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Analyse und biochemische Charakterisierung der Protein‐Komponenten eines Diversitätsgenerierenden Retroelements aus Nostoc sp. PCC 7120

  • Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) wurden im Jahre 2002 in Bordetella‐Phagen entdeckt und stellen eine einzigartige Klasse unter den Retroelementen dar. Durch einen speziellen „Copy‐and‐ Replace“ Mechanismus sind sie in der Lage ein bestimmtes Zielgen zu hypermutieren. Bei diesem Mutagenic Homing‐Prozess wird die RNA der Templat‐Region (TR) durch die elementeigene reverse Transkriptase (RT) transkribiert. Die dabei entstandene mutierte cDNA wird anschließend in die variable Region (VR) des Zielgens inkorporiert und dieses somit diversifiziert. Hierbei steht der experimentelle Nachweis für die Hypermutation durch die RT noch aus. Zudem spielt das akzessorische Protein (Avd) eine weitere wichtige Rolle im Mutagenic Homing Prozess, wobei dessen tatsächliche Funktion noch nicht charakterisiert werden konnte. Bis dato gibt es vor allem Analysen in Bezug auf das Bordetella‐Phagen DGR, womit sich die Frage nach anderen Systemen und allgemeiner Anwendbarkeit stellt. Daher war die Analyse des Nostoc sp. PCC 7120 DGR Hauptgegenstand dieser Arbeit, wobei der Fokus auf der Untersuchung der reversen Transkripase (nRT), sowie der Charakterisierung des akzessorischen Proteins (nAvd) aus dem Nostoc sp. PCC 7120 DGR lag. Die nRT konnte überexprimiert werden, wobei sie nur teilweise löslich vorlag. Eine effektive Aufreinigung der nRT konnte mit den hier getesteten Methoden nicht erzielt werden, sodass andere Aufreinigungsmethoden erprobt werden müssen. Zudem war die nRT nicht lagerfähig, wodurch eine regelmäßige neue Proteinpräparation nötig war. In Aktivitätsstudien konnten erste Hinweise auf eine Aktivität der nRT erhalten werden. Dabei konnten die entstandenen Nukleinsäuren nicht nur detektiert, sondern auch mittels analytischem Verdau als DNA identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die synthetisierte cDNA mittels PCR amplifiziert und die PCR‐Produkte anschließend sequenziert werden. Hierbei wurden jedoch keine Adenin‐spezifischen oder sonstigen Mutationen beobachtet. Somit konnte kein Nachweis für Hypermutation durch die RT erbracht werden. Bei Untersuchungen bezüglich einer möglichen Interaktion zwischen nRT und nAvd konnte keine erhöhte nRT‐Aktivität durch die nAvd festgestellt werden. Die Untersuchungen der nAvd zeigten, dass diese Nukleinsäuren bindet. Hierbei waren Präferenzen gegenüber verschiedenen Nukleinsäuren zu beobachten. Vor allem RNA/DNA‐Hybride zeigt die höchste Affinität gegenüber der nAvd, während dsDNA eine höhere Affinität zur nAvd aufweist als ssRNA. Zudem ist die nAvd in der Lage Nukleinsäuren zu hybridisieren. Hierbei hybridisiert sie ATreiche DNA‐Moleküle von mittlerer Länge (48 bp) am effizientesten. Ein von der nAvd katalysierter Strangaustausch konnte nicht beobachtet werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die nAvd selbst bis 95 °C hitzestabil ist und im Anschluss an Hitzestress weiterhin Nukleinsäuren hybridisieren kann. Darüber hinaus ist sie befähigt Nukleinsäuren unter Hitzestress zu stabilisieren. Diese Ergebnisse lassen auf eine Rolle der nAvd als Lotse oder zur Stabilisierung von Nukleinsäuren schließen.

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Metadaten
Author:Lisa Jakobi
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-45300
Advisor:Nora Zingler
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Publication Date:2017/01/05
Year of Publication:2017
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2016/12/09
Date of the Publication (Server):2017/01/05
Tag:DGR
Number of page:161
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Licence (German):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vom 30.07.2015