Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde das Protein AtMSBP1 (Arabidopsis thaliana Monosaccharid Binding Protein 1) aus der Familie der Zuckertransporter auf molekularer und biochemischer Ebene untersucht. Dieses Protein weist sowohl strukturelle, als auch funktionelle Besonderheiten im Vergleich zu anderen bisher untersuchten Zuckertransportern aus Arabidopsis thaliana auf. Die MSBP-Proteine stellen eine eigene Gruppe innerhalb der Monosaccharid-Transporter der Pflanzen dar. Sie haben wie andere Zuckertransporter 12 transmembrane Helices, die zwischen Helix 6 und 7 durch einen großen zentralen Loop miteinander verbunden sind. Dieser hydrophile Loop ist bei den MSBP-Proteinen 4 bis 5 mal so lang wie bei anderen Zuckertransportern und spielt für die Funktion der MSBP-Proteine wahrscheinlich eine wichtige Rolle. Die MSBP-Proteine weisen mehr Ähnlichkeit zu bakteriellen als zu plasmamembranständigen pflanzlichen Monosaccharidtransportern auf. Die Proteine des MSBP-Typs wurden in verschiedenen Spezies der Angiospermen identifiziert. In Arabidopsis thaliana kommen drei Isoformen der MSBP-Proteine vor, die auf mRNA-Ebene in verschieden Geweben nachgewiesen wurden und ein spezifisches Expressionsmuster zeigen. Der AtMSBP1 ist in der äußeren Plastidenmembran lokalisiert, trägt dort aber nicht signifikant zum Glukosetransport bei. Bei der Anzucht von AtMSBP1::T-DNA- und AtMSBP2::T-DNA-"knock out"-Mutanten auf Erde gibt es keine signifikanten phänotypischen Unterschiede im Vergleich zu Wildtyppflanzen. Bei erhöhten Konzentrationen verschiedener Zucker zeigen aber die "knock out"-Mutanten auf morphologischer und molekularer Ebene einen sensitiveren Phänotyp im Vergleich zu Wildtyppflanzen. Die Ergebnisse lassen auf eine Verknüpfung der MSBP-Proteine mit den "Zuckersensing-Wegen" der Pflanzen schließen.
Es wurden Untersuchungen zur Expression und Wechsel von Serotypproteinen bei Paramecium primaurelia, Stamm 156 durchgeführt. Zum Nachweis der unterschiedlichen Serotypexpressionen wurden Immunofluoreszenzfärbungen und eine spezifische RT-PCR etabliert. Mit dieser Methode wurde der Ablauf eines temperaturinduzierten Serotypwechsels dokumentiert. Es wurde der Einfluss weiterer Umweltparameter auf die Ausprägung des Serotyps untersucht. Freilandexperimente sollten die Ausprägung der Serotypen unter multifaktorieller Reizeinwirkung zeigen. Zusätzlich konnte die Koexpression von zwei Serotypproteinen auf einer Zelle nachgewiesen werden.
Die cytogenetische Manifestation von Genamplifikation in humanen Zellen wurde in einem Fall von akuter myeloischer Leukämie (AML) sowie an der humanen Cervixcarcinomzelllinie HeLa S3 untersucht. In dem AML-Fall ergab die Karyotypisierung der Leukämiezellen neben dem Verlust eines X-Chromosoms das Vorliegen einer extrachromosomalen Genamplifikation in Form von Double Minutes. Mit Hilfe der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) und der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) wurde die Herkunft der amplifizierten Sequenz aus der chromosomalen Region 8q24 ermittelt und eine Amplifikation des Protoonkogens MYC in den Double Minutes nachgewiesen. Die FISH-Analyse zeigte zudem den Verlust von einem der beiden chromosomalen MYC-Loci an, der auf einen Deletionsmechanismus der Genamplifikationsentwicklung schliessen ließ. Die Induktion der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase-Gens (DHFR) durch Selektion mit Methotrexat (MTX) diente als Modellsystem zur Analyse der frühen Stadien der Genamplifikationsentwicklung. Durch mehrmonatige Mehrschrittselektionen von zwei HeLa-Zellpopulationen wurden unabhängig voneinander zwei HeLa-Sublinien mit jeweils extrachromosomaler DHFR-Amplifikation in Form von Double Minutes erzeugt. Die Veränderungen der 5q-Trägerchromosomen und der intrachromosomalen DHFR-Kopienanzahl, die im Verlauf der MTX-Selektionen in den HeLa-Zellen auftraten, wiesen auf das Zusammenwirken unterschiedlicher Mechanismen zur DHFR-Amplifikation hin. Niedrige MTX-Konzentrationen wirkten in Richtung einer Anreicherung von intrachromosomalen DHFR-Kopien, die hauptsächlich auf den Zugewinn eines Chromosoms 5 zurückzuführen waren. Daneben wies das Auftreten von neuen derivativen DHFR-haltigen Chromosomen auf Bruchereignisse in Chromosom 5 hin. Das Erscheinen eines derivativen Chromosoms mit zwei invertiert angeordneten 5q und drei DHFR-Kopien ließ auf das Ablaufen von Breakage-Fusion-Bridge (BFB)-Zyklen schliessen. Bei höheren MTX-Konzentrationen (ab 0.25 µM) trat dagegen eine Anreicherung von extrachromosomalen DHFR-Kopien in Double Minutes bei gleichzeitigem Rückgang der derivativen DHFR-haltigen Chromosomen in den Vordergrund. Die Sublinien aus Selektion 1 waren in diesem Stadium durch den Verlust eines Chromosoms 5 gekennzeichnet, der auf eine Generierung von extrachromosomalen DHFR-Kopien aus 5q-Bruchstücken hinwies. Im Gegensatz dazu trat bei den Sublinien von Selektion 2 in diesem Stadium zunächst noch eine Zunahme von intrachromosomalen DHFR-Kopien auf, die nachfolgend durch eine sprunghafte Erhöhung von extrachromosomalen DHFR-Kopien in Double Minutes in der Zellpopulation abgelöst wurde. In den Sublinien von Selektion 2 kann daher eine Generierung von extrachromosomalen DHFR-Kopien durch Bruchereignisse an einem zuvor hinzugewonnenen Chromosom 5 angenommen werden. Die letzten Sublinien aus beiden Selektionen wiesen wieder den 5q-Trägerchromosomen- und intrachromosomalen DHFR-Status der Parentallinie auf, der offenbar in den HeLa-Zellen eine besondere Stabilität besitzt. Die unterschiedlichen Veränderungen im 5q- und DHFR-Status in den untersuchten HeLa-Sublinien zeigen, dass eine DHFR-Amplifikation in HeLa-Zellen unter MTX-Selektionsdruck auf verschiedenen Wegen erfolgen kann. In mehrmonatiger Kultivierung ohne Selektionsdruck entwickelte die verwendete HeLa-Zelllinie unter den vorliegenden Kultivierungsbedingungen keine der in den MTX-selektionierten Sublinien beobachteten Veränderungen, so dass diese als selektionsspezifische Prozesse angesehen werden können.
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der PDE1C-Isoform in ZNS-Zellen zu untersuchen. Es sollte vor allem die Bedeutung der PDE1C als mögliches Target für die anti-neoplastische Therapie von ZNS-Tumoren näher beleuchtet werden. Die humanen Glioblastomzellinien SNB75, SF295, SF539 und SF268 wurden bezüglich ihrer PDE1- und PDE4-Isoenzymausstattung näher charakterisiert. Es zeigte sich, daß die Zellinien SNB75 und SF295 in ihrem PDE-Expressionsmuster sehr unterschiedlich sind: In der Zellinie SNB75 liegt die cAMP-hydrolytische Aktivität deutlich über jener in SF295-Zellen. Darüber hinaus weisen die SNB75-Zellen einen hohen Anteil Ca2+/CaM-stimulierbarer PDE1-Aktivität bei niedriger PDE4-Aktivität auf. Im Gegensatz dazu zeigt die Zellinie SF295, welche keine Ca2+/CaM-stimulierbare PDE-Aktivität besitzt, einen hohen prozentualen Anteil an Rolipram-hemmbarer PDE4-Aktivität. Darüber hinaus verhalten sich die beiden Zellinien auch bezüglich ihrer Gehalte an den „second messengern“ cAMP und cGMP komplementär. In den SNB75-Zellen ist der cAMP-Spiegel etwa um 2/3 niedriger als in den SF295-Zellen; der cGMP-Spiegel ist etwa doppelt so hoch wie der cAMP-Gehalt. In SF295-Zellen hingegen liegt der Gehalt an cGMP um etwa die Hälfte niedriger als der cAMP-Spiegel und ist somit vergleichbar mit dem cGMP-Gehalt der SNB75-Zellen. Auch die intrazelluläre Konzentration von Ca2+ ist in der Zellinie SNB75 höher als in SF295-Zellen. Die Untersuchung ausgelöster Ca2+-Transienten – mit besonderem Augenmerk auf den capacitativen Ca2+-Einstrom (CCE) – ergab, daß in SNB75-Zellen die Kapazität der intrazellulären Ca2+-Speicher und die Geschwindigkeit der Speicherentleerung größer sind als in SF295-Zellen. Auch der CCE ist in SNB75-Zellen größer als in der Zellinie SF295. An den beiden humanen Glioblastomzellinien SNB75 und SF295 wurden mittels Cytotoxizitätstests verschiedene PDE-Hemmstoffe auf ihr wachstumshemmendes Potential untersucht. Für den PDE4-Inhibitor DC-TA-46 konnte ein IC50-Bereich von 3-4.5 µM für die Hemmung des Zellwachstums ermittelt werden. Der als PDE1-Hemmstoff eingesetzte CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wies einen IC50-Wert für die Wachstumshemmung von 2-3 µM auf. Ein Zusammenhang zwischen PDE1 bzw. PDE4-Expression der Zellinien und dem wachstumshemmenden Potential der eingesetzten Substanzen war nicht erkennbar. Zur weiteren Charakterisierung der Zellinie SNB75 wurden der Karyotyp und die Verdopplungszeit der Zellinie bestimmt. Weiterhin wurde die cDNA der PDE1C aus der humanen Biopsieprobe TB1365 (anaplastisches Astrocytom) kloniert und das rekombinante Protein transient überexprimiert. An der rekombinanten PDE1C wurden – neben der Stimulierbarkeit des Proteins durch Ca2+/CaM (+ 130 %) – die beiden PDE-Hemmstoffe DC-TA-46 und Vinpocetin getestet. Diese beiden Substanzen hemmten die Aktivität der rekombinanten PDE1C um durchschnittlich 42 % (DC-TA-46) bzw. 28 % (Vinpocetin). Ein in vitro-Tiermodell zur näheren Untersuchung der PDE-Ausstattung und cAMP-Homöostase von nicht-malignen ZNS-Zellen und Glioblastomzellen sollte aus subkultivierten Ratten-Astrocyten und der Ratten-Glioblastomzellinie C6 entwickelt werden. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, entgegen Daten für Keratinocyten (Marko et al., 1998), daß die PDE-Aktivität in nicht-malignen Ratten-Astrocyten deutlich höher liegt als in der Glioblastomzellinie C6. Die Ratten-Astrocyten zeigen eine höhere Ca2+/CaM-stimulierbare PDE1-Aktivität. In der Zellinie C6 hingegen ist der PDE4-Anteil im Vergleich zu Ratten-Astrocyten höher. Diese Ergebnisse werden durch RT-PCR-Versuche gestützt. Die Gehalte der „second messenger“ cAMP, cGMP und Ca2+ sind in nicht-malignen Ratten-Astrocyten und malignen C6-Zellen vergleichbar. Allerdings weisen die C6-Zellen einen größeren CCE auf. Der Einsatz von DC-TA-46 in Cytotoxizitätstests weist sowohl in Ratten-Astrocyten als auch in C6-Tumorzellen vergleichbare Hemmwirkungen (IC50-Wert ~ 1.5 µM) auf. Der CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wirkt in subkultivierten Ratten-Astrocyten bereits in geringsten Konzentrationen wachstumshemmend; der IC50-Wert der Wachstumshemmung von C6-Zellen liegt bei 2.3 µM. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen allerdings, daß das untersuchte Ratten-Zellmodell – auch aufgrund der unterschiedlichen Kulturbedingungen, welche die PDE-Expression beeinflussen – nur mit Einschränkungen einsetzbar ist. Aufgrund der aktuellen Daten scheint die PDE1C als Target für eine anti-neoplastischen Therapie von ZNS-Tumoren kaum geeignet. Der Vergleich von nicht-malignen und malignen ZNS-Zellen deutet eher auf eine „down“-Regulation der PDE1C und eine „up“-Regulation der PDE4 hin. Dies konnte sowohl in humanen als auch in Rattenzellen gezeigt werden und müßte in weiteren Untersuchungen vertiefend untersucht werden.
Sepsis ist eine lebensbedrohliche Infektion, welche eine der häufigsten Todesursachen bei Patienten der Intensivstation ist. Die Mortalität des septischen Schocks hat sich während der letzten 25 Jahre trotz Verbesserung lebenserhaltender Maßnahmen nicht wesentlich verringert. Bei der Sepsis lösen externe Faktoren (die invadierenden Mikroorganismen) die Erkrankung aus, körpereigene Reaktionskaskaden jedoch entscheiden letztlich über den Verlauf, der in der Sepsis ein sehr heterogenes Erscheinungsbild zeigen kann. Darum führt eine allein gegen den Mikroorganismus gerichtete Therapie bei der Sepsis häufig nicht zum Erfolg. Eine therapeutische Intervention in körpereigene Abläufe setzt jedoch voraus, dass diese Vorgänge, die involvierten Proteine sowie die molekularen Mechanismen bekannt sind. Da klinische Studien darauf hinweisen, dass während der Pathogenese der Sepsis eine aktivierungsabhängige, exzessive Verminderung der T-Lymphozyten im Blutbild (Lymphopenie) infolge verstärkter Apoptose auftritt und damit die Abwehr der Pathogene negativ beeinträchtigt wird, bildeten Untersuchungen an aktivierten T-Zellen den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Aktivierte T-Lymphozyten sind wichtige Zellen der natürlichen Immunantwort und spielen eine entscheidende Rolle im Verlauf von Infektionserkrankungen. Eine therapeutische Modulation ihrer Apoptose könnte die Ereigniskaskade früh unterbrechen und möglicherweise den dramatischen klinischen Verlauf der Sepsis dämpfen. Der Befund der Lymphopenie in Sepsis führte mich zu der Hypothese dieser Arbeit, dass PPARg hierfür verantwortlich sein könnte, da eine Aktivierung von PPARg nicht nur antiinflammatorisch, sondern auch proapoptotisch wirken kann. Eine diesbezügliche Verbindung zwischen Lymphopenie bei Sepsis und PPARg-Expression wurde noch nicht untersucht. Deshalb habe ich im Rahmen dieser Arbeit analysiert, inwieweit PPARg zur Lymphopenie von T-Zellen septischer Patienten beiträgt. Den Ausgangspunkt bildeten dabei Untersuchungen an aktivierten T-Zellen. Sowohl an der T-Zelllinie Jurkat, als auch an primären CD3+ T-Zellen konnte ich Folgendes zeigen: 1. Die Aktivierung von humanen T-Zellen mit dem T-Zell-Mitogen PHA induziert die Expression des Liganden-abhängigen Transkriptionsfaktors PPARg, führt jedoch nicht autokrin zu dessen Aktivierung. 2. Physiologische Mediatoren wie Stickstoffmonoxid oder synthetische PPARg-Liganden wie Ciglitazon bewirken eine Aktivierung von PPARg in den PHA-aktivierten T- Zellen. 3. Der durch spezifische Agonisten aktivierte Transkriptionsfaktor PPARg ruft in aktivierten T-Zellen Apoptose hervor. 4. SR-202 greift in die PPARg-vermittelte Apoptose ein. Die Vorinkubation mit diesem spezifischen PPARg-Antagonist führt zu einer verminderten Apoptose der aktivierten T-Zellen. 5. Fas-vermittelte Apoptose ist der am besten untersuchte Apoptose-auslösende Reaktionsweg in T-Zellen. Vorliegende Untersuchungen mit einem anti-Fas-neutralisierenden Antikörper zur näheren Charakterisierung der PPARg-vermittelten Apoptose verweisen jedoch auf Fas-unabhängige Mechanismen. Um die klinische Relevanz der Daten zu prüfen, versuchte ich, die Ergebnisse auf das Modell der Sepsis zu übertragen. Folgende Zusammenhänge ließen sich dabei erkennen: 1. Es ist bekannt, dass die T-Lymphozyten im septischen Geschehen im Vergleich zum gesunden Spender deutlich vermindert sind. Dies ist in Übereinstimmung mit meinen Befunden. Zusätzlich bestätigte sich die Annahme, dass der Zelltod apoptotisch, also gerichtet, verläuft. 2. In den T-Zellen der septischen Patienten ist im Gegensatz zu den T-Zellen gesunder Probanden die Expression von PPARg erhöht, so dass, aufbauend auf die Vorversuche an aktivierten T-Zellen, eine PPARg-vermittelte Apoptose postuliert werden konnte. 3. Die Zugabe von PPARg-Agonisten zu den septischen T-Zellen erhöht die Apoptose, während die Vorinkubation mit dem Antagonisten SR-202 vor der Agonisten-Behandlung die Apoptose hemmt. 4. Basierend auf Untersuchungen mit einem Fas-neutralisierenden Antikörper, ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose in septischen T-Zellen ebenfalls Fas-unabhängig sind. In Erkrankungen, deren Verlauf wie bei der Sepsis durch Lymphopenie gekennzeichnet ist, könnte der hier aufgezeigte Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose von pathophysiologischer Signifikanz sein. Das bessere Verstehen der Signaltransduktionswege, die zu der PPARg-Expression sowie der PPARg-abhängigen Apoptose in aktivierten T-Zellen führen, könnten eine Basis für neue therapeutische Strategien im Kampf gegen die Sepsis bilden. Erste Anhaltspunkte dafür liefert der Nachweis der Modulation der T-Zell-Apoptose durch den spezifischen PPARg-Antagonist SR-202.