Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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Cyclo-(PhAs)6 als Edukt für Übergangsmetallcyclopentadienyl-Komplexe mit Asn- und (PhAs)n-Liganden
(2002)
In der Chemie der (RAs)n-Heterocyclen, R = Alkyl, Aryl, hat sich cyclo-(PhAs)6 als besonders wertvolles Ausgangsmaterial für Komplexe mit Asn- bzw. (PhAs)n-Liganden bewährt. Die Cothermolyse von Hexaphenylcyclohexaarsan mit verschiedenen Übergangsmetallcyclopentadienyl-Komplexen liefert eine Reihe von neuartigen Verbindungen mit substituentenfreien As-Liganden und substituentenhaltigen As-Liganden, welche zum Teil in guten Ausbeuten hergestellt und in einigen Fällen durch eine Röntgenstrukturanalyse charakterisiert wurden. Bei den Komplexen mit As1- und As2-Liganden verdienen besondere Beachtung das dreiecksdodekaedrische [{Cp=Fe}4As4] sowie das aus der trigonalen Bipyramide bestehende [{CpRCo}3(µ3-As)2], dessen Spitzen von jeweils einem dreibindigen Arsenatom besetzt sind. Bei [{Cp-Co}3(µ3-As)2] ist das freie Elektronenpaar am Arsen noch zusätzlich durch ein {M(CO)5}-Fragment (M = Mo, W) komplexierbar ([{Cp-Co}3{(µ4-As)M(CO)5}2]). Verbindungen mit substituentenhaltigen As-Liganden sind in der Literatur nur vereinzelt beschrieben. Bei [{Cp=Rh}3(µ-CO)(AsPh2)As] wurde offensichtlich eine PhAs-Gruppe unter Ph-Wanderung in einen Ph2As-Liganden umgewandelt. Bemerkenswert ist der PhAs-Ligand in [{Cp=Rh(CO)}2(AsPh)W(CO)5], dessen freies Elektronenpaar noch zusätzlich an ein {W(CO)5}-Fragment koordiniert ist. In [{Cp=Rh}3(Rh(CO)2)(AsPh)(AsO)] sind ein PhAs- und AsO-Ligand realisiert.
eta3- und eta3:2-koordinierte Manganverbindungen wurden mit Alkinen umgesetzt - Übergangsmetallkomplexe unterschiedlicher Struktur und Koordination mit Vinylcyclopropan. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung der neu gebildeten Verbindungen. Die Reaktionen lieferten ein unerwartet breites Produktbild.
Lung cancer, mainly caused by tobacco smoke, is the leading cause of cancer mortality. Large efforts in prevention and cessation have reduced smoking rates in the U.S. and other countries. Nevertheless, since 1990, rates have remained constant and it is believed that most of those currently smoking (~25%) are addicted to nicotine, and therefore are unable to stop smoking. An alternative strategy to reduce lung cancer mortality is the development of chemopreventive mixtures used to reduce cancer risk. Before entering clinical trails, it is crucial to know the efficacy, toxicity and the molecular mechanism by which the active compounds prevent carcinogenesis. 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), N-nitrosonornicotine (NNN) and benzo[a]pyrene (B[a]P) are among the most carcinogenic compounds in tobacco smoke. All have been widely used as model carcinogens and their tumorigenic activities are well established. It is believed that formation of DNA adducts is a crucial step in carcinogenesis. NNK and NNN form 4-hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone releasing and methylating adducts, while B[a]P forms B[a]P-tetraol-releasing adducts. Different isothiocyanates (ITCs) are able to prevent NNK-, NNN- or B[a]P-induced tumor formation, but relative little is know about the mechanism of these preventive effects. In this thesis, the influence of different ITCs on adduct formation from NNK plus B[a]P and NNN were evaluated. Using an A/J mouse lung tumor model, it was first shown that the formation of HPB-releasing, O6-mG and B[a]P-tetraol-releasing adducts were not affected when NNK and B[a]P were given individually or in combination, of by gavage. Using the same model, the effects of different mixtures of PEITC and BITC, given by gavage or in the diet, on DNA adduct formation were evaluated. Dietary treatment with phenethyl isothiocyanate (PEITC) or PEITC plus benzyl isothiocyanate (BITC) reduced levels of HPB-releasing adducts by 40*50%. This is consistent with a previously shown 40% inhibition of tumor multiplicity for the same treatment. In the gavage treatments with ITCs it seemed that PEITC reduced HPB-releasing DNA adducts, while levels of BITC counteracted these effects. Levels of O6-mG were minimally affected by any of the treatments. Levels of B[a]P-tetraol releasing adducts were reduced by gavaged PEITC Summary Page XII and BITC, 120 h after the last carcinogen treatment, while dietary treatment had no effects. We then extended our investigation to F-344 rats by using a similar ITC treatment protocol as in the mouse model. NNK was given in the drinking water and B[a]P in diet. Dietary PEITC reduced the formation of HPB-releasing globin and DNA adducts in lung but not in liver, while levels of B[a]P-tetraol-releasing adducts were unaffected. Additionally, the effects of PEITC, 3-phenlypropyl isothiocyanate, and their N-acetylcystein conjugates in diet on adducts from NNN in drinking water were evaluated in rat esophageal DNA and globin. Using a protocol known to inhibit NNNinduced esophageal tumorigenesis, the levels of HPB-releasing adduct levels were unaffected by the ITCs treatment. The observations that dietary PEITC inhibited the formation of HPB-releasing DNA adducts only in mice where the control levels were above 1 fmol/µg DNA and adduct levels in rat lung were reduced to levels seen in liver, lead to the conclusion that in mice and rats, there are at least two activation pathway of NNK. One is PEITC-sensitive and responsible for the high adduct levels in lung and presumably also for higher carcinogenicity of NNK in lung. The other is PEITC-insensitive and responsible for the remaining adduct levels and tumorigenicity. In conclusion, our results demonstrated that the preventive mechanism by which ITCs inhibit carcinogenesis is only in part due to inhibition of DNA adduct formation and that other mechanisms are involved. There is a large body of evidence indicating that induction of apoptosis may be a mechanism by which ITCs prevent tumor formation, but further studies are required.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen Untersuchungen, die zu einem besseren Verständnis der Desoxyribonukleotid-Synthese, des Eisenstoffwechsels und der Differenzierung von Trypanosomen beitragen sollten. Aus diesem Grund umfasste die Arbeit drei Untersuchungsschwerpunkte. Die Ribonukleotid-Reduktase katalysiert die Umsetzung von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden und spielt somit eine wichtige Rolle bei der DNA- Synthese. Mit immunologischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die R1- Untereinheit des Enzyms in der schlanken und gedrungenen Blutform, sowie in der prozyklischen Insektenform vorhanden ist. Im Gegensatz dazu kommt die R2-Untereinheit nur in der proliferierenden schlanken Blutform und der prozyklischen Insektenform vor, nicht jedoch bei den im Zellarrest befindlichen gedrungenen Bluttrypanosomen. Mit molekularbiologischen Methoden konnte die mRNA der R1- und R2-Proteine in allen drei Entwicklungsstadien des Parasiten in etwa gleicher Menge nachgewiesen werden. Somit lässt sich folgern, dass die Ribonukleotid-Reduktase in T. brucei durch eine posttranskriptionale Regulation der R2-Untereinheit kontrolliert wird. Eine Regulation der Ribonukleotid-Reduktase im Zellzyklus von T. brucei konnte nicht nachgewiesen werden. Eisen stellt für Bluttrypanosomen einen essentiellen Wachstumsfaktor dar. Mit dem Eisenchelator Deferoxamin wurde der Einfluss einer Störung des Eisenhaushaltes auf Bluttrypanosomen untersucht. Deferoxamin-behandelte Trypanosomen zeigten gegen uber unbehandelten Parasiten eine deutlich geringere DNA- Syntheserate und Atmung. Die Wirkung des Chelators scheint jedoch nicht auf eine Komplexierung Enzym-gebundenen Eisens zurückzuführen zu sein. Die Behandlung der Holoenzyme (Ribonukleotid-Reduktase, Alternative Oxidase, Superoxid-Dismutase) mit Deferoxamin zeigte keinen Einfluss auf deren Aktivität. Die Wirkung des Chelators beruht vermutlich auf einer Depletierung intrazelären Eisens, das somit nicht mehr für den Einbau in neu-synthetisiertes Apoenzym zur Verfügung steht. Monomorphe Trypanosomenstämme haben im Gegensatz zu pleomorphen Stämmen die Fähigkeit verloren, sich zu differenzieren. Der Grund dafür ist vermutlich ein Defekt des cAMP-Signaltransduktionsweges. Im Rahmen der Arbeit konnte durch die Inkubation kulturadaptierter monomorpher Bluttrypanosomen mit dem membranpermeablen cAMP-Derivat 8-(4-Chlorphenylthio)-cAMP(pCPTcAMP) die Differenzierung der Parasiten zur gedrungenen Blutform erreicht werden. Die auf diese Weise erzeugte gedrungene Blutform besaß die Fähigkeit, sich zur prozyklischen Insektenform weiterzuentwickeln. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Unfähigkeit monomorpher Trypanosomen, sich zu differenzieren, in einem Defekt in der Perzeption oder Transduktion des Differenzierungssignals liegt, nicht aber in der anschließenden Signalweiterleitung.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von In-vitro-Testsystemen zur Erfassung hormoneller/antihormoneller Aktivität. Es gelang, vier neue, unterschiedliche In-vitro-Testsysteme zu etablieren und anhand bekannter Agonisten/Antagonisten zu validieren. Zunächst konnte ein Reportergenassay auf Basis des endogenen Reporters TRPM-2 aufgebaut werden. Für die Quantifizierung mittels kompetitiver RT-PCR wurde eine Deletionsmutante des zu amplifizierenden Gens als interner exogener Standard konstruiert. Dadurch wurden Untersuchungen von Testsubstanzen auf potentielle androgene/antiandrogene Aktivität in T-47D-Brustkrebszellen und auf estrogene/antiestrogene Aktivität in der Mammakarzinom-Zelllinie MCF-7 anhand eines einzigen Parameters ermöglicht. Analog zum TRPM-2-Assay wurde ein Testsystem zur kompetitiven Quantifizierung estrogenabhängiger pS2-Induktion in MCF-7-Zellen etabliert. Der TRPM-2-Assay in T-47D-Zellen wies mit den von Guth etablierten Transaktivierungsassays in COS-7- und T-47D-Luc-Zellen vergleichbare Sensitivität auf. Der von Guth etablierte Assay auf Basis des endogenen Reporters PSA erwies sich jedoch als deutlich präziser. Die weitergeführte Validierung des PSA-Assays zeigte andererseits aber deutlich geringere Selektivität gegenüber etablierten Antagonisten als in der Literatur beschrieben. (Guth, 2000; Rosenberg et al., 1998) In MCF-7-Zellen wurde für die endogenen Reporter TRPM-2 und pS2 mittels kompetitiver RT-PCR deutlich höhere Sensitivität erreicht als für bereits etablierte Assays. Ein Nachteil solcher endogener Reportergenassays auf RNA-Ebene ist die vergleichsweise aufwendige Versuchsdurchführung. in estrogensensitiven Transaktivierungsassays in Säugerzellen ermittelten, mitunter erhebliche Unterschiede. Im Hefe-Assay mit hER wurde beispielsweise für Daidzein keine estrogene, in niedrigen Konzentrationen dagegen antiestrogene Aktivität festgestellt. Für diese Differenzen werden säugerspezifische Mechanismen und Unterschiede bei der Fähigkeit zur Penetration der Zellwand diskutiert. (Dudley et al., 2000; Raun Andersen et al., 1999) In den von Guth etablierten Transaktivierungsassays (transienter Transaktivierungsassay in COS-7-Zellen, Transaktivierungsassay in stabilen T-47DLuc- Zellen) und dem endogenen PSA-Assay wurden in dieser Arbeit, ausgehend von zwei vorselektierten Leitstrukturen, die mittels online-Strukturdatenbank-Recherche identifizierten Benzophenon-Derivate Benzophenonimin, p,p'-Dimethylbenzophenon, Benzophenon-3,3',4,4'-tetracarbonsäuretetraundecylester (Selectophor() und Ketoprofen, die weiteren Pharmaka Imipramin und Ketoconazol, der natürliche Süßstoff aus Stevia rebaudiana Steviosid und sein Aglycon Steviol sowie 19- Nortestosteron und N-(2-Chlorethyl)-N-nitroso-carbamoyl-L-alanyl-17-nortestosteron (CNC-ala-NT, E173) auf potentielle androgene/antiandrogene Aktivität untersucht. (Guth, 2000) Um das Zusammenwirken estrogener Effekte von Verbindungen zu ermitteln, wurden Kombinationsexperimente im estrogensensitiven MCF-7-Luc-Reportergenassay durchgeführt. Ergebnisse aus Untersuchungen binärer Gemische repräsentativer Industriechemikalien bzw. dem Phytoestrogen Daidzein und dem physiologischen Hormon Estradiol zeigten rein additive Wirkungen. Insgesamt wurde mit dieser Arbeit ein Beitrag zur Identifizierung endokriner Disruptoren geleistet. Die in dieser Arbeit neu etablierte kompetitive RT-PCR auf endogene Reporter ermöglicht Untersuchungen früher Signale im natürlichen Hintergrund der Zelle. Bei der erweiterten Validierung des sensitiven PSA Assays jedoch wurde geringe Selektivität gegenüber etablierten Antagonisten festgestellt. Neue und bereits etablierte transgene Reportergenassays in Hefen und Säugerzellen ermöglichten effektive Untersuchungen potentiell hormonell aktiver Verbindungen. Die Anwendungsgebiete der sich ergänzenden Testsysteme liegen in der Charakterisierung möglicher toxikologisch relevanter Verbindungen wie auch in der Wirkstofffindung.
Wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Umwandlung des Akarizids Dicofol zu Dichlorbenzophenon (DCBP). Literaturhinweise führten zu dem begründeten Verdacht, dass keine metabolische Transformation, sondern ein UV-Licht- bzw. alkali-induzierter Zerfall der Substanz stattfindet. Diese Hypothese wurde durch Inkubation von aktiven und inaktivierten Lebermikrosomen mit Dicofol bestätigt. Sowohl in Gegenwart aktiver und inaktivierter Mikrosomen, als auch in Ansätzen ohne Mikrosomen wurden nahezu vergleichbare Mengen an gebildetem DCBP beobachtet. Eine Erhöhung der Inkubationstemperatur führte anschliessend zu einer Verstärkung der DCBP-Bildung. Die in dieser Arbeit bestimmte Aktivierungsenergie der Degradation von Dicofol zu DCBP in Gegenwart aktiver Mikrosomen stimmt mit der Aktivierungsenergie derselben Reaktion in wässriger Umgebung überein. Der Abbau von Dicofol zu DCBP ist wahrscheinlich auch im Organismus ein nicht-enzymatisch katalysierter Prozess. Im Anschluss wurde die UV-Licht-induzierte Reaktion von Dicofol zu DCBP untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit steigender Strahlungsdosis eine Verstärkung der DCBP-Bildung einhergeht, die in unpolaren Lösungsmitteln deutlich ausgeprägter ist als in polaren Lösungsmitteln. Es ist daher davon auszugehen, dass auch auf der wachsartigen, lipophilen Oberfläche von Zitrusfrüchten eine Umsetzung von Dicofol zu DCBP stattfindet. Die Abbaubarkeit von Dicofol in wässrigen Medien wurde durch Inkubation von Dicofol in methanolischen Lösungen unterschiedlichen Hydroxidionenkonzentrationen untersucht. Die Umsatzrate der Degradation stieg dabei mit zunehmender Hydroxidionenkonzentration und zunehmender Inkubationsdauer an. Die alkali-induzierte Reaktion wird wahrscheinlich durch Deprotonierung von Dicofol eingeleitet. Im Anschluss werden in der Literatur als mögliche Reaktionsmechanismen entweder eine Eliminierung von Chloroform unter DCBP-Bildung oder die Bildung eines 2,2-Dichlor-3,3-bis-(p-chlorphenyl)-oxirans diskutiert, aus dem DCBP und Dichlorcarben entstehen. In orientierenden Versuchen wurde Chloroform durch Headspace-GC annähernd äquimolar zur eingesetzten Dicofolmenge nachgewiesen, was auf ersteren Reaktionsmechanismus hindeutet. Bei der Untersuchung von Dicofol, DCBP und DCBH auf androgene bzw. antiandrogene Aktivität im Hefe-AR-Testsystem wurde nur DCBP eindeutig als antiandrogen aktiv erkannt. Die eingesetzten Hefezellen reagierten mit Anzeichen erheblicher Toxizität auf hohe Dicofol- bzw. DCBH-Konzentrationen, was eine Beurteilung ihrer antiandrogene Aktivität in diesem Testsystem erschwert. Die beobachtete antiandrogene Aktivität von Dicofol im transienten Transaktivierungssystem (COS-AR-Luc) beruht wahrscheinlich zum grössten Teil auf der alkali-induzierten Degradation von Dicofol zu DCBP im Inkubationsmedium. Die antiandrogene Aktivität von DCBH könnte auf die Oxidation von DCBH zu DCBP durch Luftsauerstoff oder auf enzymatische Katalyse zurückgeführt werden. Dicofol, DCBP und DCBH zeigten in der Mammakarzinomzelllinie MCF-7-Luc keine estrogene Aktivität. Auch Hefe-ER-Zellen reagierten auf die Exposition mit Dicofol und DCBH mit Anzeichen starker Toxizität. Die dargestellten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Reduktion der Alligatorpopulation des Lake Apopka nach Kontamination mit Dicofol und DDT nicht ausschliesslich auf estrogene Aktivität von DDT bzw. antiandrogene Aktivität von DDE zurückzuführen ist. Das aus Dicofol gebildete DCBP könnte einen wesentlichen Beitrag geleistet haben. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Einfluss des Metabolismus auf die antiandrogene Aktivität des Phenylharnstoffherbizids Linuron (N-3,4-Dichlorphenyl-N'-methoxy-N'-methyl-harnstoff). Linuron wird durch Abspaltung der N'-Substituenten und Auflösung der Harnstoffstruktur zu 3,4-Dichloranilin (DCA) abgebaut. Die Linuronmetabolite N-3,4-Dichlorphenyl-harnstoff (Linuron M1) und DCA waren in den eingesetzten Testsystemen weder androgen noch antiandrogen aktiv. Linuron und der primäre gebildete Metabolit N-3,4-Dichlorphenyl-N'-methyl-harnstoff (Linuron M2) zeigten keine androgene, aber antiandrogene Aktivität. Der Metabolit Linuron M2 zeigte im stabil transfizierten Hefe-AR-System mit Linuron vergleichbare Aktivität, schien aber im COS-AR-Luc-System etwas stärker antiandrogen aktiv zu sein. Im Zuge des metabolischen Abbaus von Linuron kommt es zu einer Inaktivierung hinsichtlich antiandrogener Aktivität. Da die Metabolisierung insgesamt jedoch langsam abläuft und der primär gebildete Metabolit Linuron M2 starke antiandrogene Aktivität zeigt, kann aufgrund der vorliegenden Daten eine Gefährdung exponierter Organismen nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren sollte die endokrine Aktivität von Xanthohumol, dem prenylierten Hauptchalcon des Hopfens, untersucht werden. Xanthohumol zeigte keine estrogene aber starke antiestrogene Aktivität im Hefe-ER-System. Es wurde keine androgene, aber antiandrogene Aktivität in den Testsystemen COS-AR-Luc und Hefe-AR beobachtet. Der Einsatz von Hopfen als Nahrungsergänzungsmittel sollte insbesondere wegen möglicher hoher Exposition mit Xanthohumol und dem potenten Estrogen 8-Prenylnaringenin kritisch auf potentielle endokrine Effekte in vivo überprüft werden. Mit der Untersuchung von Xanthohumol sollte auch festgestellt werden, ob die Einführung einer Vinylbindung zwischen Ketofunktion und Phenylrest in die Diarylketonstruktur Einfluss auf die antiandrogene Aktivität hat. Legt man die vorliegenden Ergebnisse zu Grunde, hat diese Strukturänderung keinen Einfluss. Dies sollte aber in nachfolgenden Untersuchungen mit geeigneten Substanzen weiter geprüft werden.
Untersuchungen zur Struktur und Funktion der lecithinabhängigen (R)-3-Hydroxybutyrat Dehydrogenase
(2002)
-Erste Differenzierung zwischen zwei Molekülmodellen. Welches dieser beiden Modelle beschreibt die strukturellen Besonderheiten der BDH besser? Dies wurde mit Hilfe von ESR und Fluoreszenz durchgeführt. Abstandsbestimmungen wurden mittels ESR-Simulationen durchgeführt. -Vergleich von BDH aus menschlichem Herz und Rinderherz. -Untersuchnugen zur C-terminalen Domäne.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der wirkmechanistischen Untersuchung substituierter Pteridine im Hinblick auf die Beeinflussung zentraler Regulationswege der Proliferation, der Apoptose und des Zytoskeletts. Im Besonderen sollte die Interaktion mit dem mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK)- bzw. dem Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)-Signalweg erforscht werden, nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die cAMP-erhöhende und Protein Kinase A (PKA)-aktivierende Eigenschaft der Pteridine nicht alleine für die wachstumshemmende Wirkung verantwortlich sein kann. Als zentrales Element der Proliferationskontrolle reguliert der MAPK-Signalweg die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors ELK1. Anhand eines Reportergen-Assays sollte die Beeinflussung der ELK1-Phosphorylierung durch in Position 6 substituierte Derivate der Stammverbindung E481 (7-Benzylamino-6-chloro-2-piperazino-4-pyrrolidino-pteridin) untersucht werden. Alle Substanzen sind hinsichtlich einer Hemmung der ELK1-Phosphorylierung weniger wirksam als die Leitsubstanz E481. Zusätzlich erfolgt nur bei E481 die Hemmung der ELK1-Phosphorylierung und die des Zellwachstums in einem vergleichbaren Konzentrationsbereich. Ferner sollte die Relevanz des PI3K-Signalweges für morphologische und wachstumsregulierende Wirkungen substituierter Pteridine bestimmt werden, nachdem für E481 bereits in der Vulvakarzinomzelllinie A431 eine Hemmung der PI3K und Zytoskelettveränderungen nachgewiesen werden konnte. Die Untersuchungen ergaben, dass die PI3K als genereller Vermittler der wachstumshemmenden Eigenschaft substituierter Pteridine ausgeschlossen werden kann. Auch die morphologischen Effekte durch E481 scheinen nicht PI3K-vermittelt zu sein. Ein wesentlicher Schwerpunkt der Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob die Hemmung der PI3K in A431 Zellen durch E481 eine Rolle spielt für die Arretierung im Zellzyklus und die Apoptoseinduktion. Diese Wirkungen können über den PI3K-Effektor PKB an das nachgeschaltete Signalelement Glycogen Synthase Kinase 3beta (GSK3b) und über das proapoptotisch wirkende BAD vermittelt werden, die allerdings zusätzlich mit dem PKA-Signalweg interagieren. Für die GSK3beta kann trotz einer verminderten PKB-Phosphorylierung keine verminderte Phosphorylierung festgestellt werden, was möglicherweise durch die gleichzeitig aktivierte PKA verursacht wird, die ebenfalls die GSK3beta phosphorylieren kann. Die Untersuchungen der BAD-Phosphorylierung deuten ab einer 18-stündigen E481-Inkubation eine verminderte PKA-abhängige Phosphorylierung an und lassen zudem eine verminderte PKB-abhängige Phosphorylierung vermuten. Möglicherweise trägt dies zu der E481-vermittelten Apoptoseinduktion in A431 Zellen bei. Ferner zeichnet sich nach 24-stündiger Inkubation mit E481 konzentrationsabhängig eine verringerte Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins pRb (Retinoblastoma) ab, was vermutlich wesentlich zum G1-Arrest beiträgt. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der E481-vermittelten Paxillinlokalisation sollten mögliche Wechselwirkungen zwischen dem cAMP-Signalweg und den morphologischen Veränderungen aufdecken. Es zeigt sich, dass eine E481 bedingte Abrundung der Zellen mit einer Paxillinabwanderung von der Plasmamembran einhergeht. Dieser Prozess findet unter Beteiligung einer Phosphatase statt- und ist nicht PKA-, vielleicht aber cAMP-vermittelt. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass der Wirkmechanismus substituierter Pteridine, insbesondere von E481, wesentlich komplexer ist als bislang vermutet. Zusätzlich zu der potenten Hemmung der Phosphodiesterase 4 greift E481 in eine Reihe zentraler Signalübertragungswege (MAPK-, PI3K/PKB-Signalweg) ein. Darüber hinaus interagiert E481 wirkungsvoll mit Signalelementen, welche die Integrität des Zytoskeletts gewährleisten. Hierbei scheinen PKA-unabhängige, möglicherweise aber cAMP-vermittelte Phosphataseinduktionen eine bedeutende Rolle zu spielen.
Im ersten Teil der Arbeit wurde die Cytotoxizität von drei Testsubstanzen (Digitonin, SDS und TritonX-100) mit Hilfe von vier verschiedenen Assays (NR, CV, LDH und WST) in der Rattenhepatozyten Primärkultur untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass WST und LDH aufgrund ihrer geringen Streuung und hohen Sensitivität die am besten geeigneten Methoden sind, um Cytotoxizität zu messen. Anschließend wurden mit diesen Assays die IC50-Konzentrationen von 16 Entwicklungssubstanzen der Firma Knoll AG bestimmt, um die ermittelten Konzentration in den folgenden Induktionsversuchen zu verwenden. Anschließend wurde der Einfluss der 16 Knoll-Substanzen auf Cytochrom P450-Isoenzyme in der Rattenhepatozyten Primärkultur untersucht. Dabei zeigte sich, das von den 16 Substanzen lediglich drei eine schwache CYP 1A-Induktion, die über EROD und MROD bestimmt wurde, bewirkten. Im Gegensatz dazu bewirkten acht der Knoll-Substanzen eine starke Induktion, im Vergleich zum Modellinduktor PB, der durch CYP1A und 2B katalysierten BROD-Aktivität. Dieses PB-ähnliche Induktionsmuster zeigte sich auch im Testosteron-Assay. Als herausragender Induktor, vom PB-Typ zeigte sich dabei die Substanz LU 135252. Die Konjugationsreaktionen (Phase II) mit den verschiedenen Substraten CDNB für GST und MUF, HOBI und PNP für verschiedene UGTs wurden durch die Knoll-Substanzen wenig beeinflusst. Im abschließenden Teil wurde der Einfluss von vier Knoll-Substanzen auf drei peroxisomale Enzyme (ACOX, CAT und Katalase) und auf Cytochrom P450 4A untersucht. Die beiden Substanzen 201640 und 418585 erhöhten die Aktivitäten aller vier Enzyme (wenn auch schwächer als die Modellinduktoren CLO und CIPRO) und könnten sich damit als Peroxisomen Proliferatoren erweisen. Der Vergleich von in vivo-Daten aus Toxizitätsstudien mit den in vitro-Daten zeigte eine sehr gute Übereinstimmung bei der qualitativen Einteilung der Substanzen in Nicht-Induktoren und Induktoren, des PB- bzw. des Clofibrat-Typs.
The development of recombinant DNA techniques opened a new era for protein production both in scientific research and industrial application. However, the purification of recombinant proteins is very often quite difficult and inefficient. Therefore, we tried to employ novel techniques for the expression and purification of three pharmacologically interesting proteins: the plant toxin gelonin; a fusion protein of gelonin and the extracellular domain of the subunit of the acetylcholine receptor (gelonin-AchR) and human neurotrophin 3 (hNT3). Recombinant gelonin, acetylcholine receptor a subunit and their fusion product, gelonin-AchR were constructed and expressed. The gelonin gene, a 753 bp polynucleotide was chemically synthesized by Ya-Wei Shi et al. and was kindly provided to us. The gene was first inserted into the vector pUC118 yielding pUC-gel. It was subsequently transferred into pET28a and pET-gel was expressed in E. coli. The product, gelonin was soluble and was purified in two steps showing a homogeneous band corresponding to 28 kD on SDS-PAGE. The expression of the extracellular domain of the -subunit of AchR always led to insoluble aggregates and even upon coexpression with the chaperonin GroESL, very small and hardly reproducible amounts of soluble material were formed, only. Therefore, recombinant AchR- gelonin was cloned and expressed in the same host. The corresponding fusion protein, gelonin-AchR, again formed aggregates and it had to be solubilized in 6 M Gu-HCl for further purification and refolding. The final product, however, was recognized by several monoclonal antibodies directed against the extracellular domain of the -subunit of AchR as well as a polyclonal serum against gelonin. Expression and purification of recombinant hNT3 was achieved by the use of a protein self-splicing system. Based on the reported hNT3 DNA sequence, a 380 bp fragment corresponding to a 14 kD protein was amplified from genomal DNA of human whole blood by PCR. The DNA fragment was cloned into the pTXB1 vector, which contains a DNA fragment of intein and chintin binding domain (CBD). A further construct, pJLA-hNT3, is temperature-inducible. Both constructs expressed the target protein, hNT3-intein-CBD in E. coli by the induction with IPTG or temperature, however, as aggregates. After denaturation and renaturation, the soluble fusion protein was slowly loaded on an affinity column of chitin beads. A 14 kD hNT3 could be isolated after cleavage with DTT either at 4 °C or 25 °C for 48 h. Based on nerve fiber out-growth of the dorsal root ganglia of chicken embryos, both, hNT-3-intein-CBD and hNT3 itself exhibit almost the same biological activity.