Die kleinen nichtkodierenden RNAs im Regulon des Zwei-Komponenten Systems CiaRH in Streptococcus pneumoniae

  • Das Zwei-Komponenten System CiaRH von S. pneumoniae ist an der ß-Laktam-Resistenz, Regulation der genetischen Kompetenz, Lyse und Virulenz beteiligt. Unter den 16 Promotoren, die von diesem System kontrolliert werden, befanden sich die fünf stärksten Promotoren in intergenen Regionen. Hieraus resultierte die Vermutung, dass diese Promotoren die Expression von kleinen nichtkodierenden RNAs steuern könnten. Mittels Northern-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass von diesen Promotoren aus kleine RNAs mit einer Größe von 87 bis 151 Basen exprimiert werden. Im Stamm mit deletierten ciaR waren diese RNAs nicht bzw. kaum detektierbar. Die fünf CiaRH-abhängigen kleinen RNAs wurden csRNAs benannt (cia controlled small RNAs). Durch Northern-Analyse an vier verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums konnte gezeigt werden, dass die csRNAs in hoher Konzentration sowohl während der exponentiellen als auch in der stationären Wachstumsphase in den Zellen von S. pneumoniae vorhanden sind. Mittels 3´-RACE-Analyse wurde die Länge der csRNAs auf die Base genau bestimmt. csRNA1, csRNA2, csRNA3 und csRNA4 bestehen aus 87 bis 101 Nukleotiden. csRNA5 besitzt dagegen eine Länge aus 151 Basen. Die Promotoren der stromabwärts der kleinen RNAs liegenden Gene wurden mittels 5´-RACE-Analyse kartiert und ihre Expression mittels realtime RT-PCR-Analyse im Wildtyp, im ciaR-Deletionsstamm und einem Stamm mit aktiviertem CiaRH-System untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass diese Gene unabhängig von CiaRH exprimiert werden. Um die Beteiligung der csRNAs an den CiaRH-assoziierten Phänotypen aufzuklären, wurden die Gene für alle fünf csRNAs deletiert und mit verschiedenen Antibiotika-Resistenz-Genen ersetzt. Durch Kombination aller Deletionen wurde der Stamm S. pneumoniae RK12345 konstruiert, welcher keine csRNA mehr exprimiert. In Stamm RK12345 konnte eine erniedrigte Transformationseffizienz und eine erhöhte Lyserate im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae R6 beobachtet werden. Hierdurch wurde gezeigt, dass die csRNAs eine Rolle bei den CiaRH-regulierten Prozessen spielen. Kleine RNAs üben ihren regulatorischen Effekt meist durch Wechselwirkung mit der mRNA ihrer Zielgene aus. Die beiden RNA-Moleküle interagieren hierbei über komplementäre Sequenzbereiche. Durch diese Basenpaarungen kommt es zur Hemmung oder Aktivierung der Translation bzw. zum Abbau des RNA-RNA-Interaktionskomplexes. Um die Ursachen der csRNA-vermittelten phänotypischen Veränderungen bestimmen zu können, wurde die Identifizierung der csRNA-Zielgene angestrebt. Mittels bioinformatischer Analyse wurde eine große Anzahl putativer Zielgene vorhergesagt, wovon nach Anlegung verschiedener Kriterien letztendlich 13 zu den weiteren Untersuchungen eingesetzt wurden. Um diese teilweise uncharakterisierten Gene auf eine posttranskriptionelle Regulation durch die csRNAs untersuchen zu können, wurde ein integratives Translations Probe Plasmid namens pTP3 konstruiert. Dieses Plasmid ermöglicht die Klonierung von 5´-Genfragmenten vor das ´lacZ-Gen, wodurch in frame-Zielgen´-´lacZ-Fusionsproteine entstehen. Die Expression des entstandenen Fusionsgens erfolgt hierbei von einem konstitutiven CiaRH-unabhängigen Promotor, namens PvegT. Die Klonierung und Untersuchung der ß-Galaktosidase- Expression der Zielgen´-´lacZ-Fusionsproteine ergab, dass die klonierten Fragmente der Gene spr0081, comC, spr1645 und cibB durch die csRNAs reguliert werden. Die Untersuchung dieser vier Zielgene bei Expression von den eigenen Promotoren und Intaktheit der entsprechenden mRNAs zeigte, dass letztendlich zwei Gene posttranskriptionell negativ durch die csRNAs reguliert werden. Interessanterweise ist eines dieser Zielgene das comC-Gen, welches für das Vorläuferpeptid des Kompetenz-Phäromons CSP kodiert. Diese Beobachtung könnte eine mögliche Ursache für die csRNA-abhängige veränderte Transformierbarkeit von Stamm RK12345 darstellen. Das zweite Zielgen der csRNAs, spr0081, kodiert für einen bisher uncharakterisierten ABC-Transporter, welcher möglicherweise am Transport eines Kohlenhydrats beteiligt ist. Letztendlich wurde die direkte Interaktion der in vitro produzierten mRNA dieser beiden Zielgene mit den csRNAs durch die Entwicklung und Etablierung einer neuartigen Methode der Bandshift-Analyse untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass die mRNA von comC mit allen fünf csRNAs Interaktions-komplexe bildet und die mRNA von spr0081 befähigt ist mit vier csRNAs Interaktionskomplexe zu bilden. Schließlich wurde der Effekt einzelner RNAs auf die Expression des ComC´-´lacZ-Fusionsproteins getestet. Hierbei konnte gezeigt werden, dass csRNA1, csRNA2 und csRNA3 einerseits bzw. csRNA4 und csRNA5 andererseits genügen, um den Effekt aller fünf RNAs ausüben zu können. Die stärkste Hemmungsaktivität einer einzelnen csRNA konnte bei csRNA4 festgestellt werden.

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Metadaten
Author:Márta Kovács
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-23360
Advisor:Regine Hakenbeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2009
Year of Publication:2009
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2009/05/08
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $