Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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The plasma membrane transporter SOS1 (SALT-OVERLY SENSITIVE1) is vital for plant survival under salt stress. SOS1 activity is tightly regulated, but little is known about the underlying mechanism. SOS1 contains a cytosolic, autoinhibitory C-terminal tail (abbreviated as SOS1 C-term), which is targeted by the protein kinase SOS2 to trigger its transport activity. Here, to identify additional binding proteins that regulate SOS1 activity, we synthesized the SOS1 C-term domain and used it as bait to probe Arabidopsis thaliana cell extracts. Several 14-3-3 proteins, which function in plant salt tolerance, specifically bound to and interacted with the SOS1 C-term. Compared to wild-type plants, when exposed to salt stress, Arabidopsis plants overexpressing SOS1 C-term showed improved salt tolerance, significantly reduced Na+ accumulation in leaves, reduced induction of the salt-responsive gene WRKY25, decreased soluble sugar, starch, and proline levels, less impaired inflorescence formation and increased biomass. It appears that overexpressing SOS1 C-term leads to the sequestration of inhibitory 14-3-3 proteins, allowing SOS1 to be more readily activated and leading to increased salt tolerance. We propose that the SOS1 C-term binds to previously unknown proteins such as 14-3-3 isoforms, thereby regulating salt tolerance. This finding uncovers another regulatory layer of the plant salt tolerance program
A building-block model reveals new insights into the biogenesis of yeast mitochondrial ribosomes
(2020)
Most of the mitochondrial proteins in yeast are encoded in the nuclear genome, get synthesized by cytosolic ribosomes and are imported via TOM and TIM23 into the matrix or other subcompartments of mitochondria. The mitochondrial DNA in yeast however also encodes a small set of 8 proteins from which most are hydrophobic membrane proteins and build core components of the OXPHOS complexes. They get synthesized by mitochondrial ribosomes which are descendants of bacterial ribosomes and still have some similarities to them. On the other hand, mitochondrial ribosomes experienced various structural and functional changes during evolution that specialized them for the synthesis of the mitochondrial encoded membrane proteins. The mitoribosome contains mitochondria-specific ribosomal proteins and replaced the bacterial 5S rRNA by mitochondria-specific proteins and rRNA extensions. Furthermore, the mitoribosome is tethered to the inner mitochondrial membrane to facilitate a co-translational insertion of newly synthesized proteins. Thus, also the assembly process of mitoribosomes differs from that of bacteria and is to date not well understood.
Therefore, the biogenesis of mitochondrial ribosomes in yeast should be investigated. To this end, a strain was generated in which the gene of the mitochondrial RNA-polymerase RPO41 is under control of an inducible GAL10-promoter. Since the scaffold of ribosomes is built by ribosomal RNAs, the depletion of the RNA-polymerase subsequently leads to a loss of mitochondrial ribosomes. Reinduction of Rpo41 initiates the assembly of new mitoribosomes, which makes this strain an attractive model to study mitoribosome biogenesis.
Initially, the effects of Rpo41 depletion on cellular and mitochondrial physiology was investigated. Upon Rpo41 depletion, growth on respiratory glycerol medium was inhibited. Furthermore, mitochondrial ribosomal 21S and 15S rRNA was diminished and mitochondrial translation was almost completely absent. Also, mitochondrial DNA was strongly reduced due to the fact that mtDNA replication requires RNA primers that get synthesized by Rpo41.
Next, the effect of reinduction of Rpo41 on mitochondria was tested. Time course experiments showed that mitochondrial translation can partially recover from 48h Rpo41 depletion within a timeframe of 4.5h. Sucrose gradient sedimentation experiments further showed that the mitoribosomal constitution was comparable to wildtype control samples during the time course of 4.5h of reinduction, suggesting that the ribosome assembly is not fundamentally altered in Gal-Rpo41 mitochondria. In addition, the depletion time was found to be critical for recovery of mitochondrial translation and mitochondrial RNA levels. It was observed that after 36h of Rpo41 depletion, the rRNA levels and mitochondrial translation recovered to almost 100%, but only within a time course of 10h.
Finally, mitochondria from Gal-Rpo41 cells isolated after different timepoints of reinduction were used to perform complexome profiling and the assembly of mitochondrial protein complexes was investigated. First, the steady state conditions and the assembly process of mitochondrial respiratory chain complexes were monitored. The individual respiratory chain complexes and the super-complexes of complex III, complex IV and complex V were observed. Furthermore, it was seen that they recovered from Rpo41 depletion within 4.5h of reinduction. Complexome profiles of the mitoribosomal small and large subunit discovered subcomplexes of mitoribosomal proteins that were assumed to form prior to their incorporation into assembly intermediates. The complexome profiles after reinduction indeed showed the formation of these subcomplexes before formation of the fully assembled subunit. In the mitochondrial LSU one subcomplex builds the membrane facing protuberance and a second subcomplex forms the central protuberance. In contrast to the preassembled subcomplexes, proteins that were involved in early assembly steps were exclusively found in the fully assembled subunit. Proteins that assemble at the periphery of the mitoribosome during intermediate and late assembly steps where found in soluble form suggesting a pool of unassembled proteins that supply assembly intermediates with proteins.
Taken together, the findings of this thesis suggest a so far unknow building-block model for mitoribosome assembly in which characteristic structures of the yeast mitochondrial ribosome form preassembled subcomplexes prior to their incorporation into the mitoribosome.
The handling of oxygen sensitive samples and growth of obligate anaerobic organisms
requires the stringent exclusion of oxygen, which is omnipresent in our normal atmospheric
environment. Anaerobic workstations (aka. Glove boxes) enable the handling of
oxygen sensitive samples during complex procedures, or the long-term incubation of
anaerobic organisms. Depending on the application requirements, commercial workstations
can cost up to 60.000 €. Here we present the complete build instructions for a highly
adaptive, Arduino based, anaerobic workstation for microbial cultivation and sample handling,
with features normally found only in high cost commercial solutions. This build can
automatically regulate humidity, H2 levels (as oxygen reductant), log the environmental
data and purge the airlock. It is built as compact as possible to allow it to fit into regular
growth chambers for full environmental control. In our experiments, oxygen levels during
the continuous growth of oxygen producing cyanobacteria, stayed under 0.03 % for 21 days
without needing user intervention. The modular Arduino controller allows for the easy
incorporation of additional regulation parameters, such as CO2 concentration or air pressure.
This paper provides researchers with a low cost, entry level workstation for anaerobic
sample handling with the flexibility to match their specific experimental needs.
Anisotropy of tracer-coupled networks is a hallmark in many brain regions. In the past, the topography of these networks was analyzed using various approaches, which focused on different aspects, e.g., position, tracer signal, or direction of coupled cells. Here, we developed a vector-based method to analyze the extent and preferential direction of tracer spreading. As a model region, we chose the lateral superior olive—a nucleus that exhibits specialized network topography. In acute slices, sulforhodamine 101-positive astrocytes were patch-clamped and dialyzed with the GJ-permeable tracer neurobiotin, which was subsequently labeled with avidin alexa fluor 488. A predetermined threshold was used to differentiate between tracer-coupled and tracer-uncoupled cells. Tracer extent was calculated from the vector means of tracer-coupled cells in four 90° sectors. We then computed the preferential direction using a rotating coordinate system and post hoc fitting of these results with a sinusoidal function. The new method allows for an objective analysis of tracer spreading that provides information about shape and orientation of GJ networks. We expect this approach to become a vital tool for the analysis of coupling anisotropy in many brain regions
For modeling approaches in systems biology, knowledge of the absolute abundances of cellular proteins is essential. One way to gain this knowledge is the use of quantification concatamers (QconCATs), which are synthetic proteins consisting of proteotypic peptides derived from the target proteins to be quantified. The QconCAT protein is labeled with a heavy isotope upon expression in E. coli and known amounts of the purified protein are spiked into a whole cell protein extract. Upon tryptic digestion, labeled and unlabeled peptides are released from the QconCAT and the native proteins, respectively, and both are quantified by LC-MS/MS. The labeled Q-peptides then serve as standards for determining the absolute quantity of the native peptides/proteins. Here we have applied the QconCAT approach to Chlamydomonas reinhardtii for the absolute quantification of the major proteins and protein complexes driving photosynthetic light reactions in the thylakoid membranes and carbon fixation in the pyrenoid. We found that with 25.2 attomol/cell the Rubisco large subunit makes up 6.6% of all proteins in a Chlamydomonas cell and with this exceeds the amount of the small subunit by a factor of 1.56. EPYC1, which links Rubisco to form the pyrenoid, is eight times less abundant than RBCS, and Rubisco activase is 32-times less abundant than RBCS. With 5.2 attomol/cell, photosystem II is the most abundant complex involved in the photosynthetic light reactions, followed by plastocyanin, photosystem I and the cytochrome b6/f complex, which range between 2.9 and 3.5 attomol/cell. The least abundant complex is the ATP synthase with 2 attomol/cell. While applying the QconCAT approach, we have been able to identify many potential pitfalls associated with this technique. We analyze and discuss these pitfalls in detail and provide an optimized workflow for future applications of this technique.
Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse genetischer Veränderungen in der Familie P006 von Piperacillin-resistenten Mutanten von S. pneumoniae R6. Jede der fünf Mutanten P106 bis P506 dieser Familie wurde aus dem jeweiligen Parentalstamm auf ansteigender Konzentration des lytischen ß-Lactams Piperacillin isoliert und zeichnete sich durch eine jeweils höhere minimale Hemmkonzentration (MHK) für Piperacillin aus (Laible et al., 1987). In Mutante P106 konnte mit CpoA bereits eine Resistenzdeterminante für Piperacillin identifiziert werden, welche nicht zu den klassischen Targets der ß-Lactamantibiotika, den Penicillin-Bindeproteinen (Pbp), zählt (Grebe et al., 1997). Die Mutanten P206 und P306 zeigten aufgrund von Mutationen in Pbp2b und Pbp2x eine höhere Resistenz gegen Piperacillin (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). In dieser Arbeit standen die Identifizierung und Charakterisierung der bisher unbekannten Resistenzdeterminante für Piperacillin in Mutante P406 und die Charakterisierung der bisher nur unzulänglich untersuchten Nicht-Pbp-Resistenzdeterminante CpoA in Mutante P106 im Mittelpunkt der Analysen. Im Fall der bereits identifizierten Resistenzdeterminante in Mutante P106 handelt es sich um das für eine Glykosyltransferase kodierende Gen cpoA. Die Herstellung einer cpoA-Deletionsmutante, sowie deren Charakterisierung, sollten zur Aufklärung des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus in P106 und der Funktion von CpoA beitragen. Durch die Herstellung der cpoA-Deletionsmutante und die Bestimmung der MHK für Piperacillin konnte gezeigt werden, daß ein Ausfall der durch CpoA katalysierten Reaktion einen Anstieg der MHK für Piperacillin in S. pneumoniae R6 bewirkt. Die eingehende phänotypische Charakterisierung zeigte, daß die cpoA-Deletionsmutante zudem eine reduzierte genetische Kompetenz, eine reduzierte Säuretoleranz, einen höheren Bedarf an zweiwertigen Mg-Ionen, eine längere Generationszeit und eine verlangsamte Autolyse im Vergleich zu S. pneumoniae R6 besitzt. Diese Beobachtungen, sowie die Ergebnisse einer Microarray-basierten, globalen Transkriptomanalyse lassen es unter Berücksichtigung der biochemischen Charakterisierung von CpoA (Edman et al., 2003) als wahrscheinlich erscheinen, daß CpoA an der Synthese von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, einem der Hauptglycolipide der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae beteiligt ist. Die Deletion von cpoA könnte demzufolge auch einen Effekt auf die Menge der Lipoteichonsäuren in der Zellwand von S. pneumoniae besitzen, da der Precursor von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, das α-Monoglucosyl-Diacylglycerin vermutlich den Lipidanker der Lipoteichonsäuren darstellt. Basierend auf dieser Annahme konnte ein Modell zur Funktion von CpoA erstellt werden, welches eine Erklärung des Resistenzmechanismus für Piperacillin in Mutante P106, bzw. in der cpoA-Deletionsmutante ermöglichen würde. In Mutante P406 konnten weitere Veränderungen der Pbps bereits ausgeschlossen werden (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse aller fünf Mutanten der Familie P006 konnten Gene identifiziert werden, deren Transkripte im Vergleich zu S. pneumoniae R6 nur in P406 signifikant veränderte Mengen aufwiesen: Unter diesen Genen befanden sich sechs Gene, welche aufgrund ihrer geclusterten Anordnung im Genom von S. pneumoniae als putative funktionelle Einheit (TCS11-Cluster) angesehen wurden. Diese Gene zeigten eine bis zu 22-fach erhöhte Transkriptmenge in Mutante P406. Zudem konnten nur in Mutante P406 von Genen des an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten lic1-Operons eine bis zu 7,9-fach höhere Transkriptmenge beobachtet werden. Keines der Genprodukte des TCS11-Clusters wurde bisher charakterisiert. Aufgrund von Blast- und Domänen-Analysen konnten den Genprodukten putative Funktionen zugeschrieben werden. Die Gene smp11A und smp11B kodieren für zwei putative Membranproteine von 63 und 64 Aminosäuren. Die Gene nbp11 und msp11 kodieren für die ATPase- und die Permease-Komponente eines putativen ABC-Transporters. kin11 und reg11 kodieren für die Histidin-Kinase und den Response-Regulator des bisher uncharakterisierten Zweikomponentensystems 11 (TCS11) in S. pneumoniae. Die Gene sind in der Reihenfolge smp11A, smp11B, nbp11, msp11, kin11 und reg11 auf dem Minus-Strang im Genom von S. pneumoniae lokalisiert. Die Deletion der Gene kin11 und reg11 des TCS11 in P406 führte zum Abfall der MHK für Piperacillin auf die MHK des Parentalstamms P306. Somit konnte die Beteiligung des TCS11 in S. pneumoniae an einem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin nachgewiesen werden. Die Deletion von nbp11 in P406 führte ebenfalls zum Abfall der MHK für Piperacillin, womit einerseits auch für Nbp11 eine Beteiligung an dem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin gezeigt werden konnte und andererseits eine transkriptionelle Regulation der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 durch das TCS11 vermutet werden konnte. Durch eine konstitutive, gemeinsame Überexpression der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 in S. pneumoniae R6 wurde gezeigt, daß die Überexpression dieser Gene hinreichend für eine Erhöhung der Resistenz gegen Piperacillin ist. Durch 5´-RACE-Analysen konnten die beiden Transkriptionsstartpunkte P11.1 und P11.2 im Bereich des TCS11-Clusters kartiert werden. P11.1 befindet sich 20bp upstream von smp11A und P11.2 befindet sich 441bp upstream von kin11 innerhalb von msp11. Eine Northern-Analyse und die Durchführung von PCR auf cDNA zeigte, daß die Gene des TCS11-Clusters in zwei überlappenden Transkriptionseinheiten transkribiert werden. Die Gene kin11 und reg11 sind zusammen mit einer downstream von reg11 liegenden Kopie des repetetiven Elements rupA im 11-2-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.2 inklusive des ungewöhnlich langen Leaders von 441bp transkribiert. smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 sind im 11-1-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.1 transkribiert. Die Zugehörigkeit von kin11 und reg11 zum 11-1-Operon konnte hingegegen bei den verwendeten Wachstumsbedingungen nicht gezeigt werden. Es konnte bereits gezeigt werden, daß phosphoryliertes Reg11 (Reg11-P) an die Promotor-Region von P11.1 bindet (Marciszewski, Diplomarbeit 2007). Die Bestimmung der Aktivität von P11.1 in S. pneumoniae R6, sowie in kin11-, reg11- und kin11reg11-Deletionsmutanten zeigte, daß P11.1 einer direkten, positiven Regulation durch das TCS11 unterliegt. Durch Sequenzvergleiche der Promotor-Region von P11.1 mit den DNA-Regionen putativer Promotoren von zum TCS11-Cluster ähnlich organisierten Clustern homologer Proteine in Genomen anderer Gram-positiver Bakterien konnten drei hoch konservierte Sequenzabschnitte identifiziert werden, von welchen gezeigt werden konnte, daß sie für die Bindung von Reg11-P in S. pneumoniae essentiell sind. Vermutlich stellt die Konsensus-Sequenz ATGACA(2)TGTCAT(8-9)GTGACA die DNA-Bindestelle von Reg11-P dar. Es konnten keine weiteren, zu 100 % konservierten Sequenzen dieser Art im Genom von S. pneumoniae gefunden werden. In EMSA-Assays mit weniger konservierten Sequenzen dieser Art konnte keine Bindung von Reg11-P beobachtet werden. Somit handelt es sich bei der Bindestelle an P11.1 vermutlich um die einzige Bindestelle von Reg11-P im Genom von S. pneumoniae. Von P11.2 konnte durch die Bestimmung der Promotor-Aktivität in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters gezeigt werden, daß auch dieser Promotor einer Regulation unterliegt, welche jedoch nicht durch die Bindung von Reg11-P, oder von unphosphoryliertem Reg11 vermittelt wird. Die Aktivität von P11.2 ist hierbei jedoch einerseits Abhängig von der Anwesenheit von Kin11 und andererseits entweder von der Funktion der Membranproteine Smp11A und Smp11B, oder von der durch Nbp11/Msp11 transportierten unbekannten Substanz. Die Bestimmung der Promotor-Aktivität von P11.2 in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters und die unterschiedlichen phänotypischen Effekte einer kin11-, reg11- und einer kin11reg11-Deletionsmutante zeigten, daß unphosphoryliertes Reg11 ebenfalls in der Lage sein muß, die Transkription von noch unbekannten Zielgenen durch Bindung an eine weitere, unbekannte DNA-Bindestelle zu regulieren. Sowohl durch die Deletion eines Großteils des 441nt langen Leaders des Transkripts des 11-2-Operons, als auch durch die Deletion zweier verschiedener Abschnitte des 3´-untranslatierten Bereichs dieses Transkripts konnte gezeigt werden, daß der 5´- und der 3´-untranslatierte Bereich an noch unbekannten regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die Deletion einzelner Gene des TCS11-Clusters, sowie die gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 bewirkten die gleichen phänotypischen Effekte wie die charakterisierte cpoA-Deletionsmutante. So konnte in Wachstumsexperimenten der gleiche Einfluß auf die Generationszeit, die maximale Zelldichte und die Autolyse, wie in der cpoA-Deletionsmutante, gezeigt werden. Die Microarray-basierte Transkriptomanalyse zweier Deletionsmutanten von Genen des TCS11-Clusters zeigte zudem, daß sich infolge dieser Deletionen größtenteils die Transkriptmengen solcher Gene ändern, welche auch auf eine Deletion von cpoA reagieren. Hierzu zählen neben zahlreichen Genen für Proteine unbekannter Funktion die Gene des Kompetenzregulons, des blp-Clusters, sowie des Cholinbindeproteins PcpA und der Subtilisin-artigen Proteinase PrtA. Die in Mutante P406 beobachteten höheren Transkriptmengen von an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten Genen des lic1-Operons konnten durch die Deletion von kin11reg11 revidiert werden. Die konstitutive gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11, sowie die Bestimmung der Aktivität des Promotors P1spr1149 des lic1-Operons zeigte, daß die Transkription der Gene des lic1-Operons indirekt von der Menge an Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 abhängt. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß das TCS11-Cluster und die Glykosyltransferase CpoA an den gleichen, oder zumindest an sich beeinflussenden, Membran-assoziierten Vorgängen beteiligt sind. Folglich konnte durch die molekulargenetische Charakterisierung des in ähnlicher genetischer Organisation in Gram-positiven Bakterien weit verbreiteten TCS11-Clusters erstmals ein Hinweis auf die putative physiologische Funktion des TCS11-Clusters in S. pneumoniae erhalten werden.
Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) wurden im Jahre 2002 in Bordetella‐Phagen entdeckt
und stellen eine einzigartige Klasse unter den Retroelementen dar. Durch einen speziellen „Copy‐and‐
Replace“ Mechanismus sind sie in der Lage ein bestimmtes Zielgen zu hypermutieren. Bei diesem
Mutagenic Homing‐Prozess wird die RNA der Templat‐Region (TR) durch die elementeigene reverse
Transkriptase (RT) transkribiert. Die dabei entstandene mutierte cDNA wird anschließend in die
variable Region (VR) des Zielgens inkorporiert und dieses somit diversifiziert. Hierbei steht der
experimentelle Nachweis für die Hypermutation durch die RT noch aus. Zudem spielt das akzessorische
Protein (Avd) eine weitere wichtige Rolle im Mutagenic Homing Prozess, wobei dessen tatsächliche
Funktion noch nicht charakterisiert werden konnte. Bis dato gibt es vor allem Analysen in Bezug auf
das Bordetella‐Phagen DGR, womit sich die Frage nach anderen Systemen und allgemeiner
Anwendbarkeit stellt. Daher war die Analyse des Nostoc sp. PCC 7120 DGR Hauptgegenstand dieser
Arbeit, wobei der Fokus auf der Untersuchung der reversen Transkripase (nRT), sowie der
Charakterisierung des akzessorischen Proteins (nAvd) aus dem Nostoc sp. PCC 7120 DGR lag.
Die nRT konnte überexprimiert werden, wobei sie nur teilweise löslich vorlag. Eine effektive
Aufreinigung der nRT konnte mit den hier getesteten Methoden nicht erzielt werden, sodass andere
Aufreinigungsmethoden erprobt werden müssen. Zudem war die nRT nicht lagerfähig, wodurch eine
regelmäßige neue Proteinpräparation nötig war. In Aktivitätsstudien konnten erste Hinweise auf eine
Aktivität der nRT erhalten werden. Dabei konnten die entstandenen Nukleinsäuren nicht nur
detektiert, sondern auch mittels analytischem Verdau als DNA identifiziert werden. Darüber hinaus
konnte die synthetisierte cDNA mittels PCR amplifiziert und die PCR‐Produkte anschließend
sequenziert werden. Hierbei wurden jedoch keine Adenin‐spezifischen oder sonstigen Mutationen
beobachtet. Somit konnte kein Nachweis für Hypermutation durch die RT erbracht werden. Bei
Untersuchungen bezüglich einer möglichen Interaktion zwischen nRT und nAvd konnte keine erhöhte
nRT‐Aktivität durch die nAvd festgestellt werden.
Die Untersuchungen der nAvd zeigten, dass diese Nukleinsäuren bindet. Hierbei waren Präferenzen
gegenüber verschiedenen Nukleinsäuren zu beobachten. Vor allem RNA/DNA‐Hybride zeigt die
höchste Affinität gegenüber der nAvd, während dsDNA eine höhere Affinität zur nAvd aufweist als
ssRNA. Zudem ist die nAvd in der Lage Nukleinsäuren zu hybridisieren. Hierbei hybridisiert sie ATreiche
DNA‐Moleküle von mittlerer Länge (48 bp) am effizientesten. Ein von der nAvd katalysierter
Strangaustausch konnte nicht beobachtet werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die nAvd selbst
bis 95 °C hitzestabil ist und im Anschluss an Hitzestress weiterhin Nukleinsäuren hybridisieren kann.
Darüber hinaus ist sie befähigt Nukleinsäuren unter Hitzestress zu stabilisieren. Diese Ergebnisse lassen
auf eine Rolle der nAvd als Lotse oder zur Stabilisierung von Nukleinsäuren schließen.
The cytosolic Fe65 adaptor protein family, consisting of Fe65, Fe65L1 and Fe65L2 is involved in many intracellular signaling pathways linking via its three interaction domains a continuously growing list of proteins by facilitating functional interactions. One of the most important binding partners of Fe65 family proteins is the amyloid precursor protein (APP), which plays an important role in Alzheimer Disease.
To gain deeper insights in the function of the ubiquitously expressed Fe65 and the brain enriched Fe65L1, the goal of my study was I) to analyze their putative synaptic function in vivo, II) to examine structural analysis focusing on a putative dimeric complex of Fe65, III) to consider the involvement of Fe65 in mediating LRP1 and APP intracellular trafficking in murine hippocampal neurons. By utilizing several behavioral analyses of Fe65 KO, Fe65L1 KO and Fe65/Fe65L1 DKO mice I could demonstrate that the Fe65 protein family is essential for learning and memory as well as grip strength and locomotor activity. Furthermore, immunohistological as well as protein biochemical analysis revealed that the Fe65 protein family is important for neuromuscular junction formation in the peripheral nervous system, which involves binding of APP and acting downstream of the APP signaling pathway. Via Co-immunoprecipitation analysis I could verify that Fe65 is capable to form dimers ex vivo, which exclusively occur in the cytosol and upon APP expression are shifted to membrane compartments forming trimeric complexes. The influence of the loss of Fe65 and/or Fe65L1 on APP and/or LRP1 transport characteristics in axons could not be verified, possibly conditioned by the compensatory effect of Fe65L2. However, I could demonstrate that LRP1 affects the APP transport independently of Fe65 by shifting APP into slower types of vesicles leading to changed processing and endocytosis of APP.
The outcome of my thesis advanced our understanding of the Fe65 protein family, especially its interplay with APP physiological function in synapse formation and synaptic plasticity.
Biological soil crusts (biocrusts) are a common element of the Queensland (Australia) dry savannah ecosystem and are composed of cyanobacteria, algae, lichens, bryophytes, fungi and heterotrophic bacteria. Here we report how the CO2 gas exchange of the cyanobacteria-dominated biocrust type from Boodjamulla National Park in the north Queensland Gulf Savannah responds to the pronounced climatic seasonality and on their quality as a carbon sink using a semi-automatic cuvette system. The dominant cyanobacteria are the filamentous species Symplocastrum purpurascens together with Scytonema sp. Metabolic activity was recorded between 1 July 2010 and 30 June 2011, during which CO2 exchange was only evident from November 2010 until mid-April 2011, representative of 23.6 % of the 1-year recording period. In November at the onset of the wet season, the first month (November) and the last month (April) of activity had pronounced respiratory loss of CO2. The metabolic active period accounted for 25 % of the wet season and of that period 48.6 % was net photosynthesis (NP) and 51.4 % dark respiration (DR). During the time of NP, net photosynthetic uptake of CO2 during daylight hours was reduced by 32.6 % due to water supersaturation. In total, the biocrust fixed 229.09 mmol CO2 m−2 yr−1, corresponding to an annual carbon gain of 2.75 g m−2 yr−1. Due to malfunction of the automatic cuvette system, data from September and October 2010 together with some days in November and December 2010 could not be analysed for NP and DR. Based on climatic and gas exchange data from November 2010, an estimated loss of 88 mmol CO2 m−2 was found for the 2 months, resulting in corrected annual rates of 143.1 mmol CO2 m−2 yr−1, equivalent to a carbon gain of 1.7 g m−2 yr−1. The bulk of the net photosynthetic activity occurred above a relative humidity of 42 %, indicating a suitable climatic combination of temperature, water availability and light intensity well above 200 µmol photons m−2 s−1 photosynthetic active radiation. The Boodjamulla biocrust exhibited high seasonal variability in CO2 gas exchange pattern, clearly divided into metabolically inactive winter months and active summer months. The metabolic active period commences with a period (of up to 3 months) of carbon loss, likely due to reestablishment of the crust structure and restoration of NP prior to about a 4-month period of net carbon gain. In the Gulf Savannah biocrust system, seasonality over the year investigated showed that only a minority of the year is actually suitable for biocrust growth and thus has a small window for potential contribution to soil organic matter.
TRP-Proteine sind integrale Membranproteine, die Untereinheiten von Kationenkanälen bilden, die z.B. an der Schmerz und Temperaturwahrnehmung, der Absorption von Mg2+ und Ca2+ im Darm und in der Niere oder für die Freisetzung von Entzündungsmediatoren in Immunzellen verantwortlich sind.
Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte TRPV6-Protein stellt einen hochselektiven Ca2+¬-Kanal dar, der für den tranzellulären Ca2+-Transport in Endothelzellen des Dünndarms und der Plazenta verantwortlich ist und für den bisher noch kein hochaffiner Agonist bekannt ist. Das niedrig exprimierte, integrale Membranprotein konnte ich erstmal im Rahmen meiner Diplomarbeit aus humaner Plazenta zusammen mit Annexin A2 und Cyclophilin B (CyPB) anreichern. Diese putative Interaktion zwischen dem Ionenkanal und CyPB wird im Rahmen meiner Doktorarbeit mit Coimmunpräzipitation, Saccharosedichtegradientenzentrifugation, Peptidblotanalyse und GST-Pulldown-Analysen untersucht. Hierbei kann die TRPV6-CyPB-Interaktion in Immunpräzipitationen mit unabhängigen Antikörpern bestätigt werden. Die Ergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation belegen die Existenz von TRPV6-Multimeren bzw. von TRPV6 enthaltenden Multiproteinkomplexen. Unter diesen Bedingungen ist allerdings keine CyPB-Assoziation mit dem TRPV6-Protein festzustellen. Das Einengen der Bindestelle von CyPB im TRPV6-Protein mittels Peptidblot- und GST-Pulldown-Analyse führt zur der potentiellen Bindungsstelle mit der minimalen Aminosäuresequenz Y66EDCKV71.
Meine Ergebnisse waren Ausgangspunkt für die funktionelle Charakterisierung der TRPV6-CyPB-Interaktion in Xenopus laevis Oozyten, die zeigt, dass CyPB den Ionenkanal aktiviert. Die Bindung zwischen beiden Proteinen ist offenbar wenig affin und scheint nur unter den gegebenen Solubilisierungsbedingungen nachweisbar.
Zur Erhaltung möglicher kalziumabhängiger Proteinbindungen wird die zuvor benutzte mehrstufige TRPV6-Affinitätschromatographie, bestehend aus einer CaM- und einer TRPV6-Antikörpersäule, durch eine einstufige Affinitätsreinigung ersetzt. Zur Solubilisierung und Isolierung des TRPV6-enthaltenden Proteinkomplexes eignen sich hierbei insbesondere die nichtionischen Detergenzien Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und Digitonin.
Zur Auftrennung und Untersuchung der isolierten TRPV6-Proteinkomplexe kann weiterhin eine zweidimensionale Blue Native-Gelelektrophorese (BN-PAGE) etabliert und die daraus isolierten Proteine massenspektrometrisch analysiert werden. Für die Auftrennung der TRPV6-Proteinkomplexe in der BN-PAGE eigenen sich ebenfalls am besten die nichtionischen Detergenzien DDM und Digitonin. Das TRPV6-Protein wird nach der nativen BN-PAGE als Bestandteil eines oder mehrerer Proteinkomplexe mit einem Molekulargewicht von 440 - 670 kDa detektiert.
Abschließend wird die Übertragbarkeit der für TRPV6 etablierten Vorgehensweise zur Isolierung von Membranproteinkomplexen auf andere TRP-Kanalproteine in verschiedenen Geweben gezeigt. So kann TRPV6 aus Mausplazenta und das TRPC6-Membranprotein aus murinen Mastzellen und Mauslungengewebe mittels Coimmunpräzipitation und Affinitätschromatographie isoliert und spezifisch detektiert werden.