Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Die Entwicklung von beta-Laktam-Resistenz in dem Pathogen Streptococcus pneumoniae (S. pneu-moniae) stellt einen komplexen Prozess dar, welcher auf einer Modifikation der Penicillin-Bindeproteine (PBP), der Targetstrukturen von beta-Laktam-Antibiotika beruht. PBP sind Membran-gebundene Enzyme, welche essentielle Reaktionen bei der bakteriellen Zellwand-Synthese katalysieren. Diese Proteine werden im Zuge der Resistenzentstehung so verändert, dass beta-Laktame nicht mehr oder nur noch mit geringer Affinität gebunden werden, das physiologische Substrat aber noch erkannt werden muß. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem PBP2x von S. pneumoniae, das als essentielles PBP und wichtigste primäre Resistenzdeterminante einen hohen Stellenwert bei der Entstehung von beta-Laktam-Resistenz in diesem Organismus einnimmt. Obwohl dieses PBP zu den am besten untersuchten PBP gehört, bleiben die Resistenzrelevanz einzelner Punktmutationen und die mit der Veränderung des Proteins einhergehenden physiologischen Folgen für die Zelle weitgehend unklar. Zentraler Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des Effekts von PBP2x-Mutationen auf die Resistenz, Funktionalität von PBP2x und Zellphysiologie im Kontext mit der sekundären Resistenzdeterminante PBP1a und den beiden Zwei-Komponenten-Systemen CiaRH, welches in die Cefotaxim-Resistenz, genetische Kompetenz und Virulenz involviert ist und ComDE, das die genetische Kompetenz reguliert. Besonderes Interesse galt dabei der Position Thr338, welche sich unmittelbar benachbart zum aktiven Serin befindet und in den meisten resistenten klinischen Isolaten zu Alanin, Prolin oder Glycin mutiert ist. Durch eine gerichtete Mutagenese dieser Position im Wildtyp R6 konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Thr338-Punktmutation einen selektionierbaren Resistenz-Phänotyp in vivo vermittelt, wobei abhängig von dem jeweiligen Austausch unterschiedliche Resistenzniveaus und Kreuzresistenzspektren zu beobachten waren. Abgesehen von einem nur moderaten Beitrag zur Resistenz, betraf eine solche Substitution offenbar auch die Funktionalität von PBP2x, was sich auf dramatische Art und Weise in Abwesenheit eines intakten CiaRH-Regulationssystems äußerte: Es kam zu Wachstumsdefekten, insbesondere einer verfrühten und verstärkten Autolyse, morphologischen Aberrationen und einer verminderten Lebensfähigkeit. Entgegen aller Erwartungen führte die Präsens eines Mosaik-PBP1a in dem genetischen Hintergrund der Thr338-Mutation nicht zu einem weiteren Anstieg der Resistenz, sondern bewirkte sogar einen leichten Abfall. Dennoch komplementierte das Mosaik-PBP1a die durch das Fehlen eines funktionsfähigen CiaRH-Systems hervorgerufenen Wachstumsdefizienzen. Der Vergleich zwischen dem PBP2x mit Thr338-Punktmutation und einem Mosaik-PBP2x deckte gravierende Unterschiede im Hinblick auf das Resistenzpotential und die physiologischen Auswirkungen auf. Anders als bei der PBP2x-Punktmutation waren bei dem Mosaik-PBP2x fast keine Wachstumseinbußen zu verzeichnen, wenn es mit einem inaktiven Zwei-Komponenten-System CiaRH kombiniert wurde, und die Anwesenheit eines Mosaik-PBP1a brachte eine starke Erhöhung der Cefotaxim-Resistenz mit sich. Beiden pbp2x-Allelen war jedoch gemeinsam, dass die Abwesenheit eines PBP1a massive Defekte im Wachstum zur Folge hatte. Alle diese Beobachtungen deuteten auf eine mögliche Interaktion zwischen PBP2x und PBP1a hin. Die Analyse der Zellwand einer Mutante mit zwei PBP2x-Aminosäureaustauschen, von denen einer in resistenten klinischen Stämmen anzutreffen ist, ergab eine biochemisch modifizierte Zellwand, in der bei einem fast gleichbleibenden Anteil an verzweigten Dimeren, Monomere erhöht, und lineare Dimere und Trimere reduziert waren. Diese Befunde ließen auf eine enzymatische Beeinträchtigung dieses PBP2x schließen. Ein von CiaRH ausgehender Effekt konnte nicht festgestellt werden. Eine Inaktivierung des für den Export des Kompetenz-stimulierenden Peptids CSP verantwortlichen ABC-Transporters ComAB in Kombination mit einem nicht-funktionellen CiaRH-System bewirkte im Wildtyp eine vollständige, in PBP2x-Punktmutanten eine nur teilweise Aufhebung der vorzeitigen stationären Phase-Autolyse. Darüber hinaus machte sich bei einem der PBP2x-Derivate, welches zusätzlich über eine Cefotaxim-Resistenz-vermittelnde Aminosäuresubstitution in CiaH verfügte, bei ciaR-Inaktivierung sowohl ein Verlust der CiaH- als auch eine partielle Einbuße der PBP2x-Resistenz bemerkbar, bei comAB-Inaktivierung hingegen aber ausschließlich ersteres. Hieraus konnte zum einen auf einen direkten Bezug des Lyse-Phänotyps zu der Kompetenz und der CiaRH-Resistenz zu ComAB geschlossen werden, zum anderen auf einen CiaRH-unabhängigen Einfluss von PBP2x auf die Kompetenz und Autolyse. Tatsächlich bestätigte eine Bestimmung der Transformationseffizienz von Mutanten mit verschiedenen Konstellationen aus niederaffinen und unmodifizierten PBP, dass das Kompetenzmuster bzw. -ausmaß von der jeweiligen PBP-Ausstattung moduliert wird. Auch eine Microarray-basierte globale Transkriptomanalyse dieser Mutanten sowie spontan resistenter Labormutanten mit PBP2x- und CiaH-Mutationen suggerierte eine von CiaRH-entkoppelte Einflussnahme der PBP auf die Kompetenz. Zudem zeugten die Transkriptionsmuster von einem vielschichtigen Regulationsnetzwerk der Resistenzentwicklung unter Beteiligung von Kompetenz, Bakteriocinproduktion, Virulenz, Metabolismus, Transportprozessen und Energiestatus, was möglicherweise eine indirekte Folge einer gestörten Zellwand- und Membranintegrität darstellt. Durch die Extraktion von intergenen Bereichen, sowie potentiellen neuen Resistenzdeterminanten bzw. Resistenz-unterstützenden Genen, wie den Gen-Clustern spr1545-spr1549 und spr0096-spr0110 oder den Genen des Purinstoffwechsels wurde die Basis für weiterführende Untersuchungen geschaffen. Die hier vorgestellten Daten demonstrieren, dass der Erwerb von beta-Laktam-Resistenz nicht nur von Vorteil ist, sondern auch physiologische Konsequenzen für die Zelle hat, die sie kompensiert, um ein möglichst stabiles Wachstum zu gewährleisten. Über die Zellwand-Zusammensetzung und Kompetenz konnte erstmalig eine Verbindung von PBP2x zu CiaRH hergestellt werden. Eine konkrete kompensatorische Wirkung dieses Regulons hinsichtlich PBP2x-Mutationen wurde mit der Repression der Kompetenzlyse ausfindig gemacht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde basierend auf einer früheren Veröffentlichung, in der eine Inaktivierung des Gens für das PBP2b von S. pneumoniae erfolglos blieb, erneut versucht, eine solche Mutante herzustellen. Obwohl lebensfähige Transformanten generiert werden konnten, war es nicht möglich eine pbp2b-Inaktivierungs- bzw. Deletionsmutante zu isolieren, sodass PBP2b in diesem Organismus weiterhin als essentielles Protein angesehen werden kann.
Phospho-regulation of the Shugoshin - Condensin interaction at the centromere in budding yeast
(2020)
Correct bioriented attachment of sister chromatids to the mitotic spindle is essential for chromosome segregation. In budding yeast, the conserved protein shugoshin (Sgo1) contributes to biorientation by recruiting the protein phosphatase PP2A-Rts1 and the condensin complex to centromeres. Using peptide prints, we identified a Serine-Rich Motif (SRM) of Sgo1 that mediates the interaction with condensin and is essential for centromeric condensin recruitment and the establishment of biorientation. We show that the interaction is regulated via phosphorylation within the SRM and we determined the phospho-sites using mass spectrometry. Analysis of the phosphomimic and phosphoresistant mutants revealed that SRM phosphorylation disrupts the shugoshin–condensin interaction. We present evidence that Mps1, a central kinase in the spindle assembly checkpoint, directly phosphorylates Sgo1 within the SRM to regulate the interaction with condensin and thereby condensin localization to centromeres. Our findings identify novel mechanisms that control shugoshin activity at the centromere in budding yeast.
I) Die Untersuchungen zum vakuolären Malat-Carrier AtTDT unterstützen die Annahme, dass seine Aktivität in den Schließzellen zum Öffnen und Schließen der Stomata beiträgt. Zudem erhöht wahrscheinlich die Aktivität von TDT in den Mesophyllzellen die Stomata-Dichte und den Stomata-Index. Im Rahmen einer osmotischen Anpassung vermittelt der Transporter eine Malat-Akkumulation, die in den TDT-Knockout-Mutanten beeinträchtigt ist und durch erhöhte Citrat-Gehalte kompensiert wird. Darüber hinaus beschleunigt TDT unter Kurztag-Bedingungen den Eintritt in die generative Phase. Eine Funktion von TDT in der Salztoleranz kann nach metabolischen und phänotypischen Analysen ausgeschlossen werden. II) Die tonoplastidären Monosaccharid-Transporter regulieren bei Kälte in Blättern nicht nur die Monosaccharid-Gehalte, sondern wirken auch positiv auf Photosynthese und Stärkegehalte. Das Ausschalten der TMT-Gene führt unter den gewählten Kältebedingungen zu einer erhöhten Synthese von Saccharose und zu einer gesteigerten Respirationsrate. Insbesondere unter Wassermangel wirkt sich die Aktivität der tonoplastidären Monosaccharid-Transporter positiv auf die Keimungsrate aus. III) Die Bestimmung von Zuckergehalten in Blättern indiziert, dass die tonoplastidären Transportproteine AtERD6.7 und BvIMP Glukose aus der Vakuole transportieren, während AtERD6.5 womöglich Fruktose aus der Vakuole transportiert. Als Transportmechanismus wird aufgrund der Homologie zu den GLUT-Proteinen eine erleichterte Diffusion angenommen. Die Aktivität der Carrier scheint insbesondere nach Kältephasen von Bedeutung zu sein, wenn vakuolär gespeicherte Zucker mobilisiert werden. ERD6.7 fördert gemäß den durchgeführten Keimungstests die Samen-Dormanz.
Das antioxidative Potenzial eines roten Mehrfruchtsaftes mit hohem Anthocyan-/Polyphenolanteil wurde in zwei humanen Interventionsstudien mit Biomarkern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort charakterisiert. Ergänzend wurden ein Mehrfruchtsaftextrakt (ME) und ausgewählte potentiell antioxidativ wirksame Mehrfruchtsaftinhaltsstoffe (Anthocyane) in in vitro-Experimenten untersucht. In einer Interventionsstudie nahmen 18 männliche Probanden nach einer 3-wöchigen Run-in-Phase über vier Wochen täglich 700 mL eines anthocyanreichen Mischfruchtsaftes (TEAC 19,1 mmol/L Trolox) auf. Anschließend folgte eine 3-wöchige Wash-out-Phase ohne Saftaufnahme. Neun der 18 Probanden nahmen zusätzlich an einer zweiten Interventionsstudie mit identischem Design teil, jedoch unter Verwendung eines Kontrollsaftes, in dem die phenolische Fraktion weitgehend technologisch entfernt wurde. Wöchentliche wurde Blut entnommen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schädigung, Lipidperoxidationsprodukte Malondialdehyd, Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen und Isoprostane (Urin), Glutathionspiegel/-status und DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors NFkappaB. Ergänzend wurden die Konzentrationen der Carotinoide und des alpha-Tocopherols in Plasma bestimmt. In den in vitro-Experimenten kam ein zweistufiges Inkubationsprotokoll in humanen Blut- bzw. Kolonzelllinien (Jurkat, Caco-2) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h bzw. 1 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Untersucht wurde neben der zellfreien Bestimmung der antioxidativen Kapazität (TEAC), die Modulation (oxidativer) DNA-Schädigung und des ROS-Levels in der Zelle. Die Ergebnisse der Interventionsstudie mit Mehrfruchtsaft zeigten eine signifikante Abnahme oxidativer DNA-Schäden (p< 0,0005), Zunahme des tGSH-Spiegels (p< 0,0005) und Anstieg des Glutathionstatus (p< 0,05) während der 4-wöchigen Saftaufnahme im Vergleich zu den 3-wöchigen Run-in-/Wash-out-Phasen. Eine signifikante Abnahme der Lipidperoxidation dagegen wurde nicht beobachtet. Es zeigte sich lediglich eine deutliche Tendenz zu einer Abnahme der Isoprostangehalte während der Saftaufnahme. Eine Verringerung der DNA-Bindungsaktivität von NFkappaB durch Saft war nicht nachweisbar. Die Plasmagehalte der Carotinoide und des alpha-Tocopherols, als mögliche und bekanntermaßen antioxidativ wirksame Substanzen, blieben während aller Interventionsphasen unverändert. Für die beobachteten protektiven Effekte scheinen die phenolischen Substanzen des Mehrfruchtsaftes verantwortlich zu sein, da in der Studie mit Kontrollsaft keine Reduktion von oxidativen Schäden nachgewiesen werden konnte. Der ME zeigte eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (4,64 mM Trolox) im zellfreien Testsystem. Der zelluläre ROS-Level wurde in vitro durch den Extrakt (bei 100-250 µg/mL) signifikant verringert (p< 0,05). Oxidative DNA-Schäden in Jurkat-/Caco-2-Zellen wurden durch den Extrakt nicht signifikant vermindert; es zeigte sich lediglich die Tendenz einer protektiven Wirkung (bei 10 µg/mL). Von den vergleichend in Jurkat-Zellen getesteten Anthocyanidinen zeigten Malvidin und Delphinidin nach 24 h Inkubation kein Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden. Bei einstündiger Antioxidansbehandlung dagegen, konnte ein einheitlicher Trend einer protektiven Modulation (bei 10-100 µM) beobachtet werden. Zusammenfassend besitzt der flavonoid/polyphenolreiche rote Mischfruchtsaft ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung in gesunden Probanden. Dieses geht, begründet aus den Ergebnissen der Saft-/Kontrollsaftstudie, vermutlich auf die phenolische Fraktion des Saftes zurück. Aufgrund der in vitro erhaltenen Daten kann die antioxidative Wirksamkeit jedoch nicht maßgeblich auf die untersuchte Substanzgruppe der Anthocyane zurückgeführt werden. Dies legt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/Stoffgruppen einen Beitrag zu der antioxidativen Wirksamkeit leisten.
The structural integrity of synaptic connections critically depends on the interaction between synaptic cell adhesion molecules (CAMs) and the underlying actin and microtubule cytoskeleton. This interaction is mediated by giant Ankyrins, that act as specialized adaptors to establish and maintain axonal and synaptic compartments. In Drosophila, two giant isoforms of Ankyrin2 (Ank2) control synapse stability and organization at the larval neuromuscular junction (NMJ). Both Ank2-L and Ank2-XL are highly abundant in motoneuron axons and within the presynaptic terminal, where they control synaptic CAMs distribution and organization of microtubules. Here, we address the role of the conserved N-terminal ankyrin repeat domain (ARD) for subcellular localization and function of these giant Ankyrins in vivo. We used a P[acman] based rescue approach to generate deletions of ARD subdomains, that contain putative binding sites of interacting transmembrane proteins. We show that specific subdomains control synaptic but not axonal localization of Ank2-L. These domains contain binding sites to L1-family member CAMs, and we demonstrate that these regions are necessary for the organization of synaptic CAMs and for the control of synaptic stability. In contrast, presynaptic Ank2-XL localization only partially depends on the ARD but strictly requires the presynaptic presence of Ank2-L demonstrating a critical co-dependence of the two isoforms at the NMJ. Ank2-XL dependent control of microtubule organization correlates with presynaptic abundance of the protein and is thus only partially affected by ARD deletions. Together, our data provides novel insights into the synaptic targeting of giant Ankyrins with relevance for the control of synaptic plasticity and maintenance.
Heterocystous Cyanobacteria of the genus Nodularia form major blooms in brackish waters, while terrestrial Nostoc species occur worldwide, often associated in biological soil crusts. Both genera, by virtue of their ability to fix N2 and conduct oxygenic photosynthesis, contribute significantly to global primary productivity. Select Nostoc and Nodularia species produce the hepatotoxin nodularin and whether its production will change under climate change conditions needs to be assessed. In light of this, the effects of elevated atmospheric CO2 availability on growth, carbon and N2 fixation as well as nodularin production were investigated in toxin and non-toxin producing species of both genera. Results highlighted the following:
Biomass and volume specific biological nitrogen fixation (BNF) rates were respectively almost six and 17 fold higher in the aquatic Nodularia species compared to the terrestrial Nostoc species tested, under elevated CO2 conditions.
There was a direct correlation between elevated CO2 and decreased dry weight specific cellular nodularin content in a diazotrophically grown terrestrial Nostoc species, and the aquatic Nodularia species, regardless of nitrogen availability.
Elevated atmospheric CO2 levels were correlated to a reduction in biomass specific BNF rates in non-toxic Nodularia species.
Nodularin producers exhibited stronger stimulation of net photosynthesis rates (NP) and growth (more positive Cohen’s d) and less stimulation of dark respiration and BNF per volume compared to non-nodularin producers under elevated CO2 levels.
This study is the first to provide information on NP and nodularin production under elevated atmospheric CO2 levels for Nodularia and Nostoc species under nitrogen replete and diazotrophic conditions.
In this study, 27 marine bacteria were screened for production of bioactive metabolites. Two strains from the surface of the soft coral Sinularia polydactyla, collected from the Red Sea, and three strains from different habitats in the North Sea were selected as a promising candidates for isolation of antimicrobial substances. A total of 50 compounds were isolated from the selected bacterial strains. From these metabolites 25 substances were known from natural sources, 10 substances were known as synthetic chemical and herein are reported as new natural products, and 13 metabolites are new. Two substances are still under elucidation. All new compounds were chemically and biologically characterized. Pseudoalteromonas sp. T268 produced simple phenol and oxindole derivatives. Production of homogentisic acid and WZ 268S-6 from this bacteria was affected by the salinity stress. WZ 268S-6 shows antimicrobial and cytotoxic activities. Its target is still unclear. Isolation of isatin from this strain points out for the possibility of using this substance as a chemotaxonomical marker for Alteromonas-like bacteria. A large number of nitro-substituted aromatic compounds were isolated from both Salegentibacter sp. T436 and Vibrio sp. WMBA1-4. They may be derived from metabolism of phenylalanine or tyrosine. From Salegentibacter sp. T436, 24 compounds were isolated, of which four compounds are new and six compounds were known as synthetic chemicals. WZ 436S-16 (dinitro-β-styrene) is the most potent antimicrobial and cytotoxic compound. It inhibits the oxygen uptake by N. coryli and causes apoptosis in the human promyelocytic leukaemia (HL-60 cells). From Vibrio sp. WMBA1-4, 13 new alkaloids were isolated, of which four were known as synthetic products and herein are reported as new substances from natural sources. The majority of these compounds show antimicrobial and cytotoxic activities. The cytotoxic activity of WMB4S-11 against the mouse lymphocytic leukaemia (L1210 cells) is due to the inhibition in the protein biosynthesis, while the remaining cytotoxic alkaloids have no effect on the synthesis of macromolecules in this cell line. The antibacterial activity of WMB4S-2, -11, -12, -13 and the antifungal activity of WMB4S-9 are not due to the inhibition in the macromolecules biosynthesis or in the oxygen uptake by the microorganisms. The biological activity of these nitro-aromatic compounds from Salegentibacter sp. T436 and Vibrio sp. WMBA1-4 is influenced by the presence of a nitro group and its position in respect to the hydroxyl group, number of the nitro groups, and the type of substitutions on the side chain. In diaryl-maleimide derivatives, types and position of substitution on the aryl rings, on the maleimide moity, and the hydrophobicity of the aryl ring itself lead to variations in the extent of the bioactivity of these derivatives. This is the first time that vibrindole (WMB4S-14) and turbomycin B or its noncationic form (WMB4S-15), isolated from Vibrio sp., are reported as cytotoxic compounds. WMB4S-15 inhibits the biosynthesis of macromolecules in L1210 cells. The structural similarity between some of the metabolites in this study and previously reported compounds from sponges, ascidians, and bryozoan indicates that the microbial origin of these compounds must be considered.
Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse genetischer Veränderungen in der Familie P006 von Piperacillin-resistenten Mutanten von S. pneumoniae R6. Jede der fünf Mutanten P106 bis P506 dieser Familie wurde aus dem jeweiligen Parentalstamm auf ansteigender Konzentration des lytischen ß-Lactams Piperacillin isoliert und zeichnete sich durch eine jeweils höhere minimale Hemmkonzentration (MHK) für Piperacillin aus (Laible et al., 1987). In Mutante P106 konnte mit CpoA bereits eine Resistenzdeterminante für Piperacillin identifiziert werden, welche nicht zu den klassischen Targets der ß-Lactamantibiotika, den Penicillin-Bindeproteinen (Pbp), zählt (Grebe et al., 1997). Die Mutanten P206 und P306 zeigten aufgrund von Mutationen in Pbp2b und Pbp2x eine höhere Resistenz gegen Piperacillin (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). In dieser Arbeit standen die Identifizierung und Charakterisierung der bisher unbekannten Resistenzdeterminante für Piperacillin in Mutante P406 und die Charakterisierung der bisher nur unzulänglich untersuchten Nicht-Pbp-Resistenzdeterminante CpoA in Mutante P106 im Mittelpunkt der Analysen. Im Fall der bereits identifizierten Resistenzdeterminante in Mutante P106 handelt es sich um das für eine Glykosyltransferase kodierende Gen cpoA. Die Herstellung einer cpoA-Deletionsmutante, sowie deren Charakterisierung, sollten zur Aufklärung des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus in P106 und der Funktion von CpoA beitragen. Durch die Herstellung der cpoA-Deletionsmutante und die Bestimmung der MHK für Piperacillin konnte gezeigt werden, daß ein Ausfall der durch CpoA katalysierten Reaktion einen Anstieg der MHK für Piperacillin in S. pneumoniae R6 bewirkt. Die eingehende phänotypische Charakterisierung zeigte, daß die cpoA-Deletionsmutante zudem eine reduzierte genetische Kompetenz, eine reduzierte Säuretoleranz, einen höheren Bedarf an zweiwertigen Mg-Ionen, eine längere Generationszeit und eine verlangsamte Autolyse im Vergleich zu S. pneumoniae R6 besitzt. Diese Beobachtungen, sowie die Ergebnisse einer Microarray-basierten, globalen Transkriptomanalyse lassen es unter Berücksichtigung der biochemischen Charakterisierung von CpoA (Edman et al., 2003) als wahrscheinlich erscheinen, daß CpoA an der Synthese von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, einem der Hauptglycolipide der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae beteiligt ist. Die Deletion von cpoA könnte demzufolge auch einen Effekt auf die Menge der Lipoteichonsäuren in der Zellwand von S. pneumoniae besitzen, da der Precursor von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, das α-Monoglucosyl-Diacylglycerin vermutlich den Lipidanker der Lipoteichonsäuren darstellt. Basierend auf dieser Annahme konnte ein Modell zur Funktion von CpoA erstellt werden, welches eine Erklärung des Resistenzmechanismus für Piperacillin in Mutante P106, bzw. in der cpoA-Deletionsmutante ermöglichen würde. In Mutante P406 konnten weitere Veränderungen der Pbps bereits ausgeschlossen werden (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse aller fünf Mutanten der Familie P006 konnten Gene identifiziert werden, deren Transkripte im Vergleich zu S. pneumoniae R6 nur in P406 signifikant veränderte Mengen aufwiesen: Unter diesen Genen befanden sich sechs Gene, welche aufgrund ihrer geclusterten Anordnung im Genom von S. pneumoniae als putative funktionelle Einheit (TCS11-Cluster) angesehen wurden. Diese Gene zeigten eine bis zu 22-fach erhöhte Transkriptmenge in Mutante P406. Zudem konnten nur in Mutante P406 von Genen des an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten lic1-Operons eine bis zu 7,9-fach höhere Transkriptmenge beobachtet werden. Keines der Genprodukte des TCS11-Clusters wurde bisher charakterisiert. Aufgrund von Blast- und Domänen-Analysen konnten den Genprodukten putative Funktionen zugeschrieben werden. Die Gene smp11A und smp11B kodieren für zwei putative Membranproteine von 63 und 64 Aminosäuren. Die Gene nbp11 und msp11 kodieren für die ATPase- und die Permease-Komponente eines putativen ABC-Transporters. kin11 und reg11 kodieren für die Histidin-Kinase und den Response-Regulator des bisher uncharakterisierten Zweikomponentensystems 11 (TCS11) in S. pneumoniae. Die Gene sind in der Reihenfolge smp11A, smp11B, nbp11, msp11, kin11 und reg11 auf dem Minus-Strang im Genom von S. pneumoniae lokalisiert. Die Deletion der Gene kin11 und reg11 des TCS11 in P406 führte zum Abfall der MHK für Piperacillin auf die MHK des Parentalstamms P306. Somit konnte die Beteiligung des TCS11 in S. pneumoniae an einem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin nachgewiesen werden. Die Deletion von nbp11 in P406 führte ebenfalls zum Abfall der MHK für Piperacillin, womit einerseits auch für Nbp11 eine Beteiligung an dem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin gezeigt werden konnte und andererseits eine transkriptionelle Regulation der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 durch das TCS11 vermutet werden konnte. Durch eine konstitutive, gemeinsame Überexpression der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 in S. pneumoniae R6 wurde gezeigt, daß die Überexpression dieser Gene hinreichend für eine Erhöhung der Resistenz gegen Piperacillin ist. Durch 5´-RACE-Analysen konnten die beiden Transkriptionsstartpunkte P11.1 und P11.2 im Bereich des TCS11-Clusters kartiert werden. P11.1 befindet sich 20bp upstream von smp11A und P11.2 befindet sich 441bp upstream von kin11 innerhalb von msp11. Eine Northern-Analyse und die Durchführung von PCR auf cDNA zeigte, daß die Gene des TCS11-Clusters in zwei überlappenden Transkriptionseinheiten transkribiert werden. Die Gene kin11 und reg11 sind zusammen mit einer downstream von reg11 liegenden Kopie des repetetiven Elements rupA im 11-2-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.2 inklusive des ungewöhnlich langen Leaders von 441bp transkribiert. smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 sind im 11-1-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.1 transkribiert. Die Zugehörigkeit von kin11 und reg11 zum 11-1-Operon konnte hingegegen bei den verwendeten Wachstumsbedingungen nicht gezeigt werden. Es konnte bereits gezeigt werden, daß phosphoryliertes Reg11 (Reg11-P) an die Promotor-Region von P11.1 bindet (Marciszewski, Diplomarbeit 2007). Die Bestimmung der Aktivität von P11.1 in S. pneumoniae R6, sowie in kin11-, reg11- und kin11reg11-Deletionsmutanten zeigte, daß P11.1 einer direkten, positiven Regulation durch das TCS11 unterliegt. Durch Sequenzvergleiche der Promotor-Region von P11.1 mit den DNA-Regionen putativer Promotoren von zum TCS11-Cluster ähnlich organisierten Clustern homologer Proteine in Genomen anderer Gram-positiver Bakterien konnten drei hoch konservierte Sequenzabschnitte identifiziert werden, von welchen gezeigt werden konnte, daß sie für die Bindung von Reg11-P in S. pneumoniae essentiell sind. Vermutlich stellt die Konsensus-Sequenz ATGACA(2)TGTCAT(8-9)GTGACA die DNA-Bindestelle von Reg11-P dar. Es konnten keine weiteren, zu 100 % konservierten Sequenzen dieser Art im Genom von S. pneumoniae gefunden werden. In EMSA-Assays mit weniger konservierten Sequenzen dieser Art konnte keine Bindung von Reg11-P beobachtet werden. Somit handelt es sich bei der Bindestelle an P11.1 vermutlich um die einzige Bindestelle von Reg11-P im Genom von S. pneumoniae. Von P11.2 konnte durch die Bestimmung der Promotor-Aktivität in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters gezeigt werden, daß auch dieser Promotor einer Regulation unterliegt, welche jedoch nicht durch die Bindung von Reg11-P, oder von unphosphoryliertem Reg11 vermittelt wird. Die Aktivität von P11.2 ist hierbei jedoch einerseits Abhängig von der Anwesenheit von Kin11 und andererseits entweder von der Funktion der Membranproteine Smp11A und Smp11B, oder von der durch Nbp11/Msp11 transportierten unbekannten Substanz. Die Bestimmung der Promotor-Aktivität von P11.2 in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters und die unterschiedlichen phänotypischen Effekte einer kin11-, reg11- und einer kin11reg11-Deletionsmutante zeigten, daß unphosphoryliertes Reg11 ebenfalls in der Lage sein muß, die Transkription von noch unbekannten Zielgenen durch Bindung an eine weitere, unbekannte DNA-Bindestelle zu regulieren. Sowohl durch die Deletion eines Großteils des 441nt langen Leaders des Transkripts des 11-2-Operons, als auch durch die Deletion zweier verschiedener Abschnitte des 3´-untranslatierten Bereichs dieses Transkripts konnte gezeigt werden, daß der 5´- und der 3´-untranslatierte Bereich an noch unbekannten regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die Deletion einzelner Gene des TCS11-Clusters, sowie die gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 bewirkten die gleichen phänotypischen Effekte wie die charakterisierte cpoA-Deletionsmutante. So konnte in Wachstumsexperimenten der gleiche Einfluß auf die Generationszeit, die maximale Zelldichte und die Autolyse, wie in der cpoA-Deletionsmutante, gezeigt werden. Die Microarray-basierte Transkriptomanalyse zweier Deletionsmutanten von Genen des TCS11-Clusters zeigte zudem, daß sich infolge dieser Deletionen größtenteils die Transkriptmengen solcher Gene ändern, welche auch auf eine Deletion von cpoA reagieren. Hierzu zählen neben zahlreichen Genen für Proteine unbekannter Funktion die Gene des Kompetenzregulons, des blp-Clusters, sowie des Cholinbindeproteins PcpA und der Subtilisin-artigen Proteinase PrtA. Die in Mutante P406 beobachteten höheren Transkriptmengen von an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten Genen des lic1-Operons konnten durch die Deletion von kin11reg11 revidiert werden. Die konstitutive gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11, sowie die Bestimmung der Aktivität des Promotors P1spr1149 des lic1-Operons zeigte, daß die Transkription der Gene des lic1-Operons indirekt von der Menge an Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 abhängt. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß das TCS11-Cluster und die Glykosyltransferase CpoA an den gleichen, oder zumindest an sich beeinflussenden, Membran-assoziierten Vorgängen beteiligt sind. Folglich konnte durch die molekulargenetische Charakterisierung des in ähnlicher genetischer Organisation in Gram-positiven Bakterien weit verbreiteten TCS11-Clusters erstmals ein Hinweis auf die putative physiologische Funktion des TCS11-Clusters in S. pneumoniae erhalten werden.
The biodiversity of the cyanobacterial lichen flora of Vietnam is chronically understudied. Previous studies often neglected the lichens that inhabit lowlands especially outcrops and sand dunes that are common habitats in Vietnam.
A cyanolichen collection was gathered from lowlands of central and southern Vietnam to study their diversity and distribution. At the same time, cultured photobionts from those lichens were used for olyphasic taxonomic approach.
A total of 66 cyanolichens were recorded from lowland regions in central and southern of Vietnam, doubles the number of cyanolichens for Vietnam. 80% of them are new records for Vietnam in which a new species Pyrenopsis melanophthalma and two new unidentified lichinacean taxa were described.
A notably floristic segregation by habitats was indicated in the communities. Saxicolous Lichinales dominated in coastal outcrops that corresponded to 56% of lichen species richness. Lecanoralean cyanolichens and basidiolichens were found in the lowland forests. Precipitation correlated negatively to species richness in this study, indicating a competitive relationship.
Eleven cyanobacterial strains including 8 baeocyte-forming members of the genus Chroococcidiopsis and 3 heterocyte-forming species of the genera Nostoc and Scytonema were successfully isolated from lichens.
Phylogenetic and morphological analyses indicated that Chroococcidiopsis was the unique photobiont in Peltula. New mophological characters were found in two Chroococcidiopsis strains: (1) the purple content of cells in one photobiont strain that was isolated from a new lichinacean taxon, and (2) the pseudofilamentous feature by binary division from a strain that was isolated from Porocyphus dimorphus.
With respect to heterocyte-forming cyanobiont, Scytonema was confirmed as the photobiont in the ascolichen Heppia lutosa applying the polyphasic method. The genus Scytonema in the basidiolichens Cyphellostereum was morphologically examinated in lichen thalli. For the first time the intracellular haustorial system of basidiolichen genus Cyphellostereum was noted and investigated.
Phylogenetic analysis of photobiont strains Nostoc from Pannaria tavaresii and Parmeliella brisbanensis indicated that a high selectivity occurred in Parmeliella brisbanensis that were from different regions of the world, while low photobiont selectivity occurred among Pannaria tavaresii samples from different geographical regions.
The herewith presented dissertation is therefore an important contribution to the lichen flora of Vietnam and a significant improvement of the actual knowledge about cyanolichens in this country.
Living systems incessantly engage in the regulation of their cellular processes to fulfill their biological functions. Beyond development-related adjustments or cell cycle oscillations, environmental fluctuations compel the system to reorganize metabolic pathways, structural components, or molecular repair and reconstitution mechanisms. These responses manifest across diverse temporal scales, necessitating an intricate regulatory orchestration. Time series experiments have become increasingly popular for charting the chronological order and elucidating the underlying mechanisms. In the era of high-throughput technologies, the majority of cellular molecules can be analyzed in one fell swoop, generating a comprehensive snapshot of the status quo of most present molecules. Methodological advancements also permit the monitoring not only of molecular abundances but also the functional status of transcripts and proteins. However, due to the still high efforts associated with such experiments, the number of measured time points and the replication of measurements remains limited. Resulting datasets contain signals from thousands of molecules, yet they are sparse in temporal resolution and are often imprecise due to biological variability and technical measurement inaccuracies.
This thesis explores the complexities arising from the examination of short time series data and introduces pioneering tools that offer fresh insights into the realm of biological time series analysis. The broad spectrum of analytic possibilities ranges from a molecule-centric investigation of individual time courses to a holistic aggregation of the system’s response to its main characteristics. By creating a modeling framework that applies domain-specific constraints, time-course signals can be transformed from a series of discrete data points into a continuous curve. These curves align with current biological conjectures about molecule kinetics being smooth and devoid of superfluous oscillations. Noise present at individual time points is judiciously accounted for during curve fitting, mitigating the impact of time points with high variance on the curve. Subsequent classification is based on the features of these curves (extreme points and inflection points) and ensures a reduction in data amount and complexity. Succinct labels assigned to each molecule's kinetics encapsulate the signal's most notable features. Besides this modeling approach, an innovative enrichment strategy is introduced, that is independent of prior data partitioning and capable of segregating the temporal response into its thermodynamically relevant components. This approach allows for a continuous assessment of each molecule's contribution to these components, obviating the need for exclusive allocation. The application of various analytical approaches to heat acclimation experiments in Chlamydomonas highlights the relevance and potential of time series experiments and specifically tailored analysis techniques. The integration of different system levels has led to the identification of regulatory peculiarities, such as an increased correlation between transcripts and corresponding proteins during acclimation responses. These and other insights may herald new avenues of research that could ultimately enhance plant robustness in the face of increasing environmental perturbations.
The growing popularity of time series experiments necessitates dedicated analytical approaches that empower researchers and analysts to decipher patterns, discern trends, and unravel the underlying structures within the data, facilitating predictions and the derivation of meaningful conclusions that could potentially build bridges between the interweaved systems levels.