durch alle drei Substanzen in Reportergen-Analysen stark gehemmt. In A549/8-Zellen zeigten die Substanzen keine (S14-95 und S-Curvularin) oder lediglich geringe (Sporogen-A01) Wirkung auf die Zellproliferation. Die Verbindungen stellen wichtige Strukturen dar, die bei der pharmakologischen Unterdrueckung der NO-Produktion in pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen koennten. Im zweiten Teil wurde in humanen DLD1-Zellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen, und A549/8-Zellen die Regulation der iNOS-Expression durch kleine G-Proteine der Rho-Familie, die bekanntermassen in den Signaltransduktionsweg von Cytokinen involviert sind, untersucht. Atorvastatin und Lovastatin (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer), die Ras- und Rho-Proteine gleichermassen indirekt hemmen, indem sie ihre essentielle Membranverankerung verhindern, erhoehten die Cytokin-induzierte NO-Produktion und iNOS-mRNA-Expression in den untersuchten humanen Zellen auf das 2 bis 4-fache, ohne jedoch selbst die Expression der iNOS induzieren zu koennen. DLD1- und AKN1-Zellen, die stabil mit einem 16kb-Fragment des humanen iNOS-Promotors vor einem Luziferase-Reportergen transfiziert worden waren, zeigten in Gegenwart von Atorvastatin oder Lovastatin eine mehr als 2,5-fache Steigerung der Cytokin-induzierten Luziferaseaktivitaet, was fuer eine erhoehte Transkriptionsrate als Ursache der erhoehten iNOS-mRNA-Spiegel spricht. In A549/8piNOS(16)Luc-Zellen erhoehten die beiden Statine die Luziferaseaktivitaet dagegen in einem weitaus geringerem Masse, so dass in diesen Zellen eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen, im Sinne einer erhoehten iNOS-mRNA-Stabilitaet, anzunehmen ist. Die beobachtete Statin-vermittelte Verstaerkung der Cytokin-induzierten iNOS-mRNA-Expression und iNOS-Promotoraktivitaet konnte durch Substitution von Mevalonat und Geranylgeranylpyrophosphat wieder vollstaendig aufgehoben werden, waehrend die Koinkubation mit FPP nur eine geringfuegige Reduktion zur Folge hatte. Die Superinduktion war somit das Ergebnis einer spezifischen Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und beruhte auf der Hemmung posttranslational geranylgeranylierter Proteine. Vor dem Hintergrund, dass die kleinen G-Proteine der Rho-Familie vorwiegend geranylgeranyliert und die der Ras-Familie hauptsaechlich farnesyliert werden, scheint die Cytokin-induzierte iNOS-Expression durch Rho-Proteine negativ reguliert zu werden. Diese Hypothese konnte dadurch verifiziert werden, dass auch Clostridium difficile Toxin B - das durch UDP-Glucosylierung saemtliche Rho-Proteine (Rho, Rac, Cdc42) direkt inaktiviert, Ras-Proteine jedoch unbeeinflusst laesst - die Cytokin-induzierte iNOS-mRNA-Expression in den humanen Zellen auf mehr als das Dreifache zu steigern vermochte.