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Seit Beginn der 90er Jahre werden vermehrt Kreisverkehre gebaut. Insbesondere beim Umbau vorhandener LSA-Kreuzungen zu Kreisverkehren werden Vorteile für den Individualverkehr gesehen. Diese Vorteile werden allerdings mit Nachteilen für den öffentlichen Personennahverkehr erkauft. Die erstmals untersuchten Auswirkungen dieser Knotenpunktform auf Fahrzeuge des öffentlichen Personennahverkehr (ÖPNV) sind teilweise erheblich: - Wartezeiten für ÖV-Fahrzeuge an Kreisverkehren schwanken und sind schlecht in den Fahrplan zu integrieren, - Fahrtrichtungswechsel bei der Befahrung der Kreisfahrbahn reduzieren den Fahrkomfort, - ÖPNV-Beschleunigungen werden an Kreisver-kehren selten angewandt, - ÖPNV-Priorisierungmöglichkeiten durch Eingriffe in Lichtsignalanlagensteuerungen entfallen. Dass Beschleunigungen auf dem Linienweg in vielen Fällen möglich sind, wurde sowohl durch empirische Auswertungen bestehender Kreisverkehre als auch durch Simulationen gezeigt. Bei geringen Verkehrsstärken sind Beschleunigungen im Allgemeinen nicht notwendig. Zudem steht die Wirkung häufig in ungünstiger Relation zum erforderlichen Aufwand. Bei hohen Verkehrsstärken in den Zufahrten ermöglicht dagegen z.B. die ÖV-Spur hervorragende Beschleunigungen für den ÖV. Allerdings wurden bei zweistreifiger, pa-ralleler Führung von MIV- und ÖV-Strömen zu einstreifigen Kreisverkehren häufig Irritationen zwischen MIV- und ÖV-Fahrzeugen beobachtet. Kei-ne Irritationen wurden beobachtet, wenn MIV- und ÖV- Spur in der Zufahrt zum Kreisverkehr zweistreifig parallel geführt werden und die MIV-Fahrspur unmittelbar vor dem Kreisverkehr in einer Fahrstreifenreduktion endet und die ebenfalls endende ÖV-Spur als normaler Fahrstreifen fortgeführt wird. Bei dieser als „KREIFAS“ (KReisverkehr mit EIngezogenem FAhrstreifen) bezeichneten Verkehrsführung wechseln die MIV-Fahrzeuge den Fahrstreifen, während der ÖV geradeaus weiterfahren kann. Eine Beschleunigungsmöglichkeit bei der Einfahrt in die Kreisfahrbahn bietet die „schlafende LSA“. Der Vorrang der Fahrzeuge auf der Kreisfahrbahn wird durch eine schlafende Lichtsignalanlage (Dunkelampel) aufgehoben, wenn ÖV-Fahrzeuge in der Zufahrt auf den Kreisverkehr zufahren. Fahrzeuge aus dieser Zufahrt erhalten solange Vorrang, bis dass das ÖV-Fahrzeug die Kreisfahrbahn erreicht hat. Durch diese und andere Maßnahmen wird eine Reduzierung von Wartezeiten für Busse bei der Einfahrt in die Kreisfahrbahn erreicht, ebenso wie eine Verstetigung des Fahrtverlaufes in der Zufahrt und somit eine Steigerung von Fahrplantreue und Fahrkomfort erreicht. Insgesamt ist eine ausgewogene Berücksichtigung aller Verkehrsteilnehmer auch bei Planungen an Kreisverkehren erforderlich. Wenn ÖV-Linien beschleunigt über Kreisverkehre geführt werden sollen, sind deren Anforderungen besonders sorgfältig zu berücksichtigen. Somit ergeben sich auch für das Element Kreisverkehr Beschleunigungsmöglichkeiten, um den Wegfall von LSA-Beschleunigungsmaßnahmen in weiten Teilen zu kompensieren.
Der Trend zur Verfügbarkeit mehrerer Mobilfunknetze im gleichen Versorgungsgebiet nicht nur unterschiedlicher Operatoren, sondern auch unterschiedlicher Mobilfunkstandards in möglicherweise unterschiedlichen Hierarchieebenen führt zu einer Vielzahl von Koexistenzszenarien, in denen Intersystem- und Interoperator-MAI die einzelnen Mobilfunknetze beeinträchtigen können. In der vorliegenden Arbeit wird ein systematischer Zugang zur Koexistenzproblematik durch die Klassifizierung der MAI erarbeitet. Eine MAI-Art kann dabei mehreren MAI-Klassen angehören. Durch die Einteilung in Klassen wird angestrebt, zum einen die eine MAI-Art beeinflussenden Effekte anhand der Zugehörigkeit zu bestimmten MAI-Klassen besser verstehen zu können. Zum anderen dient die Einteilung der MAI in Klassen zum Abschätzen der Gefährlichkeit einer MAI-Art, über die sich Aussagen machen lassen anhand der Zugehörigkeit zu bestimmten MAI-Klassen. Der Begriff Gefährlichkeit einer MAI-Art schließt neben der mittleren Leistung auch weitere Eigenschaften wie Varianz oder Ursache der MAI ein. Einfache Schlimmstfall-Abschätzungen, wie sie in der Literatur gebräuchlich sind, können leicht zu Fehleinschätzungen der Gefährlichkeit einer MAI-Art führen. Durch die Kenntnis der zugehörigen MAI-Klassen einer MAI-Art wird die Gefahr solcher Fehleinschätzungen erkennbar. Neben den Schlimmstfall-Abschätzungen unter Berücksichtigung der MAI-Klassen werden in der vorliegenden Arbeit auch Simulationen durchgeführt, anhand derer die Abschätzungen verifiziert werden. Dazu werden Werkzeuge in Form von mathematischen Modellen zum Berechnen der Leistung der verschiedenen MAI-Arten unter Einbeziehen der verschiedenen betrachteten Verfahren zum Mindern von MAI erarbeitet. Dabei wird auch ein Konzept zum Vermindern der erforderlichen Rechenleistung vorgestellt. Anhand der Untersuchung der Koexistenz der beispielhaften Mobilfunksysteme WCDMA und TD-CDMA wird gezeigt, daß sich das Auftreten extrem hoher Intersystem- bzw. Interoperator-MAI durch geeignete Wahl der Systemparameter wie Zellradien und Antennenhöhen, sowie durch Verfahren zum Mindern von MAI wie effizienten Leistungsregelungsverfahren und dynamische Kanalzuweisung meist vermeiden läßt. Es ist jedoch essentiell, daß die Koexistenzproblematik bereits in der Phase der Funknetzplanung adäquat berücksichtigt wird. Dabei ist eine Kooperation der beteiligten Operatoren meist nicht notwendig, lediglich besonders kritische Fälle wie Kollokation von BSen verschiedener TDD-Mobilfunknetze z.B. nach dem 3G-Teilstandard TD-CDMA müssen von den Operatoren einvernehmlich vermieden werden. Da bei der Koexistenz von Mobilfunknetzen in Makrozellen aufgrund ihres hohen Zellradius besonders hohe Interoperator-MAI für den Fall der Gleichstrecken-MAI auftreten kann, wird in der vorliegenden Arbeit ein neuartiges Konzept zum Vermindern dieser MAI basierend auf Antennentechniken vorgestellt. Das Konzept zeigt ein vielverspechendes Potential zum Mindern der Interoperator-MAI.
Das L1 Adhäsionsmolekül vermittelt wichtige migratorische Prozesse bei der Entwicklung des Nervensystems und schützt Neuronen vor Apoptose. Außerdem wird L1 auf vielen Tumoren exprimiert, wo es die Motilität von Tumorzellen erhöht und so vermutlich die Metastasierung begünstigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Einfluss von L1 auf die Apoptose von Tumorzellen untersucht. Dabei wurde beobachtet, dass die Expression von L1 zu einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose führt. In Ovarialkarzinomzellen korreliert die Stärke der Expression mit der Apoptoseresistenz und die Behandlung einer Mischpopulation aus L1-positiven und -negativen Zellen mit Cisplatin führt zur Selektion und Anreicherung ersterer. An der Induktion der Apoptoseresistenz ist nicht nur transmembranes L1 beteiligt, sondern auch durch membranproximale Spaltung freigesetztes lösliches L1, das durch Apoptose vermehrt generiert wird. Die Inhibition der Spaltung mit Metalloproteinase-Inhibitoren stellt die Sensitivität gegen Apoptose wieder her und weist auf eine wichtige Rolle der Spaltung von L1 bzw. anderer Faktoren (z.B. HB-EGF) bei der Zytoprotektion hin. L1 kann nicht nur an der Plasmamembran gespalten, sondern auch über Vesikel freigesetzt werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, um verschiedene vesikuläre Strukturen zu trennen und zu charakterisieren. Dies ermöglichte erstmals den Nachweis von L1,ADAM10 und -17 in von Tumorzellen sekretierten Exosomen. In Ovarialkarzinomzellen findet die Spaltung von L1 unter konstitutiven Bedingungen in Membranstrukturen der Endosomen und des Golgi-Apparates statt und steht in einem direkten Zusammenhang mit der Ausschüttung von Exosomen. Ein ähnlicher Mechanismus ist auch nach Behandlung der Zellen mit Spaltung-induzierenden Substanzen, wie APMA, MCD, TFP oder Ionomycin, zu beobachten. In Aszites von Ovarialkarzinom-Patientinnen konnten ebenfalls Exosomen nachgewiesen werden. Die Sekretion von Exosomen stellt einen wichtigen Mechanismus zur ADAM10-vermittelten Generierung von löslichem L1 in vitro und vermutlich auch in vivo dar. Mit Neuropilin-1 konnte ein neuer Interaktionspartner von L1 auf Mesothelzellen identifiziert werden. Dabei können Tumorzellen L1-vermittelt an NRP1-positive Zellen adhärieren. Weiterhin kann lösliches L1 als Ligand an NRP1-exprimierende Zellen binden. Dies zeigt eine neue Möglichkeit zur Interaktion von disseminierten Tumorzellen mit Mesothelzellen im Peritoneum.
In dieser Arbeit wurden auf der Basis des felinen Foamyvirus (FFV) bzw. Spumaretrovirus diverse replikationsdefiziente Vektoren entwickelt und deren Tranduktionseffizienz, Stabilität, Markergenexpression und biologische Sicherheit unter Zellkulturbedingungen charakterisiert. Ausgehend von replikationskompetenten FFV-Vektoren wurden zunächst so genannte selbst-inaktivierende (SIN) Vektoren, in welchen die LTR-Promotoraktivität inhibiert ist, konstruiert. Diese FFV-SIN-Vektoren erlaubten eine stabile Transduktion und Markergenexpression, entwickelten jedoch nach einer begrenzten Zeit replikationskompetente Revertanten und waren daher nicht zur Transduktion langlebiger Zellen geeignet. In Analogie zu humanen Foamyvirus-basierenden Vektoren wurde anschließend ein Großteil der env-Sequenz aus den SIN-Vektoren deletiert, um die biologische Sicherheit der Vektoren zu erhöhen. Diese Env-deletierten und FFV-Promotor-abhängigen Vektoren waren allerdings aufgrund eines schwachen und schnell abklingenden Markergentransfers nicht zur effizienten und stabilen Markergentransduktion geeignet. Zur Entwicklung replikationsdefizienter Vektoren mit einem starken heterologen Promotor zur Markergenexpression wurden verschiedene Deletionen in das Vektorgenom eingeführt und Helferplasmide für die Strukturgene bzw. viralen Enzyme kloniert. Hiermit wurde ein transientes Transfektionssystem zur Produktion von Vektorpartikeln etabliert, wobei die für den Markergentransfer essentiellen cis-agierenden Sequenzen auf dem FFV-Genom identifiziert wurden. Die Lokalisation zweier essentieller cis-agierender Sequenzen am 5’-Ende des Genoms und in pol ermöglichte die anschließende Konstruktion replikationsdefizienter Bel1-unabhängiger Vektoren, in denen die 3’ von pol liegenden Gene fast vollständig deletiert und durch eine Expressionskassette, bestehend aus dem humanen Ubiquitin C-Promotor und dem lacZ-Gen, ersetzt wurden. Diese neuen FFV-basierenden Vektoren erlauben einen effizienten Markergentransfer und ermöglichen eine stabile Transduktion diverser Zielzellen bei gleichzeitiger nicht nachweisbarer viraler Genexpression und replikationskompetenter Revertanten. Daher sind diese Vektoren biologisch sicher, zur Transduktion langlebiger Zellen geeignet und können daher für gentherapeutische Untersuchungen in tierexperimentellen Modellen verwendet werden.
Die Aufgabenstellung dieser Arbeit betraf die kinetische Charakterisierung des Wildtyps sowie der Mutanten E und G der Glucose-Dye-Oxidoreductase (GlucDOR) mit den N-substituierten p-Nitrosoanilinen BM-53.0861, BM-31.1008 und BM.31.1144 (firmeninterne Bezeichnungen) und den Zuckern Glucose, Maltose und Galaktose als Zweitsubstrate. Diese Mediatoren finden bei der Firma Roche Diagnostics GmbH ihre praktische Anwendung und befinden sich unter anderem auf dem Testsreifensystem, welches zur Blutzuckerbestimmung bei Diabetikern benutzt wird. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnenen Daten bezüglich z.B. der Substratspezifität, Stabilität der drei Enzyme sollte abgeschätzt werden, in wie weit eine praktische Anwendung der Mutanten E und G möglich und auch sinnvoll wäre. Die Charakterisierungen mit den Zuckern Glucose, Maltose und Galaktose und Mediator BM-53.0861 als Zweitsubstrat zeigten, dass beide Mutanten eine bessere Spezifität für die Glucose gegenüber der Maltose aufwiesen. Dabei war die Mutante G mit einem Quotienten vmaxMaltose/vmaxGlucose von 0,018 wesentlich spezifischer als die Mutante E, bei der der Quotient 0,10 betrug. Ein Vergleich der Spezifität für Glucose gegenüber der Galaktose zeigte, dass beide Mutanten eine schlechtere Spezifität als der Wildtyp hatten. Die Berechnungen der 3D-Struktur der Mutanten E und G brachten einige strukturelle Hinweise, durch die die veränderten Substratspezifitäten gegenüber dem WT, besonders im Fall der Maltose, erklärt werden konnten. So ragt z.B. Tyrosin 343 bei den Mutanten weiter in das aktive Zentrum als beim WT und kommt so der Maltose ziemlich nahe. Dadurch könnte es zu sterischer Hinderung kommen. Beim Vergleich der kinetischen Parameter der Mutanten E und G für die Glucose mit den Zweitsubstraten BM-53.0861, BM-31.1008 und BM-31.1144 mit denen des WTs, sprechen die Ergebnisse nicht gegen eine Anwendung der Mutanten auf den Teststreifen. Weder die leicht niedrigeren Hemmkonstanten der Mediatoren, noch die höheren kM-Werte für die Glucose bei den Mutanten sollten ein Hindernis darstellen, da das Enzym auf den Teststreifen in großem Überschuss vorliegt. Ein Aspekt, der bei der praktischen Anwendung zu Problemen führen kann, ist die verringerte Thermostabilität beider Mutanten. Sie zeigten bei 60 °C einen erheblichen Stabilitätsverlust gegenüber dem WT der GlucDOR. Nach einer halben Stunde Inkubationzeit hatten sie weniger als 10 % Restaktivität. Im Falle der Mediatoren BM-31.1008 und BM-31.1144 konnte durch ESR-Untersuchungen festgestellt werden, dass das Phenylendiaminradkal, welches sich im nichtenzymatischen Gleichgewicht zwischen den entsprechenden Chinondiiminen und Phenylendiaminen befindet, nicht für die auftretende Hemmung verantwortlich ist. Mit einem Abnehmen der Umsatzraten sank auch die Konzentration an Phenylendiaminradikal, was im Falle einer durch das Radikal verursachten Hemmung nicht sein dürfte. Ebenfalls konnte durch die ESR-Untersuchungen gezeigt werden, dass während einer konstanten enzymatischen Umsetzung auch die Konzentration des Phenylendiaminradikals konstant blieb. Das spricht für ein konstantes Redoxpotential des Testsystems während der Umsetzung. Das Radikal kann als eine Art Marker für die Gesamtkonzentration an Chinondiimin und Phenylendiamin angesehen werden. Insgesamt zeigt die Arbeit, dass die beiden Mutanten E und G der GlucDOR für die Anwendung auf Teststreifen zur Blutzuckerbestimmung geeignet sind, wenngleich sie eine gewisse Thermoinstabilität im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. Diesbezüglich sollten noch Verbesserungen vorgenommen werden.
Externe elektrische Gleichspannungsfelder können sowohl den physikalischen, als auch den reaktiven Stoffaustausch bei der Flüssig-Flüssig Extraktion signifikant beeinflussen, wodurch eine Steigerung des Stoffüberganges im elektrischen Feld erzielt werden kann. Die Gründe hierfür sind im elektrischen Feld gesteigerte Grenzflächenturbulenzen und feldinduzierte Konzentrationspolarisationen im Phasengrenzflächenbereich, welche durch Migrationswechselwirkungen verursacht werden. Das elektrische Feld hat bezüglich des reaktiven Stoffübergangs sowohl in Einzel- als auch im Mehrkomponentensystem keinen Einfluss auf das chemische Gleichgewicht. Jedoch wird durch das Feld die Kinetik beschleunigt und das Gleichgewicht schneller erreicht. Auch die maximale Trennselektivität im Mehrkomponentensystem, welche im Gleichgewicht erreicht wird, wird nicht durch das Feld verändert. Diese ist primär von der Konzentration und der Säurestärke abhängig. Lediglich im Falle sehr schwacher Säuren ist das Gleichgewicht über das natürliche hinaus verschiebbar. Diese Stoffaustauscherhöhung ist durch die im elektrischen Feld erhöhte Dissoziation der Übergangskomponente gemäß dem 2. Wien’schen Effekt erklärbar. Zudem ist die feldinduzierte Stoffaustauscherhöhung stark von der Feldwirkrichtung abhängig. Der Feldeinfluss ist dann maximal, wenn das Feld direkt in Stoffübergangs-richtung wirkt. Dies ist bei unbewegten (z. B. planaren) Grenzflächen erreichbar. So konnte in planaren Stoffübergangszellen und am hängenden Tropfen eine starke Stoffaus-tauschbeschleunigung in der Größenordnung von ca. 1000 % erzielt werden. Am bewegten Tropfen konnte zwar eine Stoffaustauscherhöhung durch die im Feld geänderten hydrodynamischen Betriebsgrößen (wie Tropfengröße und Verweilzeit) erzielt werden, jedoch konnte darüber hinaus keine weitere Stoffaustauschbeschleunigung erzielt werden. Dies kann damit erklärt werden, dass bei bewegter sphärischer Grenzflächengeometrie das Feld nicht nur in Stoffübergangsrichtung wirkt und feldinduzierte Polarisations-erscheinungen sich weitgehend kompensieren. Daher gelingt in klassischen Extraktionsapparaten, welche mit Dispergierung und Tropfen-bildung arbeiten, die Verfahrensumsetzung der kontinuierlich betriebenen Extraktion im Hochspannungsfeld nicht effizient. Diese gelingt in einem speziellen Zentrifugalextraktor, dem Taylor-Couette Elektroextraktor, in wessen Ringsspalt zwischen zwei als Elektroden fungierenden, konzentrischen Zylindern auf Grund der Rotationsbewegung sich eine planaranaloge, zylindrische Phasengrenzfläche ausbildet und das Feld somit direkt in Stoffübergangsrichtung wirken kann. Auch wird der stationäre Betriebszustand binnen weniger Minuten erreicht. Zudem entstehen im Phasengrenzbereich Taylorverwirblungen, welche ebenfalls den Stoffaustausch erhöhen. Zur theoretischen Beschreibung konnten Stoffübergangsmodelle entwickelt werden, welche die feldinduzierten Polarisationseffekte berücksichtigen. So gelingt die Berechnung des reaktiven Stoffaustauschs über ein elektrostatisch erweitertes Kinetikmodell, welches neben der chemischen Reaktion, der Grenzflächenadsorption des Ionenaustauschers und dem Reaktionsgleichgewicht, auch die Migration über die Nernst Planck Gleichung, sowie auch die Elektrodissoziation über einen Ansatz nach Onsager berücksichtigt. Die Berücksichtigung der im elektrischen gesteigerten Grenzflächenturbulenz gelingt über einen elektrostatisch erweiterten Ansatz nach Maroudas und Sawistowski. Auch wurde ein Modell zur Berechnung des Stoffübergangs im Taylor-Couette Extraktors vorgestellt. Die Berechnung der anliegenden elektrischen Felder gelingt über die Finite Elemente Methode basierend auf den Maxwell’schen Gleichungen oder vereinfacht über die Laplace Gleichung. Wesentlich ist, dass nicht die Elektrodenpotentialdifferenz, sondern das berechnete Potential an der Phasengrenzfläche den Stofftransfer im elektrischen Feld bestimmt, was durch die Simulationsrechnungen bestätigt wurde.
Anthocyane, eine Untergruppe der Flavonoide, sind als natürliche Farbpigmente weit verbreitet in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft. Ihnen werden eine Reihe von gesundheitlich positiven Wirkungen zugeschrieben, was dazu geführt hat, dass auf dem Markt für Nahrungsergänzungsmittel immer mehr Produkte auf Anthocyanbasis auftauchen. Als ein möglicher nachteiliger Faktor für eine potentielle genotoxische Wirkung von Flavonoiden wird die Interaktion mit humanen Topoisomerasen diskutiert. Bezüglich einer möglichen Risiko/Nutzen-Evaluierung ist es nicht nur von Bedeutung, ob Flavonoide/Anthocyane mit diesen Enzymen interagieren, sondern auch die Art dieser Interaktion und sich möglicherweise daraus ergebende Konsequenzen, besonders im Hinblick auf die Integrität der DNA. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Anthocyanidine Delphinidin (Del), Cyanidin (Cy), Pelargonidin (Pg), Paeonidin (Pn) und Malvidin (Mv) hinsichtlich ihrer Beeinflussung humaner Topoisomerase I und II zu untersuchen. Ein Schwerpunkt lag bei der Aufklärung des Wirkmechanismus dieser Verbindungen bezüglich einer Stabilisierung des Cleavable Complex, möglichen Interaktionen mit der DNA und die Relevanz dieser Effekte für die Integrität zellulärer DNA. Es konnte gezeigt werden, dass nur die Verbindungen mit vicinalen Hydroxygruppen im B-Ring des Anthocyangrundgerüstes, Del und Cy, effektiv die katalytische Aktivität isolierter humaner Topoisomerase I und Topoisomerase IIalpha + IIbeta hemmen. Sie wirken jedoch nicht wie die klassischen Topoisomerasegifte Camptothecin oder Etoposid über die Stabilisierung des kovalenten Topoisomerase-DNA-Komplexes, sondern stellen rein katalytische Inhibitoren dar. Del und Cy könnten sogar die DNA vor Topoisomerase I-Giften schützen, da sie zumindest am isolierten Enzym die Stabilisierung des Cleavable Complex der Topoisomerase I durch Camptothecin effektiv verhindern. Für alle getesteten Anthocyanidine konnte gezeigt werden, dass sie im niedrigen mikromolaren Bereich, zwischen 15 µM und 50 µM, sowohl an die kleine Furche der DNA binden, als auch in die DNA interkalieren können und das diese DNA-interagierenden Eigenschaften keinen wesentlichen Beitrag zur Hemmung der Topoisomerasen liefern. Auch wenn im Falle der Anthocyanidine die direkte DNA-Interaktion im Hinblick auf die Topoisomerasehemmung nur von geringer Bedeutung ist, so scheint sie jedoch relevant bezüglich der Integrität zellulärer DNA zu sein. Die einstündige Inkubation von HT29 Kolonkarzinomzellen zeigte, dass bei Inkubation mit den Anthocyanidinen in Konzentrationen >50 µM, signifikant DNA-Schäden induziert werden. Im Hinblick auf die Integrität der DNA lebender Zellen scheint der jeweilige Konzentrationsbereich von entscheidender Bedeutung zu sein. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Überexpression der Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1) nach Inkubation mit Topoisomerasegiften zu untersuchen. Im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Boege, Universitätsklinikum Düsseldorf, wurden uns verschiedene Zellklone zur Verfügung gestellt, die ein Fusionsprotein aus TDP1 und GFP überexprimierten, sowie eine katalytisch inaktive Variante des Enzymes (TDP1-H263A). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen an diesen Zelllinien zur Zytotoxizität von Topoisomerasegiften durchgeführt, sowie Untersuchungen zum Einfluss der TDP1 auf die Induktion von DNA-Schäden durch Topoisomerasegifte. Untersuchungen zum Zellwachstum der verschiedenen Zelllinien mittels MTT-Zytotoxiziätsassay zeigten nach 72 stündiger Inkubation mit den Topoisomerasegiften Camptothecin (Topo I) und Etoposid (Topo II) keinen signifikanten Wachstumsvorteil bei Überexpression der TDP1. Betrachtet man jedoch die Induktion von DNA-Schäden bei Kurzzeitinkubationen (1h) von Camptothecin im Comet-Assay, so erkennt man eine signifikante Reduktion der DNA-Schäden bei Überexpression der TDP1. Ist bei der TDP1 das katalytische Histidin 263 gegen Alanin ausgetauscht, steigen die DNA-Schäden auf das gleiche Niveau wie bei nicht TDP1-überexprimierenden Zellen, d.h. es findet keine Reparatur statt. Erstaunlicherweise zeigte sich auch bei der Inkubation mit dem Topoisomerase II-Gift Etoposid, welches ursprünglich als Negativkontrolle gedacht war, der gleiche Reparatureffekt. Eine Hochregulation DNA-reparierender Enzyme ist unwahrscheinlich, da bei Inkubation mit dem DNA-methylierenden Agens N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) alle Zelllinien eine vergleichbare Menge an DNA-Schäden aufwiesen. Die nunmehr erzielten Ergebnisse eröffnen erstmals die Möglichkeit den Comet-Assay, unter Verwendung der unterschiedlichen TDP1-Klone, zum Auffinden von TDP1-Hemmstoffen einzusetzen.
In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die begonnene Analyse zur Genregulation durch den potentiellen Transkriptionsregulator PepR1 aus Lactobacillus delbrückii subsp. lactis DSM7290 fortgesetzt. PepR1 wurde aufgrund von Aminosäuresequenz-Ähnlichkeiten zu Proteinen der CcpASubfamilie, die zur GalR/LacI-Familie transkriptioneller Regulatoren gehört,identifiziert. Das pepR1-Gen ist divergierend zum pepQ-Gen angeordnet, welches für die Peptidase Q kodiert. Beide Gene besitzen eine gemeinsame intergene Region von 152 bp. Bei Promotorstudien im heterologen E. coli mit einem partiellen β-Galaktosidase-Gen (´lacZ) aus E. coli, welches mit einem Teilbereich der intergenen Region von pepR1 und pepQ sowie den ersten sechs Kodons des pepQ-Gens fusioniert wurde, erhöhte die Anwesenheit von PepR1 in trans die gemessene Aktivität des β-Galaktosidase-Fusionskonstruktes um einen Faktor von 1,95; während zwei im cre-Operator mutierte Varianten desselben Promotors nur 1,26- bzw. 1,21-fach erhöhte Aktivitäten zeigten. Analog ausgeführte Analysen mit den ebenfalls cre-ähnliche Elemente enthaltenden Promotorbereichen der Peptidasegene pepI und pepX ließen keine signifikante Beeinflussung der Expression der Reporterkonstrukte durch PepR1 erkennen. Bandshift-Analysen mit gereinigten PepR1-Protein und dem nicht modifizierten pepQ-Promotorfragment sowie einer Variante mit einem in zwei Basenpaaren mutierten cre-Operator zeigten die vollständige Retardierung beider DNA-Fragmente. Diese Resultate konnten die 14 bp palindromische cre-Sequenz als den cis-aktiven Operator für die Wirkung des DNA-bindenden Regulators PepR1 bestätigen. Die CcpA-äquivalente Funktion von PepR1 aus Lb. delbrückii subsp. lactis als pleiotroper Regulator wurde durch die partielle Komplementation einer ccpA-Mutation von Staphylococcus xylosus C2a durch das pepR1-Gen von Lactobacillus delbrückii subsp. lactis nachgewiesen. In der durch das plasmidkodiert vorliegende pepR1-Gen komplementierten ccpA-Mutante von Staphylococcus xylosus C2a war die Zucker-vermittelte Repression der α-Gluko-sidase in Gegenwart von Glukose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zum Wildtyp fast komplett wiederhergestellt. Die autogene Regulation von pepR1 wurde in E. coli durch die parallele Expression des mit dem promotorlosen ´lacZ-Gen translational fusionierten pepR1-Promotors und dem unter der Kontrolle des eigenen bzw. des E. coli lac-Promotors exprimierten PepR1 gezeigt. Die Anwesenheit von PepR1 in trans reprimierte in beiden Fällen die Aktivität des PpepR1-´lacZ-Reporterkonstruktes um einen Faktor von zwei. Die Transkripte der Peptidasegene pepI, pepQ, pepX und des pepR1-Gens wurden parallel zur Bestimmung der zugehörigen Aktivitäten der Peptidasen I, Q, und X über den Wachstumsverlauf von in Glukose oder Laktose wachsenden Zellen von Lb. delbrückii subsp. lactis verfolgt. Beim Wachstum mit Glukose war die PepQ-Aktivität gegenüber Laktose durchschnittlich um einen Faktor von 1,8 erhöht, die Menge an pepQ-mRNA korrelierte mit den Aktivitäten. Die Aktivitäten der Pep I und der Pep X waren bei in Laktose kultivierten Zellen leicht erhöht, sie zeigten jedoch Wachstumsphasen-abhängige Modulationen bei den Aktivitäten sowie Abweichungen bei der Korrelation von enzymatischer Aktivität zur Menge an spezifischer mRNA. Die Menge an pepR1-spezifischer mRNA variierte Wachstums-phasenabhängig sowohl bei der Glukose- als auch der Laktose-Kultur mit einem Faktor von zwei bis drei. Die lac-Region von Lactobacillus delbrückii subsp. lactis DSM7290 wurde kloniert, sequenziert und partiell charakterisiert. Durch den Vergleich mit DNA-Sequenzdaten von bekannten lac-Genen anderer Milchsäurebakterien konnten drei offene Leserahmen ermittelt werden. Das lacP-Gen (1881 bp), dessen unvollständiger 5´-Genabschnitt durch Inverse PCR komplettiert wurde, kodiert für eine Permease. Drei Basenpaare stromabwärts von lacP beginnt das Gen lacZ (3024 bp) für die β-Galaktosidase, auf die in gleicher Leserichtung 51 bp stromabwärts, das an seinem 3´-Ende nur unvollständig vorliegende lacR´ folgt. Northern-Blot-Analysen konnten zeigen, daß lacP und lacZ (sowie vermutlich auch lacR´) bei Wachstum von Lb. delbrückii subsp. lactis DSM7290 in Medium mit dem Zucker Laktose als mRNA von circa 6,15 kb Größe gemeinsam transkribiert werden. Die durch CcpA/PepR1-vermittelte Kontrolle über cre-Operatoren des lac-Promotors konnte mit zwei Translationsfusionen von Plac mit dem ´lacZ aus E. coli in S. xylosus lac- bzw. lac- und ccpA-Mutanten gezeigt werden.
Da Polyphenole als gesund angesehen werden, ist es Ziel dieser Arbeit, ihre Gehalte in Fruchtsäften zu erhöhen. Dies beinhaltet zum einen das Auffinden polyphenolreicher Apfel- und Beerenobstsorten als geeignete Rohware. Gleichzeitig entsteht dabei ein Datensatz über sortenreine Apfel- und Beerenobstsäfte, der die RSK-Werte ergänzt. Zum anderen sind Wege zur Minimierung von Verarbeitungsverlusten durch gezielte Studien zur Qualitätssteigerung des Endproduktes Fruchtsaft wichtig. Die im Screening untersuchten sortenreinen Mostapfelsäfte aus drei Jahrgängen zeigen sehr hohe Gesamtphenolgehalte (GP) und antioxidative Kapazitäten (aK), die die Gehalte von Tafeläpfeln übersteigen. Sorten wie Bittenfelder und Weißer Trierer Weinapfel erreichen aK von Rotwein. Beerenobstsäfte sind reicher an Antioxidantien als Apfelsäfte. Innerhalb der Arten konnten besonders antioxidantienreiche Sorten gefunden werden. Bezogen auf die aK lautet die Reihenfolge: Tafelapfel < Mostapfel <= Erdbeere < Himbeere = Brombeere < Cranberry < Heidelbeere < Johannisbeere = Boysenberry < Aronia. Darüber hinaus sind erfolgreich Extraktions- und Analysemethoden zur Bestimmung der verschiedenen Formen von Ellagsäure entwickelt und zur Untersuchung von Erdbeeren und Himbeeren eingesetzt worden. Die Gesamtellagsäuregehalte von Himbeeren übersteigen bisher beschriebene Gehalte deutlich. Darüber hinaus sind Äpfel in die Gewebezonen aufgeteilt und auf Antioxidantien untersucht worden. Dies hat ergeben, dass die Quercetine (Q) fast ausschließlich in der Schale vorhanden sind und die Dihydrochalkone (DHC) größtenteils im Kerngehäuse. Die Phenolcarbonsäuren (PC) kommen ebenso wie die Flavanole (F) in allen Gewebezonen vor. Gerade die schlecht wasserlöslichen DHC und Q, die an den festen Bestandteilen der Frucht sitzen, gehen schlecht in den Saft über. Im Rahmen der Apfelverarbeitungsstudien sind Probleme bei der Probenahme und Extraktion erkannt und behoben worden. Die durchgeführten Verarbeitungsstudien haben ergeben, dass Prozesse zur Erhöhung des Transfers von DHC und Q wie etwa eine längere Maischestandzeit zu einem Verlust von F und PC führen. Dagegen verhindern Maßnahmen zum Schutz vor Oxidation, wie eine zusätzliche KZE des Saftes nach dem Pressen, die Extraktion der DHC und Q. Eine Steigerung des Polyphenolgehaltes kann jedoch durch eine Nachextraktion erreicht werden, wobei die Supratonmaschine keinen Vorteil bringt. Dieser Nachextraktsaft von polyphenolreichen Sorten kann darüber hinaus zur Qualitätssteigerung von einfacheren (Tafel)Apfelsäften eingesetzt werden. Die besten Ergebnisse des Übergangs der Polyphenole von der Frucht in das Getränk konnten bei der Herstellung eines Ganzfruchtproduktes erzielt werden. Selbst nach Verdünnung auf Nektarstärke sind mehr Polyphenole im Getränk enthalten als in einem vergleichbaren Saft. Lagerungsversuche über ein Jahr hinweg zeigen, dass sich Bohnapfelsaft und Mehrfruchtsaft sehr unterschiedlich verhalten. Während der untersuchte Bohnapfelsaft sich im Bezug auf Antioxidantien kaum über die Lagerzeit verändert, nehmen die Anthocyane des Mehrfruchtsaftes schon im ersten Lagermonat deutlich ab. Dagegen verschlechtert sich der Bohnapfelsaft sensorisch schnell während der Mehrfruchtsaft noch nach einem Jahr geschmeckt hat. Dies zeigt die Wichtigkeit sensorischer Untersuchungen bei solchen Studien. Aus polyphenolreichen Säften hergestellte Mehrfruchtsäfte (100% Saft) können als „Wellnessgetränke“ angesehen werden, da sie einen hohen gesundheitlichen Nutzen haben. Neue Rezepturen mit phenolreichen Ausgangssäften und optimierter Verarbeitung sollten weiter entwickelt werden.
Flavonoide des Apfels: Transport in Caco-2-Kolonzellen und Einfluss auf den Fremdstoffmetabolismus
(2005)
In Tierexperimenten wurde eine antikanzerogene Wirkung von Flavonoiden gegenüber Brust-, Dickdarm-, Magen, sowie Lungenkrebs festgestellt. [Boyer, 2004] Da der Krebsentstehung multifaktorielle Prozesse zu Grunde liegen, werden verschiedene Mechanismen diskutiert wie Flavonoide protektiv eingreifen können. Die genaue biologische Wirkung der Nahrungskomponenten und der humantherapeutische Nutzen ist aber weitgehend ungeklärt. Deshalb wurden in dieser Arbeit Flavonoide des Apfels auf die Wirkung des Fremdstoffmetabolismus im Kolon untersucht. Ziel dieser Arbeit war es Apfelsaftextrakt, der aus Äpfeln 2002 gewonnen wurde und ausgewählte Flavonoide, die in diesem Apfelsaft vorkommen auf ihre Wirkung auf den Fremdstoffmetabolismus und ihre Aufnahme in die Enterozyten zu untersuchen. In den Zytotxizitätsassays MTT-Test und Alamar-BlueTM-Test zeigten sowohl der Apfelsaftextrakt als auch die einzelnen Substanzen einen signifikanten, konzentrationsabhängigen Effekt. Vor allem das Disaccharid Rutin zeigt schon in geringen Konzentrationen starke zytotoxische Effekte. Diese könnte daran liegen, dass Rutin wie in den Transportassays gesehen sehr schlecht in die Zellen gelangt und deshalb im Medium stärker oxidiert werden kann, als die anderen Stoffe. Das Enzym CYP1A1 wurde durch den Apfelsaftextrakt und die Flavonoide Quercetin und Phloridzin leicht induziert. Dieser Effekt konnte auf mRNA, Proteinebene und bei der Aktivitätsmessung beobachtet werden. Diese Effekte sind im Vergleich zum potenten Induktor TCDD sehr gering, so dass diese für die in vivo-Situation nicht von belang sind. Sehr viel größer als die agonistische ist die antagonistische Wirkung von den Aglyka Quercetin, Phloretin und auch vom Apfelsaftextrakt. Diese Effekte konnten auch auf mRNA, Proteinebene und bei der Aktivitätsmessung des Enzyms gemessen werden. Quercetin zeigte sich als so starker Inhibitor, es konnte die TCDD-induzierte CYP1A1-Aktivität sogar um 99% bei einer Konzentration von 50µM im EROD-Assay zurückdrängen, wodurch die Flavonoide protektiv in die Krebsentstehung eingreifen können. Quercetin, Phloretin und der Apfelsaftextrakt AS02 erweisen sich als starke Antagonisten. Damit können Flavonoide des Apfels die metabolische Aktivierung chemischer Kanzerogene wie z. B. Benzo[a]pyren oder herterocyclischer, aromatischer Amine hemmen und eventuell auf diese Weise zur Verminderung des Darmkrebsrisikos beitragen.Interaktionen zwischen Flavonoiden und Fremdstofftransportern werden als möglicher Mechanismus diskutiert, der von großer Relevanz für den Einsatz von Flavonoiden als krebspräventative Stoffe. Mehrere Flavonoide wurden in den letzten Jahren gefunden, die den MRP-vermittelten Stofftransport in Tumorzellen modulieren können [Hooijberg, 1997]. MRP2 ist ein weiteres Enzym, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden. Es kann durch Quercetin und den Apfelsaftextrakt signifikant und konzentrations-abhängig in der Real Time PCR und auch im Western Blot induziert werden. Diese Induktion könnte an der Aktivierung des sogenannten Antioxidant Response Element liegen. ARE kann durch redox-aktive Substanzen aktiviert werden und kann die Induktion von Enzymen wie die NADPH Chinonoxidoreduktase, GSH, UGT1A6 und auch MRP2 bewirken. Die Induktion von MRP2 beruht wahrscheinlich auf der Redox-Aktivität der 3‘,4‘-Catechol-Struktur des Quercetins. Die Wirkung des Apfelsaftextraktes könnte an dem im Extrakt enthaltenen Quercetin und seinen Glykosiden, die durch die LPH und Glukosidasen in der Zelle in Quercetin gespalten werden können, liegen. Die Induktion des MRP2-Transporters hat einen Einfluß auf die intestinale Entgiftung und die Verteilung von Xenobiotika in den Darmkrebszellen. Zellschädigende Stoffe können so schneller aus der Zelle herausgeschleust werden und können nicht mehr toxisch wirken, ein chemopräventativer Effekt tritt ein. In Transportassays sollte die Aufnahme der Polyphenole in die Zellen untersucht werden. Bei den Substanzen war eine erleichterte Diffusion oder ein aktiver Transport nicht zu erwarten, was durch die Papp-Werte bestätigt wird. Quercetin gelangt wohl durch passive Diffusion in die Zellen, genau wie Phloretin, wobei Quercetin besser in die Zellen gelangt. Phloridzin gelangt schlechter in die Zellen hinein, allerdings kann man im UV-Spektrum eindeutig sehen, dass der Zucker des Phloridzins abgespalten wird, es entsteht aber kein Phloretin als Aglykon, sondern ein Phloretin-ähnlicher Stoff. Es könnte sich um ein Glucoronid handeln oder es könnte eine Methoxygruppe eingeführt sein, was allerdings mit dieser Methode nicht näher bestimmt werden konnte, sondern mit einer HPLC-MS. Rutin hat wegen des Disaccharides keine Affinität zur LPH oder zu dem Glucosetransporter SGLT1 und gelangt deshalb nur sehr schlecht bis gar nicht in die Zelle. Die Aglyka gelangen am besten in die Zelle, wo sie unter anderem ihre starken antagonistischen Effekte in Bezug auf CYP1A1 bewirken können.