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Improved early in vitro prediction of drug-induced liver injury in man: assessment of novel 3D hepatic models

  • Increasing costs due to the rising attrition of drug candidates in late developmental phases alongside post-marketing withdrawal of drugs challenge the pharmaceutical industry to further improve their current preclinical safety assessment strategies. One of the most common reasons for the termination of drug candidates is drug induced hepatotoxicity, which more often than not remains undetected in early developmental stages, thus emphasizing the necessity for improved and more predictive preclinical test systems. One reason for the very limited value of currently applied in vitro test systems for the detection of potential hepatotoxic liabilities is the lack of organotypic and tissue-specific physiology of hepatocytes cultured in ordinary monolayer culture formats. The thesis at hand primarily deals with the evaluation of both two- and three-dimensional cell culture approaches with respect to their relative ability to predict the hepatotoxic potential of drug candidates in early developmental phases. First, different hepatic cell models, which are routinely used in pharmaceutical industry (primary human hepatocytes as well as the three cell lines HepG2, HepaRG and Upcyte hepatocytes), were investigated in conventional 2D monolayer culture with respect to their ability to detect hepatotoxic effects in simple cytotoxicity studies. Moreover, it could be shown that the global protein expression levels of all cell lines substantially differ from that of primary human hepatocytes, with the least pronounced difference in HepaRG cells. The introduction of a third dimension through the cultivation of spheroids enables hepatocytes to recapitulate their typical native polarity and furthermore dramatically increases the contact surface of adjacent cells. These differences in cellular architecture have a positive influence on hepatocyte longevity and the expression of drug metabolizing enzymes and transporters, which could be proven via immunofluorescent (IF) staining for at least 14 days in PHH and at least 28 days in HepaRG spheroids, respectively. Additionally, the IF staining of three different phase III transporters (MDR1, MRP2 and BSEP) indicated a bile canalicular network in spheroids of both cell models. A dose-dependent inducibility of important cytochrome P450 isoenzymes in HepaRG spheroids could be shown on the protein level via IF for at least 14 days. CYP inducibility of HepaRG cells cultured in 2D and 3D was compared on the mRNA level for up to 14 days and inducibility was generally lower in 3D compared to 2D under the conditions of this study. In a comparative cytotoxicity study, both PHH and HepaRG spheroids as well as HepaRG monolayers have been treated with five hepatotoxic drugs for up to 14 days and viability was measured at three time points (days 3, 7 and 14). A clear time- and dose-dependent onset of the drug-induced hepatotoxic effects was observable in all conditions tested, indicated by a shift of the respective EC50 value towards lower doses by increasing exposure. The observed effects were most pronounced in PHH spheroids, thus indicating those as the most sensitive cell model in this study. Moreover, HepaRG cells were more sensitive in spheroid culture compared to monolayers, which suggests a potential application of spheroids as long-term test system for the detection of hepatotoxicities with slow onset. Finally, the basal protein expression levels of three antigens (CYP1A2, CYP3A4 and NAT 1/2) were analyzed via Western Blotting in HepaRG cells cultured in three different cell culture formats (2D, 3D and QV) in order to estimate the impact of the cell culture conditions on protein expression levels. In the QV system enables a pump-driven flow of cell culture media, which introduces both mechanical stimuli through shear and molecular stimuli through dynamic circulation to the monolayer. Those stimuli resulted in a clearly positive effect on the expression levels of the selected antigens by an increased expression level in comparison to both 2D and 3D. In contrast, HepaRG spheroids showed time-dependent differences with the overall highest levels at day 7. The studies presented in this thesis delivered valuable information on the increased physiological relevance in dependence on the cell culture format: three-dimensionality as well as the circulation of media lead to a more differentiated phenotype in hepatic cell models. Those cell culture formats are applicable in preclinical drug development in order to obtain more relevant information at early developmental stages and thus help to create a more efficient drug development process. Nonetheless, further studies are necessary to thoroughly characterize, validate and standardize such novel cell culture approaches prior to their routine application in industry.
  • Steigende Kosten aufgrund der zunehmenden Terminierung von Wirkstoffkandidaten in späten Entwicklungsphasen sowie der Marktrücknahme von Arzneimitteln stellen die pharmazeutische Industrie vor die Herausforderung, ihre üblichen standardisierten Sicherheitsprüfungen weiterzuentwickeln. Dabei stellt Arzneimittel-induzierte Hepatotoxizität einen der Hauptgründe für das Scheitern neuer Wirkstoffkandidaten dar, weswegen die Notwendigkeit zur Entwicklung prädiktiver Modelle unumgänglich ist. Ein Grund für die sehr limitierte Aussagekraft der herkömmlichen in vitro Testsysteme zur Erfassung potentieller Hepatotoxizität besteht darin, dass die organ- und gewebespezifischen Eigenschaften in gewöhnlichen Zellkulturformaten nahezu gänzlich verloren gehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bewertung zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodelle mit Bezug auf deren jeweilige Aussagekraft auf potentielle hepatotoxische Effekte von Wirkstoffen im Rahmen der frühen Arzneimittelentwicklung hinweisen zu können. Dabei wurden zunächst verschiedene hepatische Zellmodelle (Primäre humane Hepatozyten (PHH) sowie die drei Zelllinien HepG2, HepaRG und Upcyte Hepatozyten) in der üblichen, zweidimensionalen Zellrasen-Konfiguration auf ihre Fähigkeit untersucht, in einfachen Zytotoxizitätsstudien hepatotoxische Effekte zu detektieren. Darüber hinaus zeigten Proteomanalysen der vier Zellmodelle, dass die Proteinexpression der Zelllinien erheblich vom Expressionsmuster primärer Hepatozyten abweicht, wobei der geringste Unterschied in HepaRG Zellen zu sehen war. Die Einführung einer dritten Dimension durch die Kultivierung von Späroiden ermöglicht den Hepatozyten die Ausbildung einer zelltypischen Polarität sowie eine enorme Vergrößerung der Interaktionsfläche zwischen benachbarten Zellen. Diese Veränderungen der zellulären Architektur haben einen positiven Einfluss auf die Langlebigkeit der Zellen mit einer stabilen Expression wichtiger fremdstoffmetabolisierender Enzyme und Transporter, was mittels Immunfluoreszenzfärbungen über einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen in PHH Sphäroiden und 28 Tagen in HepaRG Sphäroiden gezeigt werden konnte. Des Weiteren deuteten die Färbungen dreier Phase III Transporter (MDR1, MRP2 und BSEP) auf ein kanalikuläres Netzwerk in den Sphäroiden beider Zellmodelle hin. Eine dosisabhängige Induzierbarkeit wichtiger Cytochrom P450 Isoenzyme konnte zudem in HepaRG Sphäroiden auf Proteinebene mittels IF gezeigt werden, die jedoch auf mRNA Ebene im Vergleich zur Zellrasenkultivierung überwiegend geringer ausfiel. In einer vergleichenden Zytotoxizitätsstudie wurden HepaRG und PHH Sphäroide sowie HepaRG Zellrasen für maximal 14 Tage mit fünf hepatotoxischen Arzneimitteln behandelt und die Viabilität wurde and drei Zeitpunkten bestimmt (3, 7 und 14 Tage). Eine deutliche Zeitabhängigkeit der zytotoxischen Effekte konnte in allen getesteten Bedingungen dahingehend beobachtet werden, dass der EC50 Wert mit längerer Behandlungsdauer deutlich sank. Die beobachteten Effekte waren am deutlichsten in PHH Sphäroidkultur, die somit das sensitivste Zellkultursystem darstellte. Des Weiteren zeigten sich HepaRG Zellen in Sphäroidkultur sensitiver als in Zellrasenkultur, was wertvolle Hinweise auf die potentielle Anwendung von Sphäroiden als Langzeitkultur-Modell lieferte. Letztlich wurde die Proteinexpression dreier Antigene (CYP1A2, CYP3A4 und NAT 1/2) mittels der Western Blot Methode durchgeführt, um die basale Expression Dieser in drei verschieden Zellkulturformaten (2D, 3D und QV) in HepaRG Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zu vergleichen. Das QV Zellkulturformat ermöglicht einen pumpenbetriebenen Fluss des Zellkulturmediums, welcher dem Zellrasen mechanische Stimuli durch Scherkräfte sowie molekulare Stimuli durch die dynamische Zirkulation zuführt. Diese Stimuli zeigten einen deutlich positiven Effekt auf die Expression der untersuchten Antigene; zu jedem Zeitpunkt (Tag 3, Tag 7 und Tag 14) zeigten HepaRG Zellen im QV Format eine deutlich erhöhte Expression im Vergleich zur Kultivierung in 2D und 3D. Die Expression in HepaRG Sphäroiden zeigte zeitliche Schwankungen mit der generell höchsten Expression an Tag 7. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien liefern wertvolle Hinweise auf die erhöhte physiologische Relevanz in Abhängigkeit des Zellkulturformats: Dreidimensionalität sowie die Zirkulation des Zellkulturmediums führen zu einem physiologisch relevanteren Phänotyp der hepatischen Zellmodelle. Diese Zellkulturformate können in der präklinischen Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden, um zu früheren Zeitpunkten humanrelevantere Informationen zu erhalten und somit den Entwicklungsprozess effizienter gestalten. Weitere Studien sind jedoch nötig, um ein neues Zellkulturformat umfangreich zu charakterisieren, zu validieren und zu standardisieren, damit Dieses Anwendung in der industriellen Routine finden kann.

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Metadaten
Verfasserangaben:Esther Johann
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-54035
Betreuer:Dieter Schrenk, Stefan Otto Müller
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Englisch
Veröffentlichungsdatum (online):23.10.2018
Jahr der Veröffentlichung:2018
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:13.08.2018
Datum der Publikation (Server):25.10.2018
Seitenzahl:XVI, 209
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Chemie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Klassifikation (Mathematik):92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES
Lizenz (Deutsch):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell (CC BY-NC 4.0)