Das Zwei-Komponenten-System CiaRH von Streptococcus pneumoniae: Globale Transkriptionsanalysen und phänotypische Charakterisierungen

The Two-Component System CiaRH from Streptococcus pneumoniae: Global Transcription Analysis and Phenotypical Characterisations

  • Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem signaltransduzierenden Zwei-Komponenten- System CiaRH aus Streptococcus pneumoniae. Zwei-Komponenten-Systeme sind an der Adaptation der Bakterien an Umweltbedingungen entscheidend beteiligt. Sie bestehen in der Regel aus einer Histidinkinase (hier CiaH) und einem Responseregulator (hier CiaR). Die Histidinkinase dient der Signaldetektion und Aktivierung des Responseregulators, welcher die zelluläre Antwort vermittelt. Das Cia-System wurde als Resistenzdeterminante in spontanresistenten Labormutanten gegen Cefotaxim identifiziert. Weiterhin hat dieses Zwei-Komponenten-System Einfluss auf die Zelllyse, die Virulenz und ist an der Regulation der genetischen Kompetenz beteiligt. Es wird für die Lebensfähigkeit von Zellen mit PBP2x-Punktmutationen benötigt. Inhaltlicher Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war neben der Etablierung der Mikroarray-Technik und globalen Transkriptionsanalysen die funktionelle Charakterisierung des Cia-Systems mit phänotypischen Analysen. Die Etablierung der Mikroarray-Technik befasste sich mit allen Schritten des Mikroarray-Prozesses inklusive Biochip-Herstellung, Datenauswertung und der Validierung des Oligo-Sets. Nach erfolgreicher Etablierung wurde diese Technik benutzt, um Cia-regulierte Gene zu identifizieren. Durch Vergleich des Transkriptoms von verschiedenen Cia-Mutanten mit dem Wildtyp R6 wurden insgesamt 158 Gene unterschiedlich transkribiert. Davon gehörten 73 Gene zum minimalen Cia- und zum Kompetenz-Regulon, welche schon als Cia-reguliert bekannt waren (Sebert et al., 2002; Mascher et al., 2003; Dagkessamanskaia et al., 2004). Überraschenderweise wurden weitere 85 Gene Cia-abhängig transkribiert, deren Genprodukte funktionell in Zucker- und Stickstoffmetabolismus sowie Transport gruppiert werden konnten. Wahrscheinlich wurden die meisten dieser 85 Gene indirekt als Folge der veränderten Zuckerverwertung reguliert. Ähnliche funktionelle Gengruppen konnten in den globalen Transkriptionsanalysen der spontanresistenten Laborfamilie C103 bis C503 aufgestellt werden. In dieser Mutantenfamilie sind Mutationen in CiaH, PBP2x und PBP2a gefunden worden. Besonders auffällig war bei diesen Untersuchungen die kontinuierliche Verstärkung der Transkription der Gene des minimalen Cia-Regulons von C103 bis C503. Deshalb ist von einer Aktivierung des Cia-Systems durch PBP-Mutationen auszugehen. Diese Aktivierung konnte auch in RT-PCR-Versuchen am Beispiel einzelner Gene des minimalen Cia-Regulons bestätigt werden. Da das Cia-System durch PBP-Mutationen aktiviert wird und ein funktionelles Cia-System bei Anwesenheit von bestimmten PBP2x-Mutationen benötigt wird, wurde in dieser Arbeit diese Notwendigkeit des Cia-Systems auch bei anderen PBP-Mutationen durch phänotypische Analysen überprüft. Dabei wurde durch Inaktivierung des Cia-Systems in verschiedenen Stämmen festgestellt, dass nicht nur Zellen mit einzelnen, im Labor selektierten PBP2x-Mutationen, sondern auch ohne ein PBP2a- und ohne ein PBP1a-Protein auf ein Cia-System angewiesen sind. Klinische PBP2x-Allele benötigten ebenfalls – aber in geringeren Maßen – das Cia-System. Wahrscheinlich haben in diesen kompensatorische Mutationen durch Evolution in der freien Natur stattgefunden. Damit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass PBP-Mutationen nicht neutral sind und verschiedene PBP-Mutationen unterschiedliche Auswirkungen haben. Weiterhin wurde untersucht, welche Gene tatsächlich die durch das Cia-System verursachten Phänotypen auslösen. Dazu wurden 6 Cia-regulierte Genregionen bzw. Einzelgene mit einer Erythromycin-Resistenzkassette inaktiviert und auf das Vorhandensein von Cia „OFF“-phänotypischem Verhalten analysiert. Kein Gen konnte für das Resistenz- oder das Lyseverhalten ausfindig gemacht werden. Hingegen waren die Proteine HtrA und Spr0782 an der Reprimierung der Kompetenz durch das Cia-System beteiligt. Bei beiden Proteinen konnte nur eine Reprimierung in CpH8- und nicht in THB-Medium nachgewiesen werden, so dass eventuell noch von weiteren Faktoren ausgegangen werden muss. Die hier vorgelegten Ergebnisse haben die bisher vorliegenden Daten über das Cia-System bestätigt und entscheidende Einblicke nicht nur in die mögliche Funktion, sondern vor allem in das komplexe vernetzte Regulationssystem gegeben. Diese stellen eine wichtige Grundlage für weitere Experimente dar.
  • The present work focused on the signal transduction two-component system CiaRH from Streptococcus pneumoniae. Two-component systems are crucially involved in the adaptation of bacteria to environmental conditions. They are normally composed of a histidine kinase (in this case CiaH) and a response regulator (in this case CiaR). The histidine kinase serves for the signal recognition and activation of the response regulator, which mediats the cellular answer. The Cia system was detected as a resistance determinant in spontaneous laboratory mutants against cefotaxime. Additionally this two-component system impacts cell lysis, virulence and the regulation of the genetic compentence. It is required for the viability in cells with PBP2x point mutations. The main focus of the present work was - next to the establishment of the microarray technique and global transcription analysis – the functional characterisation of the Cia-system with phenotypical analysis. The establishment of the microarray technique dealed with all steps of the microarray process inclusive the biochip manufacture, data analysis and validation of the oligo set. This technique was used to identify Cia regulated genes. In total 158 genes were detected as differentially transcribed through comparison of the transcriptoms of different Cia mutants with the wildtyp R6. 73 genes of these 158 belong to the minimal Cia and competence regulon, which are already described as Cia regulated (Sebert et al., 2002; Mascher et al., 2003; Dagkessamanskaia et al., 2004). Surprisingly additional 85 genes showed a Cia dependent transcription with gene products functionally grouped in sugar and nitrogen metabolism as well as transport. It is likely that these 85 genes are differentially transcribed as a consequence of the altered sugar metabolism. Similar functional gene groups could be identified in the global transcription analysis of the spontaneous laboratory mutants C103 to C503. In these mutant families mutations in CiaH, PBP2x and PBP2a are found. Of particular interest is the observation that the transcription of the genes of the minimal Cia regulon were continously activated from C103 to C503. Therefore a activation of the Cia system through PBP mutations appears likely. This activation could be confirmed in RT-PCR experiments with single genes of the Cia regulon. Because of the activation of the Cia system through PBP mutations and of the need of a functional Cia system in the presence of destinct PBP mutations the requirement of a functional Cia system was analysed with other PBP mutations in phenotypical experiments. Therein it came out that through inactivation of the Cia system in different strains not only cells with single PBP2x mutations, which were selected in the laboratory, but also cells without PBP2a or PBP1a are dependent on a Cia system. Cells with a clinial PBP2x allele require also but to a lesser extend the Cia system. Properly the clinical PBP2x allele contained compensatory mutations that reduce the requirement to the Cia system. These experiments show that PBP mutations are not neutral and that different PBP mutations have different effects. Additional experiments have analysed which genes are responsible for the Cia mediated phenotype. Therefore six Cia regulated gene regions or single genes were inactivated with a erythromycin resistance cassette and analysed on the presence of the “Cia OFF” phenotype. No gene could be identified for the resistence or lysis behaviour. ON the other hand the proteins HtrA and Spr0782 were part on the repression of the competence through the Cia systems. But with both proteins a repression could be detected only in CpH8 and not in THB medium. Therefore additional factors are assumed. The present results have confirmed already known facts about the Cia system and have shown significant insights not only into the possible function but also in the complex regulatory Cia system which is part of the information processing network of the cell. These are an important basis for further experiments.

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Metadaten
Author:Manuel Heintz
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-19991
Advisor:Regine Hakenbeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/07/10
GND-Keyword:DNS-Chip ; Lyse <Biologie> ; Microarray ; Penicilline; Streptococcus pneumoniae ; Transformation <Genetik>
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $