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- Proteine (2) (entfernen)
Fachbereich / Organisatorische Einheit
Benzene is a natural constituent of crude oil and a product of incomplete combustion of petrol
and has been classified as “carcinogenic to humans” by IARC in 1982 (IARC 1982). (E,E)-
Muconaldehyde has been postulated to be a microsomal metabolite of benzene in vitro
(Latriano et al. 1986). (E,E)-Muconaldehyde is hematotoxic in vivo and its role in the
hematotoxicity of benzene is unclear (Witz et al. 1985).
We intended to ascertain the presence of (E,E)-muconaldehyde in vivo by detection of a
protein conjugate deriving from (E,E)-muconaldehyde.
Therefore we improved the current synthetic access to (E,E)-muconaldehyde. (E,E)-
muconaldehyde was synthesized in three steps starting from with (E,E)-muconic acid in an
overall yield of 60 %.
Reaction of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin resulted in formation of a
conjugate which was converted upon addition of NaBH4 to a new species whose HPLC-
retention time, UV spectra, Q1 mass and MS2 spectra matched those of the crude reaction
product from one pot conversion of Ac-Lys-OMe with (E,E)-muconaldehyde in the presence
of NaBH4 and subsequent cleavage of protection groups.
Synthetic access to the presumed structure (S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-oxohexa-2,4-dien-1-
yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-CHO)) was provided in eleven steps starting from (E,E)-
muconic acid and Lys(Z)-OtBu*HCl in 2 % overall yield. Additionally synthetic access to
(S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-hydroxyhexa-2,4-dien-1-yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-OH))
and (S)-2-ammonio-6-((6-hydroxyhexyl)amino)hexanoate (IS) was provided.
With synthetic reference material at hand, the presumed structure Lys(MUC-OH) could be
identified from incubations of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin via HPLC-ESI+-
MS/MS.
Cytotoxicity analysis of (E,E)-muconaldehyde and Lys(MUC-CHO) in human promyelocytic
NB4 cells resulted in EC50 ≈ 1 μM for (E,E)-muconaldehyde. Lys(MUC-CHO) did not show
any additional cytotoxicity up to 10 μM.
B6C3F1 mice were exposed to 0, 400 and 800 mg/kg b.w. benzene to examine the formation
of Lys(MUC-OH) in vivo. After 24 h mice were sacrificed and serum albumin was isolated.
Analysis for Lys(MUC-OH) has not been performed in this work.
In der biotechnologischen Herstellung von Proteinen ist die Fällung mit Hilfe von Salzen (z. B. Ammoniumsulfat) ein unkompliziertes und verbreitetes Verfahren, wobei die biologischen Eigenschaften der Proteine (meistens) erhalten bleiben. Dieses Verfahren basiert auf dem sogenannten „Aussalzeffekt“. Obwohl das „Aussalzen“ von Proteinen seit langem bekannt ist, ist das Phasenverhalten in Systemen aus Proteinen, Salzen und Wasser weitgehend ungeklärt. Das Phasenverhalten eines proteinhaltigen Systems wird durch eine Vielzahl von Parametern, z. B. Art und Konzentration der Stoffe, Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke, beeinflusst. Darüber hinaus können beim Ausfällen der Proteine sowohl stabile als auch metastabile Phasengleichgewichte auftreten. In der vorliegenden Arbeit wurden experimentelle Untersuchungen zum Phasenverhalten ternärer Systeme (Protein + Salz + Wasser) bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Das Ausfällen von Lysozym, Bovin Serum Albumin, Ovalbumin und Trypsin mit Hilfe verschiedener Salze (Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und teilweise der flüchtigen Salze Ammoniumcarbamat und Ammoniumbicarbonat) wurde untersucht. Die experimentellen Untersuchungen erfolgten einerseits durch Bestimmung der Trübungskurven und andererseits durch Bestimmung der Zusammensetzung der koexistierenden Phasen. Zusätzlich wurden mikroskopische Untersuchungen durchgeführt, um die Struktur der proteinreichen Phase (amorph, kristallin) aufzuklären. Die vorliegende Arbeit trägt zur Aufklärung der das Ausfällen von Proteinen verursachenden physikalisch-chemischen Effekte am Beispiel einiger Modellsysteme bei. Es wurde gezeigt, dass flüchtige Salze (d. h. die Salze auf Basis von Ammoniak und Kohlendioxid) erfolgreich für die Aufarbeitung der wässrigen Proteinlösungen eingesetzt werden können. Die Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen sollen die Grundlage für eine in weiterführenden Arbeiten vorgesehene Modellierung solcher Phasengleichgewichte bilden.