Versuche zum ribosomalen Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine und Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen in thermophilen ATP-Synthasen mittels Spin-markierter Nukleotide

  • Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spin-Label Aminosäure HO3007 (ein Derivat des Alanins, dessen Seitenkette mit dem Spinlabel 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolin-nitroxid modifiziert ist) mit der Methode der amber-Suppression in Proteine inkorporiert werden kann. Der Einbau wurde ESR-spektroskopisch nachgewiesen. Dazu wurde eine neue amber-Suppressor tRNA synthetisiert. Am Akzeptorstamm trägt die tRNA die Spin-Label-Aminosäure HO3007, mit ihrem Anticodon erkennt die tRNA das amber Codon. Der Einbau der Aminosäure erfolgte in ein 137 Aminosäuren langes N-terminales Fragment des humanen Mtj1p-Proteins in vitro. Zu diesem Zweck wurde in den in vitro Expressionsvektor pIVEX2.3MCS das Gen für ein 137 Aminosäuren langes N-terminales Fragment des humanen Mtj1p-Proteins einkloniert. Das Gen wurde so mutiert, dass sich an der Position des Codons für die Aminosäure Phe113 (TAC) die amber-Mutation (TAG) befindet. Der neu synthetisierte Vektor trägt die Bezeichnung pIVEX2.3MCSMtj1pN-term. Der Vektor und die amber-Suppressor tRNA wurden in einem E.coli in vitro Translationssystem eingesetzt. Die hohen gebundenen Anteile der anschließend gemessenen ESR-Spektren zeigen, dass die Spin-Label Aminosäure in das nativ gefaltete N-terminale Fragment des Mtj1p-Proteins eingebaut wurde. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP auch in der isolierten -Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3 an die katalytische Bindungsstelle bindet und somit für weitergehende Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen als Reportermolekül geeignet ist. Dazu wurde die isolierte -Untereinheit mit dem Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP kovalent markiert und anschließend tryptisch verdaut. Die entstandenen Peptidfragmente wurden mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Mit Hilfe der MASCOT-Datenbank und der Software BioTools der Fa. Bruker konnte ein Fragment identifiziert werden, bei dem Tyr 341, das sich in der katalytischen Bindungsstelle befindet, mit dem ADP-Derivat von 2-N3-2’,3’-SL-ATP kovalent markiert ist. Einen weiteren Hinweis für die erfolgreiche kovalente Modifizierung der -Untereinheit mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP lieferte die Untersuchung des unverdauten Proteins im MALDI-TOF Massenspektrometer. Im Vergleich zum unmodifizierten Protein weist der Peak der modifizierten -Untereinheit ein deutliches Peak-tailing zu höheren Massen auf. Da die Proben vor der Messung entsalzt wurden, spricht diese Beobachtung deutlich für die kovalente Modifizierung des Proteins. Die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit beweisen, dass das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP auch im Fall der isolierten -Untereinheit an die katalytische Bindungsstelle bindet.

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Metadaten
Author:Dirk Mannweiler
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-19721
Advisor:Wolfgang E. Trommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/07/03
Tag:ATP-Synthase; In-vitro-Translation; unnatürliche Aminosäuren
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $