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2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer als Gruppe 1 Kanzerogen eingestuft, obwohl die molekularen Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD bislang nicht vollständig geklärt werden konnten. TCDD zeigte im Tierversuch ein erhöhtes hepatokarzinogenes Potential an Ratten, und im Initiations-Promotions-Modell in der Rattenleber konnte TCDD eine starke tumorpromovierende Wirkung zugeschrieben werden. Eine Reihe von Studien zeigten sowohl in vivo als auch in vitro in unterschiedlichen Zellsystemen eine Hemmung des durch verschiedene Stimuli induzierten programmierten Zelltodes, der Apoptose durch TCDD. Diese antiapoptotische Wirkung wird als ein möglicher Mechanismus für die Tumorpromotion von TCDD diskutiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Mechanimus der Apoptose-Hemmung durch TCDD in Leberzellsystemen der Ratte und des Menschen untersucht werden. Außerdem sollte die Frage geklärt werden, ob die anti-apoptotische Wirkung dieses Fremdstoffes über den Arylhydrokarbon-Rezeptor (AhR) vermittelt wird. Die Aufklärung der bislang noch unbekannten molekularen Mechanismen der TCDDvermittelten Kanzerogenese könnte die Risikobewertung einer TCDD-Exposition des Menschen auf eine erheblich solidere Basis stellen als bisher. Es konnte sowohl in primären Rattenhepatozyten als auch in der humanen Hepatomzelllinie Huh-7 bestätigt werden, dass TCDD die durch UVC-Licht induzierte Apoptose hemmt. Dies wurde auf Ebene der DNS-Fragmentierung und an Hand morphologischer Veränderungen des Zellkerns gezeigt. In den Primärhepatozyten war der anti-apoptotische Effekt von TCDD abhängig von einer Aktivierung des AhR. Die Apoptose durch die beiden Proteinbiosynthese-Inhibitoren Ochratoxin A und Cycloheximid wurde im Gegensatz zur UVC-Licht-induzierten Apoptose nicht durch TCDD gehemmt. Dies lässt den Schluss zu, dass eventuell die Neusynthese eines durch den AhR induzierten Proteins für die Hemmung der Apoptose in diesen Zellen nötig ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass entgegen früherer Studien, eine Hemmung der Aktivität des Tumorsuppressors p53 vermutlich nicht für die Apoptosehemmung durch TCDD verantwortlich ist. TCDD-bedingte Änderungen in der Expression von an der Apoptose beteiligten Genen ließen die Vermutung zu, dass diese Substanz zu einer Aktivierung des anti226 apoptotischen Transkriptionsfaktors NF-κB führt. Dies würde letztendlich zu einer Hemmung der Caspase-abhängigen Apoptosewege führen. Es konnte dennoch keine Wirkung des Fremdstoffes auf die Charakteristiken der durch UVC-Licht induzierten Caspasen-abhängigen Apoptose beobachtet werden. Weder wurden die proteolytische Aktivierung, noch die katalytische Aktivität von Caspasen oder die Spaltung von Caspasensubstraten durch TCDD moduliert. Daher wurde angenommen, dass TCDD im Signalweg der Apoptose zwischen der Caspasenaktivität und der apoptotischen DNS-Fragmentierung wirken müsste. Auf Grund dieser Hypothese wurde der Einfluss der Testsubstanz auf die Charakteristiken apoptotischer Nukleasen untersucht. Weder konnte eine verringerte Proteinmenge an Endonuklease G oder Caspase-aktivierter DNase (CAD) festgestellt werden, noch wurde die Aktivität rekombinant exprimierter CAD durch TCDD moduliert. In isolierten Zellkernen primärer Rattenhepatozyten konnte eine intrinsische Nukleaseaktivität identifiziert werden, die Calcium- und Magnesium-abhängig war und vermutlich durch nicht-physiologische Konzentrationen an monovalenten Ionen aktiviert wird. TCDD besaß eine hemmende Wirkung auf diese Nukleaseaktivität. Es erscheint plausibel, dass TCDD die apoptotische DNS-Fragmentierung über einen bisher unbekannten, AhR-abhängigen Mechanismus hemmt, und damit trotz einer Initiation der Apotpose die Integrität der DNS aufrecht erhält, um der Zelle die Möglichkeit zur Entgiftung von Aktivatoren des Fremdstoffmetabolismus zu geben. Diese Zellen könnten sich nach Entzug des pro-apoptotischen Stimulus letztendlich wieder erholen. Da solche Zellen DNS-Schäden tragen können, durch die sie unter normalen Umständen in die Apoptose getrieben worden wären, könnte dieser Mechanismus schließlich eine Rolle in der Tumorpromotion durch TCDD und verwandte Verbindungen spielen.
Ochratoxin A (OTA) ist ein nierentoxisches und -kanzerogenes Mykotoxin, das von verschiedenen Aspergillus- und Penicillium-Stämmen gebildet wird. Kontaminationen mit OTA sind vor allem in pflanzlichen Produkten wie Getreide und Getreideprodukte, Kaffee, Traubensaft und Wein, Bier, Nüsse, Gewürze aber auch in Fleisch nachweisbar. Verbraucher nehmen in Deutschland wöchentlich ca. 5 ng/kg KG OTA auf. In subakuten und subchronischen Studien wurde ausgeprägte Nierentoxizität gezeigt, zudem ist OTA als immunsuppressiv, teratogen, neurotoxisch und hepatokanzerogen beschrieben. Eine Beteiligung von OTA an der beim Menschen auftretenden endemischen Balkannephropathie (BEN) wird diskutiert. Der Mechanismus der kanzerogenen Wirkung von OTA ist noch immer unklar. Die in Studien zur Genotoxizität erhaltenen, widersprüchliche Resultate könnten möglicherweise auf sekundäre Mechanismen wie oxidativem Stress zurückzuführen sein. Die Generierung reaktiver Sauerstoffspezies und die Induktion von Lipidperoxidation wurde beobachtet, eine Reihe toxischer Effekte in vitro und in vivo war durch Gabe von Antioxidantien abgeschwächt. Mit verschiedenen Endpunkten (Nekrose, Wachstumshemmung, Apoptose) wurde in Zelllinien (V79, CV-1) und in primären proximalen Tubuluszellen der Ratte (PNZ) die Induktion von Zytotoxizität durch OTA untersucht. OTA zeigte in Kurzzeitinkubations-Experimenten (1 h) kein Potenzial, die Viabilität von Zelllinien und PNZ zu verringern. Nach 24stündiger Inkubation war nur in V79-Zellen die Membranintegrität (Trypanblauausschluss) beeinträchtigt. Eine starke Wachstumshemmung mit IC50-Werten um 2 µmol/L wurde in beiden verwendeten Zelllinien gemessen. Mittels eines immunchemischen Tests und der Durchflusszytometrie wurde bei Konzentrationen über 1 µmol/L OTA (24 h) die Induktion von Apoptose beobachtet. Die in CV-1-Zellen beobachteten Parameter für Zytotoxizität, insbesondere die durchflusszytometrischen Untersuchungen, zeigten, dass die Effekte in einem relativ eng begrenzten, µmolaren Konzentrationsbereich zu beobachten sind, also möglicherweise nicht spezifisch Nekrose oder Apoptose induziert wird. Zu den Mechanismen, über die unspezifisch Nekrose und Apoptose in Zellen induziert werden kann, gehören z.B. oxidativer Stress und DNA-Schädigung. Mit Hilfe des Comet-Assays wurde in den Zelllinien und PNZ die Induktion von (oxidativen) DNA-Schäden durch OTA untersucht. Die DNA-Basisschädigung war nur nach Kurzzeitinkubation (1h) mit sehr hohen OTA-Konzentrationen (> 500 µmol/L) in den Zelllinien bzw. nach 24 h in V79-Zellen erhöht. FPG-sensitive Stellen in der DNA wurden in allen verwendeten in vitro-Testsystemen nachgewiesen. Nach einstündiger Inkubation waren PNZ deutlich sensitiver gegenüber der Induktion von oxidativen DNA-Schäden (ca. Faktor 20) als die Zelllinien. Dies deutet darauf hin, dass die PNZ im Vergleich zu den Zelllinien stoffwechselbedingte Besonderheiten aufweisen, die die erhöhte Sensitivität bedingen. Nach 24stündiger Inkubation mit OTA lagen die Konzentrationen, die in den Zelllinien und den PNZ oxidative DNA-Schäden induzierten in einem vergleichbaren µmolaren Bereich. Der Verlust der erhöhten Sensitivität der PNZ könnte auf eine Umstellung des Stoffwechsels nach der insgesamt 48stündigen Kultivierung zurückzuführen sein. Das gemeinsame Auftreten von oxidativem Stress, Nierentoxizität und Zellproliferation könnten evtl. einen alternativen Mechanismus der Nierenkanzerogenität von OTA bilden. In Kooperation mit Dr. Turesky (NCTR, Jefferson, USA) wurde ein Tierversuch durchgeführt, in dem das DNA-schädigende Potenzial von OTA in Leber und Niere von Ratten, die über vier Wochen mit OTA behandelt worden waren, untersucht wurde. Die mit dem Comet-Assay in den Organen dieser Tiere gefundenen oxidativen DNA-Schäden, die grundsätzlich als prämutagenes Ereignis angesehen werden können, geben also möglicherweise einen ersten mechanistischen Hinweis auf die nierenkanzerogene Wirkung von OTA. Untermauert wird dies durch die beobachtete Abnahme des GSH-Gehaltes, die evtl. auf eine Depletion durch LPO-Produkte zurückzuführen ist. Nach 24stündiger Inkubation wurde eine Erhöhung des GSH-Gehaltes in den inkubierten CV-1-Zellen gemessen, die mit einer GSH-Neusynthese als Gegenreaktion zum oxidativen Stress begründet werden kann. Die in vitro Untersuchungen zeigen, dass die Konzentrationen, die in den Zellen oxidative DNA-Schäden verursachen, etwas niedriger sind (Faktor 5), als die Konzentrationen, die zytotoxische Effekte induzieren. Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass OTA über die Bildung oxidativer DNA-Schäden auch initiierendes Potenzial besitzt. In diesem Zusammenhang wäre zu klären, ob die in der Literatur beschriebene Proteinbiosynthesehemmung sich auf die antioxidative Abwehr in Zellen und Organismen auswirkt, so dass induzierte oxidative DNA-Schäden möglicherweise nicht mehr ausreichend repariert werden können und es so zur Tumorentstehung in vivo kommt.