Thomas Schillinger

• Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) stellen einen neuen Typus Retroelement dar, die gezielt einen Teil einer codierenden Sequenz des Wirtsgenoms über einen Copy and Replace-Mechanismus hypermutieren und somit zur Erzeugung biologischer Diversität beitragen können. Trotz dieser einzigartigen Eigenschaften und dem potentiellen Wert dieser Elemente für Industrie und Forschung konzentrierten sich seit der Beschreibung des ersten DGRs vor über zehn Jahren die meisten Publikationen auf mechanistische Eigenschaften des Prototypen aus dem Bordetella Bakteriophagen. Allerdings sind zahlreiche Fragen zur Funktionsweise dieser Elemente noch immer ungeklärt. Ebenso wurden bisher extensivere, vergleichende Studien, die weitere Vertreter dieser Elemente berücksichtigen, noch nicht durchgeführt. Die vorliegende Dissertation leistet einen wichtigen Beitrag zum tieferen Verständnis diversitätsgenerierender Retroelemente. Das eigens für diesen Zweck konzipierte Programm DiGReF erlaubte eine umfassende Analyse der Bestände öffentlicher Datenbanken auf DGRs in sequenzierten Genomen. Mit Hilfe dieser Daten konnten weitere Aspekte dieser Elemente aufgeklärt werden, die eine Analyse ihrer Verteilung, ihrer phylogenetischen Beziehungen, ihrer Struktur und eine Charakterisierung der einzelnen Elemente einer DGR-Kassette umfassten. So konnte gezeigt werden, dass das zuvor für wenige Elemente beschriebene Merkmal der Adeninsubstitution eine gemeinsame Eigenschaft aller DGRs ist, während keine C-, T- oder G-Substitionen auftreten. Ebenso fanden sich erste Belege dafür, dass die beiden essentiellen Elemente Template Repeat und reverse Transkriptase nicht notwendigerweise ein gemeinsames Transkript besitzen. Außerdem konnte erstmalig die Gruppe der weitgehend uncharakterisierten akzessorischen Proteine umfassender beschrieben und ein Consensusmotiv ermittelt werden. Für künftige Studien werden die DiGReF-Software und die Ergebnisse dieser Arbeit von grundlegender Bedeutung sein. Der zweite Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die experimentelle Charakterisierung zweier Kernkomponenten von DGRs, der reversen Transkriptase und den akzessorischen Proteinen. Während die Aufreinigung einer DGR-assoziierten reversen Transkriptase noch weitere experimentelle Arbeiten erfordern wird, konnte das akzessorische Protein Alr3496 aus der Blaualge Nostoc sp. PCC 7120 erfolgreich in rekombinanter Form aufgereinigt werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Alr3496 diverse Nucleinsäuresubstrate bindet, und in der Lage ist, die Hybridisierung von komplementären DNA-Strängen zu katalysieren. Dies legt nahe, dass akzessorische Proteine aus DGR-Elementen eine Rolle als Nucleinsäurechaperone übernehmen.
• Diversity-generating retroelements (DGRs) constitute a new type of retroelement, which is able to diversify a distinct section of a host open reading frame by using a copy and replace mechanism; biological diversity is created in the process. On the contrary, classic retroelements utilize a copy and paste mechanism and can potentially disrupt coding or regulatory sequences of the host genome by insertion. The first description of a DGR was published about one decade ago; since then, several studies have focused on mechanistical properties of this prototypical element from the Bordetella bacteriophage. However, various questions concerning these elements are still unanswered. Moreover, more comprehensive studies that compare elements from various organisms have not been conducted so far. This thesis provides a significant contribution to a deeper understanding of diversity-generating retroelements. An exclusively-designed program called Diversity-Generating Retroelement Finder (DiGReF) allowed for a comprehensive analysis of public databases for the presence of DGRs in sequenced genomes. Using these data, more advanced studies were conducted that included analysis of distribution, phylogeny, structure and characterization of every component in DGR cassettes. For instance, it was revealed that adenine substitution, which was reported previously for several elements, is a common hallmark of all DGRs. Also, first evidence was found that the two core components of DGRs, template repeat and reverse transcriptase, do not necessarily share a common RNA transcript. Additionally, the largely uncharacterized group of accessory proteins was more closely investigated, leading to the identification of a previously unreported consensus motif. Future studies will benefit from the DiGReF software, and the results described herein. In the second part of this thesis, two key components of DGRs – the reverse transcriptase and an accessory protein – were assessed experimentally for further characterization. While more work has to be invested in the purification of a DGR reverse transcriptase, successful recombinant expression and purification of the accessory protein Alr3496 from the cyanobacterium Nostoc sp. PCC 7120 was achieved, and binding of various nucleic acid substrates was observed in filter binding assays. Additionally, further experiments demonstrated that Alr3496 is able to catalyze hybridization of complementary DNA strands, which suggests that DGR accessory proteins might act as nucleic acid chaperones.