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Im Verlauf dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression des tonoplastidären Dicarboxylat Transporters zu einem erhöhten Gehalt an Malat bei gleichzeitig vermindertem Citratgehalt in den Überexpressions-Pflanzen führt. Somit konnte, ähnlich wie in den k.o.-Pflanzen, ein reziprokes Verhalten von Citrat und Malat aufgezeigt werden.
Elektrophysiologische Analysen an Oozyten von X. laevis in Zusammenhang mit Aufnahmeversuchen an Proteoliposomen zeigten weiterhin, dass der Transport von Citrat ebenfalls durch den TDT katalysiert wird. Anhand eines negativen Einwärts-Strom an Oozyten konnte gezeigt werden, dass dieser Citrat-Transport elektrogen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Citrat2-H die transportierte Form von Citrat darstellt. Dieses wird vermutlich zusammen mit drei Protonen transportiert.
Die Dianionen Malat und Succinat, sowie höchstwahrscheinlich auch Fumarat, werden ebenfalls über den TDT transportiert. Unter Standardbedingungen werden diese in die Vakuole importiert. Im Gegenzug wird Citrat aus der Vakuole exportiert. Die trans-stimulierende Wechselwirkung von Malat, Succinat und Fumarat auf den Citrat Transport und vice versa bestärkt den in dieser Arbeit postulierten Antiport der jeweiligen Carboxylate über den Tonoplasten. Dieser ist jedoch nicht obligat, was an dem verringerten Transport von Citrat ohne Gegensubstrat über die Membran gezeigt werden konnte.
Unter Trockenstress und osmotischen Stress konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die erhöhte Expression des TDT maßgeblich an der Akkumulation von Malat und der Mobilisierung von Citrat unter den genannten Stressbedingungen beteiligt ist.
Letztlich konnte mittels Säurestressexperimenten nachgewiesen werden, dass die Malatakkumulation, bei gleichzeitigem Citrat Abbau nicht zwingend miteinander gekoppelt sind, unter Säurestress müssen daher weitere regulatorische Effekte auf den Malat-Import bzw. den Citrat-Export vorherrschen.
Versuche zur Antibiotikawirkung von Daptomycin und der Immunsuppression bei Myasthenia gravis
(2015)
Versuche zur Antibiotikawirkung von Daptomycin und der Immunsuppression bei Myasthenia gravis
Daptomycin ist ein cyclisches Lipopeptidantibiotikum, das zur Behandlung schwerer gram-positiver Infektionen entwickelt wurde. Daptomycin weißt in vitro eine schnelle Aktivität gegen klinisch signifikante Stämme gram-positiver Pathogene auf. Außerdem ist die Aktivität von Daptomycin abhängig von der physiologischen Calciumkonzentration. Es wird postuliert, dass in einem ersten Schritt die Calciumionen mit dem Antibiotikum interagieren und dieser Komplex dadurch positiv geladen ist. Somit kann es an negativ geladene Membranen, die Phosphatidylglycerol enthalten, binden. In einem nächsten Schritt interagiert der hydrophobe Schwanz des Daptomycins als Anker, da dieser in wässriger Lösung einen hohen \(\Delta\)G-Wert besitzt und dieser dadurch erniedrigt wird. Schließlich nimmt die Fluidität der Membran ab und durch den Kollaps des Membranpotentials findet ein Zusammenbruch verschiedener Zellfunktionen statt.
Die Versuche wurden zum größten Teil an Liposomen als Modelmembranen durchgeführt. Dabei wurden zwei Liposomensysteme genutzt. Einerseits Liposomen die aus Avanti Polar Lipid Mix bestanden und durch Behandlung mit Ultraschall hergestellt wurden. Andererseits wurden Liposomen aus Bakterien hergestellt. Zudem wurden kompette Bakterienzellen untersucht.
Der bakterielle Wachstum wurde durch UV/VIS-Spekroskopie gemessen. Veränderungen in der Fluidität der Membran wurden mittels ESR-Spektroskopie festgestellt. Die Morphologie wurde mittels Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie aufgenommen. Zusätzlich wurde ein Leakage Assay durchgeführt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei den ESR-Untersuchungen eine Änderung der Fluidität gemessen wurde. Aufgrund der Ergebnisse verschiedener Spinlabel lag allerdings die Vermutung nahe, dass sich bei Daptomycin keine diskrete Pore ausbildet, sondern es zur Krümmung der Membran kommt was schließlich zum Aufplatzen der Zelle führt. Deshalb wurden im weiteren Messungen am Elektronenmikroskop sowie am Rasterkraftmikroskop durchgeführt, um Rückschlüsse auf die Morphologie machen zu können. Diese Messungen bestätigten die obige These, dass sich keine Pore ausbildet sondern es zur Krümmung der Membranoberfläche kommt.
Bei Autoimmunerkrankungen richtet der Körper Autoantikörper gegen körpereigene Strukturen. Bei Myasthenia gravis sind es Antikörper, die gegen Strukturen der postsynaptischen Membran im Bereich der neuromuskulären Endplatte gerichtet sind. Hierbei richten sich diese gegen Acetylcholinrezeptoren, die als Transmembrankanäle bei der Signalweiterleitung fungieren.
In früheren Arbeiten konnte unter anderem Hossann gentechnisch die \(\alpha\)-Untereinheit des Acetylcholinrezeptors mit dem Ribosomeninaktivierenden Protein Gelonin koppeln, es lag hier allerdings eine niedrige Löslichkeit vor und das Fusionsprotein lies sich nur schwer zurückfalten.
In diesem Teil der Arbeit wurde die Cytotoxizität von Gelonin mittels Zellkuturexperimenten untersucht, ein von Li zur Verfügung gestelltes Plasmid mit der \(\alpha\)-Untereinheit des Acetylcholinrezeptors, fusioniert an den der Löslichkeitstag MBP, überprüft. Außerdem sollte ein Plasmid kloniert werden, das für ein Fusionsprotein aus MBP-Gelonin-Achetylcholinrezeptor codiert. Hierbei versprach man sich durch den zusätzlichen MBP-Tag eine höhere Löslichkeit.
Der Cytotoxizitätstest wurde durchgeführt, da in der Literatur teils widersprüchliche Ergebnisse veröffentlicht wurden, bestätigte aber, dass Gelonin als ein Typ I RIP ohne Membrandomäne keine Cytotoxizität aufweißt.
Das Plasmid MBP-Achetylcholinrezeptor wurde in E. coli Zelllen transformiert, das Protein exprimiert und mittels Amylosesäule und HiTrap-Säule isoliert. Es besahs eine hohe Löslichkeit und lag in gefalteter Form in Lösung vor.
Die zur Synthese des MBP-Gelonin-Acetylcholinrezeptors-Konjugats notwendigen Plasmide waren im Arbeitskreis vorhanden. Das Plasmid pET-gel codierte für Gelonin und die DNA-Sequenz für die \(\alpha\)-Untereinheit des Acetylcholinrezeptors war bereits in den pAChRex-Vektor einkloniert. Der Löslichkeitstag MBP war im Plasmid pmal-c5x enthalten.
Auf Basis dieser Plasmide wurde eine Klonierungsstrategie entwickelt und in Teilen durchgeführt.
Die hier vorgelegte Arbeit konzentrierte sich auf den vakuolären Ribonukleinsäure- (RNA) Abbau in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) und die Integration in den Nukleotid- Metabolismus unter Berücksichtigung von Nukleosidtransportprozessen. Insbesondere die physiologische Bedeutung des Verlustes der RNS2-Aktivität auf die vakuolären RNA-Abbauprozesse sollte untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass RNS2 den größten Anteil an der vakuolären Ribonuklease- (RNase-) Aktivität ausmacht, wobei die Restaktivität von circa 30 Prozent ein Hinweis auf mindestens eine weitere vakuoläre RNase ist. Die vakuolären Adenylatgehalte, Abbauprodukte der RNA, in RNS2-T-DNA-Insertionslinien zeigten, dass RNS2, ähnlich wie die intrazellulären RNasen in L. esculentum, 2‘,3‘-zyklische Nukleotidmonophosphate (2‘,3‘-cNMPs) produzieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass in diesen Linien die vakuolären Enzyme sowohl RNA, als auch 2‘,3‘-cNMPs langsamer abbauen als vakuoläre Enzyme aus Wildtyp-Pflanzen. Die Akkumulation dieses zyklischen Intermediates des RNA-Abbaus lässt darauf schließen, dass die Transphosphorylierung schneller verläuft als die Hydrolyse (Abel & Glund, 1987; Löffler et al., 1992; Nürnberger et al., 1990). Es kann angenommen werden, dass ein weiteres Enzym, wie etwa eine zyklische Phosphodiesterase oder eine weitere Ribonuklease, an der Hydrolyse beteiligt ist. Ein weiterer Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der wichtigen Frage der Qualität von Vakuolenisolationen. Protoplastenkontaminationen konnten mikroskopisch ausgeschlossen werden. Die chloroplastidäre Verunreinigung war mit circa 5 Prozent gering, die cytosolische Kontamination lag jedoch je nach Isolationsmethode bei bis zu 30 Prozent im Vergleich zu Protoplasten. Es konnte darüber hinaus erstmals durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden, dass Vakuolen RNA besitzen. Diese Oligonukleotide sind vornehmlich kleine Fragmente im Größenbereich bis 50 nt.
Next Generation Sequencing ermöglichte eine detaillierte Analyse von cDNA- Bibliotheken, gewonnen aus vakuolärer RNA. Diese Technik wurde unter anderem angewandt, um die Reliabilität des Experimentes zu untersuchen. Es zeigte sich eine große Varianz in der Verteilung der Counts auf die verschiedenen RNA-Loci innerhalb biologischer Replikate und unterschiedlicher Vakuolenisolationsmethoden. Erstmals konnte jedoch gezeigt werden, dass circa 70 Prozent der RNA-Fragmente in der
Vakuole von mRNA stammen. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass der Abbau der wenigen rRNA-Transkripte in diesem Organell verstärkt abläuft.
In A. thaliana existiert mit ENT7 lediglich ein Vertreter, der einen Export von RNA- Abbauprodukten aus der Zelle ermöglicht. Da er den namensgebenden Vertretern aus dem Reich der Säugetiere strukturell und funktionell ähnelt, ist ENT7 ein geeignetes ENT-Protein für zukünftige Kristallisations- und Strukturanalysen. In dieser Arbeit konnte ENT7-eGFP in Pichia pastoris mit großer Ausbeute (2 mg Protein pro Liter Hefekultur) synthetisiert und in stabiler Form gereinigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ENT7 ohne eGFP ebenfalls stabil und als Dimer vorliegt. Durch Bindungsstudien erfolgte der Nachweis der erfolgreichen Bindung an bekannte Substrate. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass neben Nukleosiden auch Nukleobasen, aber nicht ATP gebunden werden.