Marco Witthohn

• Cyanobacteria are a known source for bioactive compounds, of which several also show antibiotic activity. In regard to the growing number of multi-resistant pathogens, the search for novel antibiotic substances is of great importance and unexploited sources should be explored. So, this thesis initially dealt with the identification of productive strains, especially within the group of the terrestrial cyanobacteria, which are less well studied than marine and freshwater strains. Amongst these, Chroococcidiopsis cubana, an extremely desiccation and radiation tolerant, unicellular cyanobacterium was found to produce an extracellular antimicrobial metabolite effective against the Gram-positive indicator bacterium Micrococcus luteus as well as the pathogenic yeast Candida auris. However, as the sole identification of a productive cyanobacterium is not sufficient for further analysis and a future production scale-up, the second part of this thesis targeted the identification of compound synthesis prerequisites. As a result, a limitation of nitrogen was shown to be the production trigger, a finding that was used for the establishment of a continuous production system. The increased compound formation was then used for purification and analysis steps. As a second approach, in silico identified bacteriocin gene clusters from C. cubana were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. By this, the bacteriocin B135CC was identified as a strong bacteriolytic agent, active predominantly against the Gram-positive strains Staphylococcus aureus and Mycobacterium phlei. The peptide showed no cytotoxic effects against mouse neuroblastoma (N2a-) cells and a high temperature tolerance up to 60 °C. In order to facilitate the whole project, two standard protocols, specifically adapted for the work with cyanobacteria, were established. First, a method for a quick and easy in vivo vitality estimation of phototrophic cells and second, an approach for a high throughput determination of nitrate concentrations in microalgal cultures. Both methods greatly helped to proceed the main objectives of this work, the first one by simplifying the development of suitable cryopreservation protocols for individual cyanobacteria strains and the second one by accelerating the determination of the optimal nitrate concentration for the production of the antimicrobial compound from C. cubana. In the course of this cultivation optimization, the ability of cyanobacteria to utilize organic carbon sources for an accelerated cell growth was examined in greater detail. It could be shown that C. cubana reaches significantly higher growth rates when mixotrophically cultivated with fructose or glucose. Interestingly, this effect was even further enhanced when light intensity was decreased. Under these low-light conditions, phototrophically cultivated C. cubana cells showed a clearly decreased cell growth. This effect might be extremely useful for a quick and economic preparation of precultures.
• Cyanobakterien sind als Produzenten bioaktiver Verbindungen bekannt, von denen viele auch antibiotische Wirkung zeigen. Im Hinblick auf die wachsende Zahl multiresistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen antibiotischen Substanzen von großer Bedeutung und unerschlossene Quellen sollten erkundet werden. Daher befasste sich diese Arbeit zunächst mit der Identifizierung produktiver Stämme, insbesondere aus der Gruppe der terrestrischen Cyanobakterien, die weniger gut untersucht sind als marine und Süßwasser-Stämme. Die Arbeiten zeigen, dass Chroococcidiopsis cubana, ein besonders austrocknungs- und strahlungsresistentes, einzelliges Cyanobakterium, eine extrazelluläre antimikrobielle Verbindung produziert, die sowohl gegen das Gram-positive Indikatorbakterium Micrococcus luteus als auch gegen den pathogenen Hefepilz Candida auris wirkt. Da jedoch die alleinige Identifizierung eines produktiven Cyanobakteriums für weitere Analysen und ein anschließendes scale-up nicht ausreichen, beschäftigte sich der zweite Teil dieser Arbeit mit den Synthesevoraussetzungen für die Verbindung. Dabei konnte eine Stickstofflimitierung als Produktionsauslöser nachgewiesen werden, eine Erkenntnis, die für die Etablierung eines kontinuierlichen Produktionssystems genutzt wurde. Die daraus resultierende höhere Substanzausbeute wurde für anschließende Reinigungs- und Analyseschritte genutzt. In einem zweiten Ansatz wurden durch in silico Analysen identifizierte Bacteriocin-Gencluster aus C. cubana kloniert und heterolog in Escherichia coli exprimiert. Auf diese Weise wurde das Bacteriocin B135CC als stark bakteriolytisches Peptid identifiziert, das vor allem gegen die Gram-positiven Stämme Staphylococcus aureus und Mycobacterium phlei wirkt. B135CC zeigte keine zytotoxische Wirkung gegenüber Maus-Neuroblastom-Zellen (N2a) und eine hohe Temperaturtoleranz bis zu 60 °C. Es wurden außerdem zwei Standardprotokolle entwickelt, die speziell für die Arbeit mit Cyanobakterien angepasst wurden. Zum einen eine Methode zur schnellen und einfachen in vivo-Vitalitätsmessung phototropher Zellen, um geeignete Kryokonservierungsprotokolle für Cyanobakterien entwickeln zu können, und zum anderen eine Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung von Nitratkonzentration in Mikroalgenkulturen. Diese wurde zur Optimierung der Produktionsbedingungen mit C. cubana verwendet. Im Zuge dessen wurde auch die Fähigkeit der Cyanobakterien, organische Kohlenstoffquellen für ein beschleunigtes Zellwachstum zu nutzen, näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass C. cubana deutlich höhere Wachstumsraten erreicht, wenn es mit Fructose oder Glucose kultiviert wird. Interessanterweise wurde dieser Effekt sogar noch verstärkt, wenn die Lichtintensität verringert wurde. Unter diesen lichtarmen Bedingungen zeigten phototroph kultivierte C. cubana-Zellen dagegen ein deutlich verringertes Zellwachstum. Dieser Effekt könnte für eine schnelle und wirtschaftliche Anzucht von Vorkulturen genutzt werden.