Die Entwicklung von beta-Laktam-Resistenz in dem Pathogen Streptococcus pneumoniae (S. pneu-moniae) stellt einen komplexen Prozess dar, welcher auf einer Modifikation der Penicillin-Bindeproteine (PBP), der Targetstrukturen von beta-Laktam-Antibiotika beruht. PBP sind Membran-gebundene Enzyme, welche essentielle Reaktionen bei der bakteriellen Zellwand-Synthese katalysieren. Diese Proteine werden im Zuge der Resistenzentstehung so verändert, dass beta-Laktame nicht mehr oder nur noch mit geringer Affinität gebunden werden, das physiologische Substrat aber noch erkannt werden muß. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem PBP2x von S. pneumoniae, das als essentielles PBP und wichtigste primäre Resistenzdeterminante einen hohen Stellenwert bei der Entstehung von beta-Laktam-Resistenz in diesem Organismus einnimmt. Obwohl dieses PBP zu den am besten untersuchten PBP gehört, bleiben die Resistenzrelevanz einzelner Punktmutationen und die mit der Veränderung des Proteins einhergehenden physiologischen Folgen für die Zelle weitgehend unklar. Zentraler Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des Effekts von PBP2x-Mutationen auf die Resistenz, Funktionalität von PBP2x und Zellphysiologie im Kontext mit der sekundären Resistenzdeterminante PBP1a und den beiden Zwei-Komponenten-Systemen CiaRH, welches in die Cefotaxim-Resistenz, genetische Kompetenz und Virulenz involviert ist und ComDE, das die genetische Kompetenz reguliert. Besonderes Interesse galt dabei der Position Thr338, welche sich unmittelbar benachbart zum aktiven Serin befindet und in den meisten resistenten klinischen Isolaten zu Alanin, Prolin oder Glycin mutiert ist. Durch eine gerichtete Mutagenese dieser Position im Wildtyp R6 konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Thr338-Punktmutation einen selektionierbaren Resistenz-Phänotyp in vivo vermittelt, wobei abhängig von dem jeweiligen Austausch unterschiedliche Resistenzniveaus und Kreuzresistenzspektren zu beobachten waren. Abgesehen von einem nur moderaten Beitrag zur Resistenz, betraf eine solche Substitution offenbar auch die Funktionalität von PBP2x, was sich auf dramatische Art und Weise in Abwesenheit eines intakten CiaRH-Regulationssystems äußerte: Es kam zu Wachstumsdefekten, insbesondere einer verfrühten und verstärkten Autolyse, morphologischen Aberrationen und einer verminderten Lebensfähigkeit. Entgegen aller Erwartungen führte die Präsens eines Mosaik-PBP1a in dem genetischen Hintergrund der Thr338-Mutation nicht zu einem weiteren Anstieg der Resistenz, sondern bewirkte sogar einen leichten Abfall. Dennoch komplementierte das Mosaik-PBP1a die durch das Fehlen eines funktionsfähigen CiaRH-Systems hervorgerufenen Wachstumsdefizienzen. Der Vergleich zwischen dem PBP2x mit Thr338-Punktmutation und einem Mosaik-PBP2x deckte gravierende Unterschiede im Hinblick auf das Resistenzpotential und die physiologischen Auswirkungen auf. Anders als bei der PBP2x-Punktmutation waren bei dem Mosaik-PBP2x fast keine Wachstumseinbußen zu verzeichnen, wenn es mit einem inaktiven Zwei-Komponenten-System CiaRH kombiniert wurde, und die Anwesenheit eines Mosaik-PBP1a brachte eine starke Erhöhung der Cefotaxim-Resistenz mit sich. Beiden pbp2x-Allelen war jedoch gemeinsam, dass die Abwesenheit eines PBP1a massive Defekte im Wachstum zur Folge hatte. Alle diese Beobachtungen deuteten auf eine mögliche Interaktion zwischen PBP2x und PBP1a hin. Die Analyse der Zellwand einer Mutante mit zwei PBP2x-Aminosäureaustauschen, von denen einer in resistenten klinischen Stämmen anzutreffen ist, ergab eine biochemisch modifizierte Zellwand, in der bei einem fast gleichbleibenden Anteil an verzweigten Dimeren, Monomere erhöht, und lineare Dimere und Trimere reduziert waren. Diese Befunde ließen auf eine enzymatische Beeinträchtigung dieses PBP2x schließen. Ein von CiaRH ausgehender Effekt konnte nicht festgestellt werden. Eine Inaktivierung des für den Export des Kompetenz-stimulierenden Peptids CSP verantwortlichen ABC-Transporters ComAB in Kombination mit einem nicht-funktionellen CiaRH-System bewirkte im Wildtyp eine vollständige, in PBP2x-Punktmutanten eine nur teilweise Aufhebung der vorzeitigen stationären Phase-Autolyse. Darüber hinaus machte sich bei einem der PBP2x-Derivate, welches zusätzlich über eine Cefotaxim-Resistenz-vermittelnde Aminosäuresubstitution in CiaH verfügte, bei ciaR-Inaktivierung sowohl ein Verlust der CiaH- als auch eine partielle Einbuße der PBP2x-Resistenz bemerkbar, bei comAB-Inaktivierung hingegen aber ausschließlich ersteres. Hieraus konnte zum einen auf einen direkten Bezug des Lyse-Phänotyps zu der Kompetenz und der CiaRH-Resistenz zu ComAB geschlossen werden, zum anderen auf einen CiaRH-unabhängigen Einfluss von PBP2x auf die Kompetenz und Autolyse. Tatsächlich bestätigte eine Bestimmung der Transformationseffizienz von Mutanten mit verschiedenen Konstellationen aus niederaffinen und unmodifizierten PBP, dass das Kompetenzmuster bzw. -ausmaß von der jeweiligen PBP-Ausstattung moduliert wird. Auch eine Microarray-basierte globale Transkriptomanalyse dieser Mutanten sowie spontan resistenter Labormutanten mit PBP2x- und CiaH-Mutationen suggerierte eine von CiaRH-entkoppelte Einflussnahme der PBP auf die Kompetenz. Zudem zeugten die Transkriptionsmuster von einem vielschichtigen Regulationsnetzwerk der Resistenzentwicklung unter Beteiligung von Kompetenz, Bakteriocinproduktion, Virulenz, Metabolismus, Transportprozessen und Energiestatus, was möglicherweise eine indirekte Folge einer gestörten Zellwand- und Membranintegrität darstellt. Durch die Extraktion von intergenen Bereichen, sowie potentiellen neuen Resistenzdeterminanten bzw. Resistenz-unterstützenden Genen, wie den Gen-Clustern spr1545-spr1549 und spr0096-spr0110 oder den Genen des Purinstoffwechsels wurde die Basis für weiterführende Untersuchungen geschaffen. Die hier vorgestellten Daten demonstrieren, dass der Erwerb von beta-Laktam-Resistenz nicht nur von Vorteil ist, sondern auch physiologische Konsequenzen für die Zelle hat, die sie kompensiert, um ein möglichst stabiles Wachstum zu gewährleisten. Über die Zellwand-Zusammensetzung und Kompetenz konnte erstmalig eine Verbindung von PBP2x zu CiaRH hergestellt werden. Eine konkrete kompensatorische Wirkung dieses Regulons hinsichtlich PBP2x-Mutationen wurde mit der Repression der Kompetenzlyse ausfindig gemacht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde basierend auf einer früheren Veröffentlichung, in der eine Inaktivierung des Gens für das PBP2b von S. pneumoniae erfolglos blieb, erneut versucht, eine solche Mutante herzustellen. Obwohl lebensfähige Transformanten generiert werden konnten, war es nicht möglich eine pbp2b-Inaktivierungs- bzw. Deletionsmutante zu isolieren, sodass PBP2b in diesem Organismus weiterhin als essentielles Protein angesehen werden kann.

I) Die Untersuchungen zum vakuolären Malat-Carrier AtTDT unterstützen die Annahme, dass seine Aktivität in den Schließzellen zum Öffnen und Schließen der Stomata beiträgt. Zudem erhöht wahrscheinlich die Aktivität von TDT in den Mesophyllzellen die Stomata-Dichte und den Stomata-Index. Im Rahmen einer osmotischen Anpassung vermittelt der Transporter eine Malat-Akkumulation, die in den TDT-Knockout-Mutanten beeinträchtigt ist und durch erhöhte Citrat-Gehalte kompensiert wird. Darüber hinaus beschleunigt TDT unter Kurztag-Bedingungen den Eintritt in die generative Phase. Eine Funktion von TDT in der Salztoleranz kann nach metabolischen und phänotypischen Analysen ausgeschlossen werden. II) Die tonoplastidären Monosaccharid-Transporter regulieren bei Kälte in Blättern nicht nur die Monosaccharid-Gehalte, sondern wirken auch positiv auf Photosynthese und Stärkegehalte. Das Ausschalten der TMT-Gene führt unter den gewählten Kältebedingungen zu einer erhöhten Synthese von Saccharose und zu einer gesteigerten Respirationsrate. Insbesondere unter Wassermangel wirkt sich die Aktivität der tonoplastidären Monosaccharid-Transporter positiv auf die Keimungsrate aus. III) Die Bestimmung von Zuckergehalten in Blättern indiziert, dass die tonoplastidären Transportproteine AtERD6.7 und BvIMP Glukose aus der Vakuole transportieren, während AtERD6.5 womöglich Fruktose aus der Vakuole transportiert. Als Transportmechanismus wird aufgrund der Homologie zu den GLUT-Proteinen eine erleichterte Diffusion angenommen. Die Aktivität der Carrier scheint insbesondere nach Kältephasen von Bedeutung zu sein, wenn vakuolär gespeicherte Zucker mobilisiert werden. ERD6.7 fördert gemäß den durchgeführten Keimungstests die Samen-Dormanz.

The structural integrity of synaptic connections critically depends on the interaction between synaptic cell adhesion molecules (CAMs) and the underlying actin and microtubule cytoskeleton. This interaction is mediated by giant Ankyrins, that act as specialized adaptors to establish and maintain axonal and synaptic compartments. In Drosophila, two giant isoforms of Ankyrin2 (Ank2) control synapse stability and organization at the larval neuromuscular junction (NMJ). Both Ank2-L and Ank2-XL are highly abundant in motoneuron axons and within the presynaptic terminal, where they control synaptic CAMs distribution and organization of microtubules. Here, we address the role of the conserved N-terminal ankyrin repeat domain (ARD) for subcellular localization and function of these giant Ankyrins in vivo. We used a P[acman] based rescue approach to generate deletions of ARD subdomains, that contain putative binding sites of interacting transmembrane proteins. We show that specific subdomains control synaptic but not axonal localization of Ank2-L. These domains contain binding sites to L1-family member CAMs, and we demonstrate that these regions are necessary for the organization of synaptic CAMs and for the control of synaptic stability. In contrast, presynaptic Ank2-XL localization only partially depends on the ARD but strictly requires the presynaptic presence of Ank2-L demonstrating a critical co-dependence of the two isoforms at the NMJ. Ank2-XL dependent control of microtubule organization correlates with presynaptic abundance of the protein and is thus only partially affected by ARD deletions. Together, our data provides novel insights into the synaptic targeting of giant Ankyrins with relevance for the control of synaptic plasticity and maintenance.

Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse genetischer Veränderungen in der Familie P006 von Piperacillin-resistenten Mutanten von S. pneumoniae R6. Jede der fünf Mutanten P106 bis P506 dieser Familie wurde aus dem jeweiligen Parentalstamm auf ansteigender Konzentration des lytischen ß-Lactams Piperacillin isoliert und zeichnete sich durch eine jeweils höhere minimale Hemmkonzentration (MHK) für Piperacillin aus (Laible et al., 1987). In Mutante P106 konnte mit CpoA bereits eine Resistenzdeterminante für Piperacillin identifiziert werden, welche nicht zu den klassischen Targets der ß-Lactamantibiotika, den Penicillin-Bindeproteinen (Pbp), zählt (Grebe et al., 1997). Die Mutanten P206 und P306 zeigten aufgrund von Mutationen in Pbp2b und Pbp2x eine höhere Resistenz gegen Piperacillin (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). In dieser Arbeit standen die Identifizierung und Charakterisierung der bisher unbekannten Resistenzdeterminante für Piperacillin in Mutante P406 und die Charakterisierung der bisher nur unzulänglich untersuchten Nicht-Pbp-Resistenzdeterminante CpoA in Mutante P106 im Mittelpunkt der Analysen. Im Fall der bereits identifizierten Resistenzdeterminante in Mutante P106 handelt es sich um das für eine Glykosyltransferase kodierende Gen cpoA. Die Herstellung einer cpoA-Deletionsmutante, sowie deren Charakterisierung, sollten zur Aufklärung des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus in P106 und der Funktion von CpoA beitragen. Durch die Herstellung der cpoA-Deletionsmutante und die Bestimmung der MHK für Piperacillin konnte gezeigt werden, daß ein Ausfall der durch CpoA katalysierten Reaktion einen Anstieg der MHK für Piperacillin in S. pneumoniae R6 bewirkt. Die eingehende phänotypische Charakterisierung zeigte, daß die cpoA-Deletionsmutante zudem eine reduzierte genetische Kompetenz, eine reduzierte Säuretoleranz, einen höheren Bedarf an zweiwertigen Mg-Ionen, eine längere Generationszeit und eine verlangsamte Autolyse im Vergleich zu S. pneumoniae R6 besitzt. Diese Beobachtungen, sowie die Ergebnisse einer Microarray-basierten, globalen Transkriptomanalyse lassen es unter Berücksichtigung der biochemischen Charakterisierung von CpoA (Edman et al., 2003) als wahrscheinlich erscheinen, daß CpoA an der Synthese von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, einem der Hauptglycolipide der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae beteiligt ist. Die Deletion von cpoA könnte demzufolge auch einen Effekt auf die Menge der Lipoteichonsäuren in der Zellwand von S. pneumoniae besitzen, da der Precursor von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, das α-Monoglucosyl-Diacylglycerin vermutlich den Lipidanker der Lipoteichonsäuren darstellt. Basierend auf dieser Annahme konnte ein Modell zur Funktion von CpoA erstellt werden, welches eine Erklärung des Resistenzmechanismus für Piperacillin in Mutante P106, bzw. in der cpoA-Deletionsmutante ermöglichen würde. In Mutante P406 konnten weitere Veränderungen der Pbps bereits ausgeschlossen werden (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse aller fünf Mutanten der Familie P006 konnten Gene identifiziert werden, deren Transkripte im Vergleich zu S. pneumoniae R6 nur in P406 signifikant veränderte Mengen aufwiesen: Unter diesen Genen befanden sich sechs Gene, welche aufgrund ihrer geclusterten Anordnung im Genom von S. pneumoniae als putative funktionelle Einheit (TCS11-Cluster) angesehen wurden. Diese Gene zeigten eine bis zu 22-fach erhöhte Transkriptmenge in Mutante P406. Zudem konnten nur in Mutante P406 von Genen des an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten lic1-Operons eine bis zu 7,9-fach höhere Transkriptmenge beobachtet werden. Keines der Genprodukte des TCS11-Clusters wurde bisher charakterisiert. Aufgrund von Blast- und Domänen-Analysen konnten den Genprodukten putative Funktionen zugeschrieben werden. Die Gene smp11A und smp11B kodieren für zwei putative Membranproteine von 63 und 64 Aminosäuren. Die Gene nbp11 und msp11 kodieren für die ATPase- und die Permease-Komponente eines putativen ABC-Transporters. kin11 und reg11 kodieren für die Histidin-Kinase und den Response-Regulator des bisher uncharakterisierten Zweikomponentensystems 11 (TCS11) in S. pneumoniae. Die Gene sind in der Reihenfolge smp11A, smp11B, nbp11, msp11, kin11 und reg11 auf dem Minus-Strang im Genom von S. pneumoniae lokalisiert. Die Deletion der Gene kin11 und reg11 des TCS11 in P406 führte zum Abfall der MHK für Piperacillin auf die MHK des Parentalstamms P306. Somit konnte die Beteiligung des TCS11 in S. pneumoniae an einem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin nachgewiesen werden. Die Deletion von nbp11 in P406 führte ebenfalls zum Abfall der MHK für Piperacillin, womit einerseits auch für Nbp11 eine Beteiligung an dem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin gezeigt werden konnte und andererseits eine transkriptionelle Regulation der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 durch das TCS11 vermutet werden konnte. Durch eine konstitutive, gemeinsame Überexpression der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 in S. pneumoniae R6 wurde gezeigt, daß die Überexpression dieser Gene hinreichend für eine Erhöhung der Resistenz gegen Piperacillin ist. Durch 5´-RACE-Analysen konnten die beiden Transkriptionsstartpunkte P11.1 und P11.2 im Bereich des TCS11-Clusters kartiert werden. P11.1 befindet sich 20bp upstream von smp11A und P11.2 befindet sich 441bp upstream von kin11 innerhalb von msp11. Eine Northern-Analyse und die Durchführung von PCR auf cDNA zeigte, daß die Gene des TCS11-Clusters in zwei überlappenden Transkriptionseinheiten transkribiert werden. Die Gene kin11 und reg11 sind zusammen mit einer downstream von reg11 liegenden Kopie des repetetiven Elements rupA im 11-2-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.2 inklusive des ungewöhnlich langen Leaders von 441bp transkribiert. smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 sind im 11-1-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.1 transkribiert. Die Zugehörigkeit von kin11 und reg11 zum 11-1-Operon konnte hingegegen bei den verwendeten Wachstumsbedingungen nicht gezeigt werden. Es konnte bereits gezeigt werden, daß phosphoryliertes Reg11 (Reg11-P) an die Promotor-Region von P11.1 bindet (Marciszewski, Diplomarbeit 2007). Die Bestimmung der Aktivität von P11.1 in S. pneumoniae R6, sowie in kin11-, reg11- und kin11reg11-Deletionsmutanten zeigte, daß P11.1 einer direkten, positiven Regulation durch das TCS11 unterliegt. Durch Sequenzvergleiche der Promotor-Region von P11.1 mit den DNA-Regionen putativer Promotoren von zum TCS11-Cluster ähnlich organisierten Clustern homologer Proteine in Genomen anderer Gram-positiver Bakterien konnten drei hoch konservierte Sequenzabschnitte identifiziert werden, von welchen gezeigt werden konnte, daß sie für die Bindung von Reg11-P in S. pneumoniae essentiell sind. Vermutlich stellt die Konsensus-Sequenz ATGACA(2)TGTCAT(8-9)GTGACA die DNA-Bindestelle von Reg11-P dar. Es konnten keine weiteren, zu 100 % konservierten Sequenzen dieser Art im Genom von S. pneumoniae gefunden werden. In EMSA-Assays mit weniger konservierten Sequenzen dieser Art konnte keine Bindung von Reg11-P beobachtet werden. Somit handelt es sich bei der Bindestelle an P11.1 vermutlich um die einzige Bindestelle von Reg11-P im Genom von S. pneumoniae. Von P11.2 konnte durch die Bestimmung der Promotor-Aktivität in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters gezeigt werden, daß auch dieser Promotor einer Regulation unterliegt, welche jedoch nicht durch die Bindung von Reg11-P, oder von unphosphoryliertem Reg11 vermittelt wird. Die Aktivität von P11.2 ist hierbei jedoch einerseits Abhängig von der Anwesenheit von Kin11 und andererseits entweder von der Funktion der Membranproteine Smp11A und Smp11B, oder von der durch Nbp11/Msp11 transportierten unbekannten Substanz. Die Bestimmung der Promotor-Aktivität von P11.2 in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters und die unterschiedlichen phänotypischen Effekte einer kin11-, reg11- und einer kin11reg11-Deletionsmutante zeigten, daß unphosphoryliertes Reg11 ebenfalls in der Lage sein muß, die Transkription von noch unbekannten Zielgenen durch Bindung an eine weitere, unbekannte DNA-Bindestelle zu regulieren. Sowohl durch die Deletion eines Großteils des 441nt langen Leaders des Transkripts des 11-2-Operons, als auch durch die Deletion zweier verschiedener Abschnitte des 3´-untranslatierten Bereichs dieses Transkripts konnte gezeigt werden, daß der 5´- und der 3´-untranslatierte Bereich an noch unbekannten regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die Deletion einzelner Gene des TCS11-Clusters, sowie die gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 bewirkten die gleichen phänotypischen Effekte wie die charakterisierte cpoA-Deletionsmutante. So konnte in Wachstumsexperimenten der gleiche Einfluß auf die Generationszeit, die maximale Zelldichte und die Autolyse, wie in der cpoA-Deletionsmutante, gezeigt werden. Die Microarray-basierte Transkriptomanalyse zweier Deletionsmutanten von Genen des TCS11-Clusters zeigte zudem, daß sich infolge dieser Deletionen größtenteils die Transkriptmengen solcher Gene ändern, welche auch auf eine Deletion von cpoA reagieren. Hierzu zählen neben zahlreichen Genen für Proteine unbekannter Funktion die Gene des Kompetenzregulons, des blp-Clusters, sowie des Cholinbindeproteins PcpA und der Subtilisin-artigen Proteinase PrtA. Die in Mutante P406 beobachteten höheren Transkriptmengen von an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten Genen des lic1-Operons konnten durch die Deletion von kin11reg11 revidiert werden. Die konstitutive gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11, sowie die Bestimmung der Aktivität des Promotors P1spr1149 des lic1-Operons zeigte, daß die Transkription der Gene des lic1-Operons indirekt von der Menge an Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 abhängt. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß das TCS11-Cluster und die Glykosyltransferase CpoA an den gleichen, oder zumindest an sich beeinflussenden, Membran-assoziierten Vorgängen beteiligt sind. Folglich konnte durch die molekulargenetische Charakterisierung des in ähnlicher genetischer Organisation in Gram-positiven Bakterien weit verbreiteten TCS11-Clusters erstmals ein Hinweis auf die putative physiologische Funktion des TCS11-Clusters in S. pneumoniae erhalten werden.

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der PDE1C-Isoform in ZNS-Zellen zu untersuchen. Es sollte vor allem die Bedeutung der PDE1C als mögliches Target für die anti-neoplastische Therapie von ZNS-Tumoren näher beleuchtet werden. Die humanen Glioblastomzellinien SNB75, SF295, SF539 und SF268 wurden bezüglich ihrer PDE1- und PDE4-Isoenzymausstattung näher charakterisiert. Es zeigte sich, daß die Zellinien SNB75 und SF295 in ihrem PDE-Expressionsmuster sehr unterschiedlich sind: In der Zellinie SNB75 liegt die cAMP-hydrolytische Aktivität deutlich über jener in SF295-Zellen. Darüber hinaus weisen die SNB75-Zellen einen hohen Anteil Ca2+/CaM-stimulierbarer PDE1-Aktivität bei niedriger PDE4-Aktivität auf. Im Gegensatz dazu zeigt die Zellinie SF295, welche keine Ca2+/CaM-stimulierbare PDE-Aktivität besitzt, einen hohen prozentualen Anteil an Rolipram-hemmbarer PDE4-Aktivität. Darüber hinaus verhalten sich die beiden Zellinien auch bezüglich ihrer Gehalte an den „second messengern“ cAMP und cGMP komplementär. In den SNB75-Zellen ist der cAMP-Spiegel etwa um 2/3 niedriger als in den SF295-Zellen; der cGMP-Spiegel ist etwa doppelt so hoch wie der cAMP-Gehalt. In SF295-Zellen hingegen liegt der Gehalt an cGMP um etwa die Hälfte niedriger als der cAMP-Spiegel und ist somit vergleichbar mit dem cGMP-Gehalt der SNB75-Zellen. Auch die intrazelluläre Konzentration von Ca2+ ist in der Zellinie SNB75 höher als in SF295-Zellen. Die Untersuchung ausgelöster Ca2+-Transienten – mit besonderem Augenmerk auf den capacitativen Ca2+-Einstrom (CCE) – ergab, daß in SNB75-Zellen die Kapazität der intrazellulären Ca2+-Speicher und die Geschwindigkeit der Speicherentleerung größer sind als in SF295-Zellen. Auch der CCE ist in SNB75-Zellen größer als in der Zellinie SF295. An den beiden humanen Glioblastomzellinien SNB75 und SF295 wurden mittels Cytotoxizitätstests verschiedene PDE-Hemmstoffe auf ihr wachstumshemmendes Potential untersucht. Für den PDE4-Inhibitor DC-TA-46 konnte ein IC50-Bereich von 3-4.5 µM für die Hemmung des Zellwachstums ermittelt werden. Der als PDE1-Hemmstoff eingesetzte CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wies einen IC50-Wert für die Wachstumshemmung von 2-3 µM auf. Ein Zusammenhang zwischen PDE1 bzw. PDE4-Expression der Zellinien und dem wachstumshemmenden Potential der eingesetzten Substanzen war nicht erkennbar. Zur weiteren Charakterisierung der Zellinie SNB75 wurden der Karyotyp und die Verdopplungszeit der Zellinie bestimmt. Weiterhin wurde die cDNA der PDE1C aus der humanen Biopsieprobe TB1365 (anaplastisches Astrocytom) kloniert und das rekombinante Protein transient überexprimiert. An der rekombinanten PDE1C wurden – neben der Stimulierbarkeit des Proteins durch Ca2+/CaM (+ 130 %) – die beiden PDE-Hemmstoffe DC-TA-46 und Vinpocetin getestet. Diese beiden Substanzen hemmten die Aktivität der rekombinanten PDE1C um durchschnittlich 42 % (DC-TA-46) bzw. 28 % (Vinpocetin). Ein in vitro-Tiermodell zur näheren Untersuchung der PDE-Ausstattung und cAMP-Homöostase von nicht-malignen ZNS-Zellen und Glioblastomzellen sollte aus subkultivierten Ratten-Astrocyten und der Ratten-Glioblastomzellinie C6 entwickelt werden. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, entgegen Daten für Keratinocyten (Marko et al., 1998), daß die PDE-Aktivität in nicht-malignen Ratten-Astrocyten deutlich höher liegt als in der Glioblastomzellinie C6. Die Ratten-Astrocyten zeigen eine höhere Ca2+/CaM-stimulierbare PDE1-Aktivität. In der Zellinie C6 hingegen ist der PDE4-Anteil im Vergleich zu Ratten-Astrocyten höher. Diese Ergebnisse werden durch RT-PCR-Versuche gestützt. Die Gehalte der „second messenger“ cAMP, cGMP und Ca2+ sind in nicht-malignen Ratten-Astrocyten und malignen C6-Zellen vergleichbar. Allerdings weisen die C6-Zellen einen größeren CCE auf. Der Einsatz von DC-TA-46 in Cytotoxizitätstests weist sowohl in Ratten-Astrocyten als auch in C6-Tumorzellen vergleichbare Hemmwirkungen (IC50-Wert ~ 1.5 µM) auf. Der CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wirkt in subkultivierten Ratten-Astrocyten bereits in geringsten Konzentrationen wachstumshemmend; der IC50-Wert der Wachstumshemmung von C6-Zellen liegt bei 2.3 µM. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen allerdings, daß das untersuchte Ratten-Zellmodell – auch aufgrund der unterschiedlichen Kulturbedingungen, welche die PDE-Expression beeinflussen – nur mit Einschränkungen einsetzbar ist. Aufgrund der aktuellen Daten scheint die PDE1C als Target für eine anti-neoplastischen Therapie von ZNS-Tumoren kaum geeignet. Der Vergleich von nicht-malignen und malignen ZNS-Zellen deutet eher auf eine „down“-Regulation der PDE1C und eine „up“-Regulation der PDE4 hin. Dies konnte sowohl in humanen als auch in Rattenzellen gezeigt werden und müßte in weiteren Untersuchungen vertiefend untersucht werden.

Durch vorangegangene Arbeiten wurden transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die eine verringerte Aktivität des plastidären ATP/ADP Transporters aufweisen (NTT-antisense). Die Knollen dieser Pflanzen zeigen nicht nur veränderte Gehalte an Primärmetaboliten sondern auch eine erhöhte Pathogen-Resistenz, zum Beispiel gegen den bakteriellen Krankheitserreger Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). In diesem Zusammenhang deuten neuere Veröffentlichungen auf eine Bedeutung von Transportproteinen für Wirt-Pathogen Wechselwirkungen hin. Im Zuge dieser Arbeit konnte durch die Herstellung eines Systems zur gezielten Erzeugung von Eca „K.O.“-Mutanten die Bedeutung von ausgewählten Sequenzen, welche für Transportproteine kodieren, analysiert werden. Hierbei zeigte sich, dass im Bezug auf die Virulenz von Eca, sowohl der Prolin- als auch der d-Galaktonattransport nur von untergeordneter Bedeutung ist. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings der Karbonsäuremetabolismus und -transport von Eca als zentrales Element in der Entfaltung maximaler bakterieller Virulenz erkannt. Hierbei wurde das Cit1-Protein als hoch-affiner Citrattransporter, welcher über die bakterielle pmf energetisiert wird, identifiziert. Dieses Protein ist für ein Wachstum von Eca auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle notwendig und essentiell zur Etablierung einer vollständigen Pathogenese auf Kartoffelknollenscheibchen. So weisen Eca cit1 „K.O.“-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp Zellen nicht nur eine geringere pektolytische Aktivität und Gewebemazeration, sondern auch ein reduziertes in planta Wachstum, auf. Des Weiteren wurde ermittelt, dass sich NTT-antisense Gewebe nicht nur durch eine erhöhte Pathogen-Resistenz auszeichnet, sondern auch erniedrigte Citratgehalte aufweist. Analog führte eine artifizielle Erhöhung des Citratgehaltes durch Infiltration von Knollengewebe zu einer deutlich erhöhten Gewebemazeration durch Eca sowie einer verringerten Akkumulation von Abwehrrelevanten pflanzlichen Gentranskripten (PR-Gene). Weitere untersuchte Eca-Mutanten belegten, dass im gemeinsamen Wirken mit anderen enzymatischen Komponenten, Citrat ein ambivalentes Molekül für pflanzliche Resistenz und bakterielle Virulenz ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Transportproteine nicht nur für die Virulenz von Eca, sondern auch für phytopathogene Pilze wie Magnaporthe grisea, von Bedeutung sind. So konnte durch die Kooperation mit der AG Thines (IBWF) das Genprodukt eines bei Pathogenese induzierten Genes (rig2), biochemisch charakterisiert werden. Hierbei wurde mittels Komplementation einer Hefemutante (22∆8AA) nachgewiesen, dass es sich bei diesem Protein um einen Prolin-Transporter handelt. Diese Arbeit zeigt, dass Transportproteine als ein wichtiges Element in Wirt-Pathogen Beziehungen wirken können und eine Charakterisierung solcher Proteine zum Verständnis dieser Wechselwirkungen unerlässlich ist.

Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.

In cyanobacteria and plants, VIPP1 plays crucial roles in the biogenesis and repair of thylakoid membrane protein complexes and in coping with chloroplast membrane stress. In chloroplasts, VIPP1 localizes in distinct patterns at or close to envelope and thylakoid membranes. In vitro, VIPP1 forms higher-order oligomers of >1 MDa that organize into rings and rods. However, it remains unknown how VIPP1 oligomerization is related to function. Using time-resolved fluorescence anisotropy and sucrose density gradient centrifugation, we show here that Chlamydomonas reinhardtii VIPP1 binds strongly to liposomal membranes containing phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Cryo-electron tomography reveals that VIPP1 oligomerizes into rods that can engulf liposomal membranes containing PI4P. These findings place VIPP1 into a group of membrane-shaping proteins including epsin and BAR domain proteins. Moreover, they point to a potential role of phosphatidylinositols in directing the shaping of chloroplast membranes.

Sepsis ist eine lebensbedrohliche Infektion, welche eine der häufigsten Todesursachen bei Patienten der Intensivstation ist. Die Mortalität des septischen Schocks hat sich während der letzten 25 Jahre trotz Verbesserung lebenserhaltender Maßnahmen nicht wesentlich verringert. Bei der Sepsis lösen externe Faktoren (die invadierenden Mikroorganismen) die Erkrankung aus, körpereigene Reaktionskaskaden jedoch entscheiden letztlich über den Verlauf, der in der Sepsis ein sehr heterogenes Erscheinungsbild zeigen kann. Darum führt eine allein gegen den Mikroorganismus gerichtete Therapie bei der Sepsis häufig nicht zum Erfolg. Eine therapeutische Intervention in körpereigene Abläufe setzt jedoch voraus, dass diese Vorgänge, die involvierten Proteine sowie die molekularen Mechanismen bekannt sind. Da klinische Studien darauf hinweisen, dass während der Pathogenese der Sepsis eine aktivierungsabhängige, exzessive Verminderung der T-Lymphozyten im Blutbild (Lymphopenie) infolge verstärkter Apoptose auftritt und damit die Abwehr der Pathogene negativ beeinträchtigt wird, bildeten Untersuchungen an aktivierten T-Zellen den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Aktivierte T-Lymphozyten sind wichtige Zellen der natürlichen Immunantwort und spielen eine entscheidende Rolle im Verlauf von Infektionserkrankungen. Eine therapeutische Modulation ihrer Apoptose könnte die Ereigniskaskade früh unterbrechen und möglicherweise den dramatischen klinischen Verlauf der Sepsis dämpfen. Der Befund der Lymphopenie in Sepsis führte mich zu der Hypothese dieser Arbeit, dass PPARg hierfür verantwortlich sein könnte, da eine Aktivierung von PPARg nicht nur antiinflammatorisch, sondern auch proapoptotisch wirken kann. Eine diesbezügliche Verbindung zwischen Lymphopenie bei Sepsis und PPARg-Expression wurde noch nicht untersucht. Deshalb habe ich im Rahmen dieser Arbeit analysiert, inwieweit PPARg zur Lymphopenie von T-Zellen septischer Patienten beiträgt. Den Ausgangspunkt bildeten dabei Untersuchungen an aktivierten T-Zellen. Sowohl an der T-Zelllinie Jurkat, als auch an primären CD3+ T-Zellen konnte ich Folgendes zeigen: 1. Die Aktivierung von humanen T-Zellen mit dem T-Zell-Mitogen PHA induziert die Expression des Liganden-abhängigen Transkriptionsfaktors PPARg, führt jedoch nicht autokrin zu dessen Aktivierung. 2. Physiologische Mediatoren wie Stickstoffmonoxid oder synthetische PPARg-Liganden wie Ciglitazon bewirken eine Aktivierung von PPARg in den PHA-aktivierten T- Zellen. 3. Der durch spezifische Agonisten aktivierte Transkriptionsfaktor PPARg ruft in aktivierten T-Zellen Apoptose hervor. 4. SR-202 greift in die PPARg-vermittelte Apoptose ein. Die Vorinkubation mit diesem spezifischen PPARg-Antagonist führt zu einer verminderten Apoptose der aktivierten T-Zellen. 5. Fas-vermittelte Apoptose ist der am besten untersuchte Apoptose-auslösende Reaktionsweg in T-Zellen. Vorliegende Untersuchungen mit einem anti-Fas-neutralisierenden Antikörper zur näheren Charakterisierung der PPARg-vermittelten Apoptose verweisen jedoch auf Fas-unabhängige Mechanismen. Um die klinische Relevanz der Daten zu prüfen, versuchte ich, die Ergebnisse auf das Modell der Sepsis zu übertragen. Folgende Zusammenhänge ließen sich dabei erkennen: 1. Es ist bekannt, dass die T-Lymphozyten im septischen Geschehen im Vergleich zum gesunden Spender deutlich vermindert sind. Dies ist in Übereinstimmung mit meinen Befunden. Zusätzlich bestätigte sich die Annahme, dass der Zelltod apoptotisch, also gerichtet, verläuft. 2. In den T-Zellen der septischen Patienten ist im Gegensatz zu den T-Zellen gesunder Probanden die Expression von PPARg erhöht, so dass, aufbauend auf die Vorversuche an aktivierten T-Zellen, eine PPARg-vermittelte Apoptose postuliert werden konnte. 3. Die Zugabe von PPARg-Agonisten zu den septischen T-Zellen erhöht die Apoptose, während die Vorinkubation mit dem Antagonisten SR-202 vor der Agonisten-Behandlung die Apoptose hemmt. 4. Basierend auf Untersuchungen mit einem Fas-neutralisierenden Antikörper, ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose in septischen T-Zellen ebenfalls Fas-unabhängig sind. In Erkrankungen, deren Verlauf wie bei der Sepsis durch Lymphopenie gekennzeichnet ist, könnte der hier aufgezeigte Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose von pathophysiologischer Signifikanz sein. Das bessere Verstehen der Signaltransduktionswege, die zu der PPARg-Expression sowie der PPARg-abhängigen Apoptose in aktivierten T-Zellen führen, könnten eine Basis für neue therapeutische Strategien im Kampf gegen die Sepsis bilden. Erste Anhaltspunkte dafür liefert der Nachweis der Modulation der T-Zell-Apoptose durch den spezifischen PPARg-Antagonist SR-202.

Ecophysiological characterizations of photoautotrophic communities are not only necessary to identify the response of carbon fixation related to different climatic factors, but also to evaluate risks connected to changing environments. In biological soil crusts (BSCs), the description of ecophysiological features is difficult, due to the high variability in taxonomic composition and variable methodologies applied. Especially for BSCs in early successional stages, the available datasets are rare or focused on individual constituents, although these crusts may represent the only photoautotrophic component in many heavily disturbed ruderal areas, such as parking lots or building areas with increasing surface area worldwide. We analyzed the response of photosynthesis and respiration to changing BSC water contents (WCs), temperature and light in two early successional BSCs. We investigated whether the response of these parameters was different between intact BSC and the isolated dominating components. BSCs dominated by the cyanobacterium Nostoc commune and dominated by the green alga Zygogonium ericetorum were examined. A major divergence between the two BSCs was their absolute carbon fixation rate on a chlorophyll basis, which was significantly higher for the cyanobacterial crust. Nevertheless, independent of species composition, both crust types and their isolated organisms had convergent features such as high light acclimatization and a minor and very late-occurring depression in carbon uptake at water suprasaturation. This particular setup of ecophysiological features may enable these communities to cope with a high variety of climatic stresses and may therefore be a reason for their success in heavily disturbed areas with ongoing human impact. However, the shape of the response was different for intact BSC compared to separated organisms, especially in absolute net photosynthesis (NP) rates. This emphasizes the importance of measuring intact BSCs under natural conditions for collecting reliable data for meaningful analysis of BSC ecosystem services.

The cytosolic Fe65 adaptor protein family, consisting of Fe65, Fe65L1 and Fe65L2 is involved in many intracellular signaling pathways linking via its three interaction domains a continuously growing list of proteins by facilitating functional interactions. One of the most important binding partners of Fe65 family proteins is the amyloid precursor protein (APP), which plays an important role in Alzheimer Disease. To gain deeper insights in the function of the ubiquitously expressed Fe65 and the brain enriched Fe65L1, the goal of my study was I) to analyze their putative synaptic function in vivo, II) to examine structural analysis focusing on a putative dimeric complex of Fe65, III) to consider the involvement of Fe65 in mediating LRP1 and APP intracellular trafficking in murine hippocampal neurons. By utilizing several behavioral analyses of Fe65 KO, Fe65L1 KO and Fe65/Fe65L1 DKO mice I could demonstrate that the Fe65 protein family is essential for learning and memory as well as grip strength and locomotor activity. Furthermore, immunohistological as well as protein biochemical analysis revealed that the Fe65 protein family is important for neuromuscular junction formation in the peripheral nervous system, which involves binding of APP and acting downstream of the APP signaling pathway. Via Co-immunoprecipitation analysis I could verify that Fe65 is capable to form dimers ex vivo, which exclusively occur in the cytosol and upon APP expression are shifted to membrane compartments forming trimeric complexes. The influence of the loss of Fe65 and/or Fe65L1 on APP and/or LRP1 transport characteristics in axons could not be verified, possibly conditioned by the compensatory effect of Fe65L2. However, I could demonstrate that LRP1 affects the APP transport independently of Fe65 by shifting APP into slower types of vesicles leading to changed processing and endocytosis of APP. The outcome of my thesis advanced our understanding of the Fe65 protein family, especially its interplay with APP physiological function in synapse formation and synaptic plasticity.

In this doctoral thesis, several aspects of neuronal activity in the rat superior olivary complex (SOC), an auditory brainstem structure, were analyzed using optical imaging with voltage-sensitive dyes (VSD). The thesis is divided into 5 Chapters. Chapter 1 is a general introduction, which gives an overview of the auditory brainstem and VSD imaging. In Chapter 2, an optical imaging method for the SOC was standardized, using the VSD RH795. To do so, the following factors were optimized: (1) An extracellular potassium concentration of 5 mM is necessary during the incubation and recording to observe synaptically evoked responses in the SOC. (2) Employing different power supplies reduced the noise. (3) Averaging of 10 subsequent trials yielded a better signal-to-noise ratio. (4) RH795 of 100 µM with 50 min prewash was optimal to image SOC slices for more than one hour. (5) Stimulus-evoked optical signals were TTX sensitive, revealing action potential-driven input. (6) Synaptically evoked optical signals were characterized to be composed of pre- and postsynaptic components. (7) Optical signals were well correlated with anatomical structures. Overall, this method allows the comparative measurement of electrical activity of cell ensembles with high spatio-temporal resolution. In Chapter 3, the nature of functional inputs to the lateral superior olive (LSO), the medial superior olive (MSO), and the superior paraolivary nucleus (SPN) were analyzed using the glycine receptor blocker strychnine and the AMPA/kainate receptor blocker CNQX. In the LSO, the known glutamatergic inputs from the ipsilateral, and the glycinergic inputs from the ipsilateral and contralateral sides, were confirmed. Furthermore, a CNQX-sensitive input from the contralateral was identified. In the MSO, the glutamatergic and glycinergic inputs from the ipsilateral and contralateral sides were corroborated. In the SPN, besides the known glycinergic input from the contralateral, I found a glycinergic input from the ipsilateral and I also identified CNQX-sensitive inputs from the contralateral and ipsilateral sides. Together, my results thus corroborate findings obtained with different preparations and methods, and provide additional information on the pharmacological nature of the inputs. In Chapter 4, the development of glycinergic inhibition for the LSO, the MSO, the SPN, and the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB) was studied by characterizing the polarity of strychnine-sensitive responses. In the LSO, the high frequency region displayed a shift in the polarity at P4, whereas the low frequency region displayed at P6. In the MSO, both the regions displayed the shift at P5. The SPN displayed a shift in the polarity at E18-20 without any regional differences. The MNTB lacked a shift between P3-10. Together, these results demonstrate a differential timing in the development of glycinergic inhibition in these nuclei. In Chapter 5, the role of the MSO in processing bilateral time differences (t) was investigated. This was done by stimulating ipsilateral and contralateral inputs to the MSO with different t values. In preliminary experiments, the postsynaptic responses showed a differential pattern in the spread of activity upon different t values. This data demonstrates a possible presence of delay lines as proposed by Jeffress in the interaural time difference model of sound localization. In conclusion, this study demonstrates the usage of VSD imaging to analyze the neuronal activity in auditory brainstem slices. Moreover, this study expands the knowledge of the inputs to the SOC, and has identified one glycinergic and three AMPA/kainate glutamatergic novel inputs to the SOC nuclei.

Sepsis ist eine lebensbedrohliche Krankheit und eine der häufigsten Todesursachen auf Intensiv-Stationen. Eine der Hauptursachen für die Schwere dieser Krankheit ist die Lymphopenie, d. h. die apoptotische Depletion von Lymphozyten, die vor allem in der späten hypo-inflammatorischen Phase der Sepsis auftritt. Die dafür verantwortlichen Signalwege sind jedoch nicht im Detail geklärt. Die Liganden-vermittelte Aktivierung von PPARgamma (‚peroxisome proliferator activated receptor gamma’), einem wichtigen Regulator der Immunantwort, führt zur Apoptose in aktivierten T-Zellen. Daher postulierte ich, dass die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen zur Lymphopenie während der Sepsis beiträgt. Hierbei konnte ich zeigen, dass T-Zellen aus dem peripheren Blut von Sepsis-Patienten eine stark erhöhte PPARgamma-mRNA-Expression zeigten und in vitro stark erhöhte Apoptoseraten infolge einer Liganden-vermittelten PPARgamma-Aktivierung aufwiesen. Die hierfür erforderlichen PPARgamma-Liganden lagen im Plasma von Sepsis-Patienten vor. D. h. die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen könnte zur nachgewiesenen Lymphopenie während der Sepsis beitragen. Aufgrund der anti-inflammatorischen Wirkung von PPARgamma könnte dessen gezielte Aktivierung in der frühen hyper-inflammatorischen Phase durch Thiazolidindione (TZDs) als synthetische PPARgamma-Aktivatoren therapeutisch interessant sein. Da diese jedoch auch auf PPARgamma-unabhängigen Wegen den Zelltod in T-Zellen induzieren können, war es essentiell, die dafür verantwortlichen Signalwege zu klären. Dabei konnte ich feststellen, dass Ciglitazon Nekrose und Troglitazon Apoptose auf PPARgamma-unabhängigen Wegen bereits nach 4 h in Jurkat T-Zellen induzierten, wohingegen Rosiglitazon keinen Einfluss auf den Zelltod hatte. Die Inkubation der TZDs führte zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, welche eine wichtige Rolle bei der Ciglitazon-induzierten Nekrose, jedoch nur marginal bei der Troglitazon-induzierten Apoptose spielten. Durch Studien in submitochondrialen Partikeln konnte ich zeigen, dass die getesteten TZDs den Komplex I der mitochondrialen Atmungskette inhibierten, während nur Ciglitazon und Troglitazon zusätzlich den Komplex II hemmen konnten. Mit Hilfe synthetischer Atmungskette-Inhibitoren konnte ich weiterhin zeigen, dass die Zelltod-Induktion nach Ciglitazon und Troglitazon in Jurkat T-Zellen hauptsächlich auf der Hemmung des Komplexes II beruhte. Da die Ciglitazon-Inkubation zur Depletion des ATP-Gehaltes führte, erfolgte eine Nekrose-Induktion nach Ciglitazon, wohingegen Troglitazon den ATP-Gehalt nicht beeinflusste und daher Apoptose induzierte. Die von mir identifizierten PPARgamma-unabhängigen Mechanismen der Zelltod-Induktion durch TZDs könnten eventuell Nebenwirkungen bei TZD-basierten Therapien erklären.

Die Flechtenfamilie Lichinaceae (lichenisierte Ascomyceten) wurde erstmals einer umfassenden phylogenetischen Studie unterzogen. Anlaß waren die gravierenden Widersprüche in der Konzeption und Umschreibung der Familie und ihrer Gattungen sowie die Tatsache, daß die stammesgeschichtlichen Beziehungen der Familie und ihrer Gattungen völlig unzureichend bekannt waren. Als Ursachen wurden die zahlreichen Konflikte in der Merkmalsverteilung erkannt. Diese wurden in zurückliegenden Arbeiten über die Lichinaceae oft subjektiv gelöst oder auch gänzlich ignoriert. Daher bestand das Ziel der Arbeit darin, den Merkmalsumfang der Lichinaceae zunächst kritisch zu überprüfen und auf der Grundlage phylogenetisch-systematischer Methodik neu zu analysieren. Neben klassischen Merkmalen wurden als weitere Informationsquelle Sequenzdaten des Gens der kleinen ribosomalen Untereinheit (18S rDNA) benutzt. Die Merkmalsanalysen wurden manuell und rechnergestützt durchgeführt. Die Berechnung der Stammbäume wurde zunächst nach Datentyp getrennt und danach kombiniert vorgenommen. Der Typ, die Art der Zustandsänderung und das Gewicht morphologischer Merkmale wurden in verschiedenen Berechnungen variiert. Die Sequenzdaten wurden nach vorgegebenen Standards als ungeordnet und gleich gewichtet definiert. Nach den gewonnen Erkenntnissen ist die Ordnung Lichinales eine monophyletische Einheit, die aus den Familien Peltulaceae, Lichinaceae, Gloeoheppiaceae und Heppiaceae aufgebaut ist. Die Ordnung gründet sich mutmaßlich auf den Besitzt unitunicat-rostrater Asci sowie Befunde aus 18S rDNA-Analysen. Die Beziehungen der Lichinales sind noch weitgehend ungeklärt, doch ist eine nähere Verwandtschaft mit den Lecanorales oder einer Teilgruppe daraus anzunehmen. Die Familie Lichinaceae im herkömmlichen Sinne konnte nicht als Monophylum begründet werden. Durch den Einschluß der Heppiaceae und Gloeoheppiaceae konnte der prototunicate Ascus als mutmaßliche Autapomorphie der Lichinaceae in erweiterter Fassung gefunden werden und die Familie damit den Peltulaceae als Schwestergruppe gegenüber gestellt werden. Die Entstehung des prototunicaten Ascus der Lichinaceae wurde als Reduktionsfolge interpretiert. Es muß angenommen werden, daß unitunicat-rostrate Asci in den Lichinales mehrfach entstanden sind. Die gleich sparsame Alternative, daß der prototunicate Ascus mehrfach reduziert wurde, mußte zumindest vorläufig abgelehnt werden, da dies ein mehrfaches Entstehen des Ontogenie-Typs Pycnoascocarp gefordert hätte. Letzteres ist nach den gewonnenen Erkenntnissen sehr unwahrscheinlich. Anatomische Details, die Wuchsform oder Pyknidien taugen nicht zur Abgrenzung monophyletischer Gruppen oberhalb der Gattungsebene. Das hohe Maß an Parallelentwicklungen in dieser Ebene behinderte die phylogenetische Analysen zum Teil erheblich. Die Ergebnisse wurden in ein geschriebenes System und eine darauf aufbauende Klassifikation integriert. Es wurde eine Emendierung der Lichinaceae vorgenommen und darin die Heppiaceae und Gloeoheppiaceae in die Synonymie verwiesen. Die Gattung Thyrea wurde emendiert. Jenmania ist nach den gewonnenen Erkenntnissen in der ursprünglichen Form als monotypische Gattung zu belassen. Die Gattung Paulia wurde erweitert. Die Namen folgender Taxa wurden provisorisch umkombiniert: Jenmania osorioi Henss. = Thyrea osorioi (Henss.) Schultz, Synalissa nitidula Müll. Arg. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz, Synalissa salevensis Müll. Arg. = Paulia salevensis (Müll. Arg.) Schultz. Folgende Artnamen wurden in die Synonymie verwiesen: Thyrea schroederi Zahlbr. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz, Paulia schroederi (Zahlbr.) Henss. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz. Es wurde ein Schlüssel zur Bestimmung aller derzeit in die Lichinaceae gestellten Gattungen vorgelegt sowie einige Schlüssel zur Bestimmung der Arten überarbeitet, erweitert oder neu erstellt.

Die Resistenz solider Tumoren gegenüber der Behandlung mit Medikamenten oder Bestrahlung ist ein häufig auftretendes Phänomen. Insbesondere das Auftreten von Chemoresistenzen stellt ein großes Problem bei der Behandlung von Krebs dar. Aufgrund einer Unterversorgung des Gewebes kommt es in soliden Tumoren zur Bildung des so genannten ‚hypoxischen Kern’ (hypoxic core), welcher bei der Progression und Metastasierung des Tumors eine wichtige Rolle spielt. Es wird diskutiert, inwieweit Hypoxie an der Entstehung von Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Therapieansätzen beteiligt ist. Das Ziel der Arbeit war es, die Fragestellung zu klären, ob Hypoxie vor Apoptose, ausgelöst durch Chemotherapeutika, schützt. Wenn sich diese Vermutung bestätigen sollte, sollten die zu Grunde liegenden Mechanismen dieser Chemoresistenz aufgeklärt werden. Es konnte festgestellt werden, dass es in A549 Zellen unter Hypoxie durch ein Zusammenspiel mehrerer unabhängiger Signalwege zum Schutz vor Etoposid-induzierter Apoptose kommt. Zum einen induziert Hypoxie die Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1. Über einen intrazellulären Mechanismus, wahrscheinlich der Expression anti-apoptotischer Zielgene, kommt es zur Desensitivierung der Zellen gegenüber der Behandlung mit Etoposid. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass es unter Hypoxie unabhängig von HIF-1 zur Freisetzung von Schutzfaktoren kommt. Diese vermitteln über auto- oder parakrine Wege anti-apoptotische Signale. Hypoxie führte zu einer Akkumulation der Cyclooxygenase-2 (COX-2), welche maßgeblich an der Freisetzung des Schutzfaktors beteiligt ist. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass die Stimulation mit PGE2 zu einer erhöhten Resistenz von A549 Zellen gegenüber Etoposid-induzierter Apoptose führte. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die basale Aktivität der Sphingosin-Kinasen für die Vitalität von A549 Zellen essenziell ist. Unter Hypoxie wurde darüber hinaus eine Aktivierung der Sphingosin-Kinase 2 (SphK2) festgestellt, wodurch eine vermehrte Synthese und Freisetzung von Sphingosin-1-phosphat (S1P) induziert wurde. Es kommt unter Hypoxie über zwei unabhängige Signalwege zur Freisetzung von PGE2 und S1P, welche in Zielzellen einen chemoresistenten Phänotyp induzieren. Die Übertragung des anti-apoptotischen Signals erfolgte über die Aktivierung der ERK1/2-Signalkaskade. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass Hypoxie über die Aktivierung von HIF-1, COX-2 und SphK2 in A549 Zellen die Resistenz gegenüber Chemotherapeutika induziert. Hierbei sind neben intrazellulären Signalen auch auto- und parakrin wirkende Mechanismen beteiligt. Als Übermittler des übertragbaren anti-apoptotischen Signals konnten S1P und PGE2 identifiziert werden, die über die Aktivierung von ERK1/2 vor Apoptose schützen.

The hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), a heterodimer composed of HIF-1alpha and HIF-1beta, is activated in response to low oxygen tension and serves as the master regulator for cells to adapt to hypoxia. HIF-1 is usually considered to be regulated via degradation of its a-subunit. Recent findings, however, point to the existence of alternative mechanisms of HIF-1 regulation which appear to be important for down-regulating HIF-1 under prolonged and severe oxygen depletion. The aims of my Ph.D. thesis, therefore, were to further elucidate mechanisms involved in such down-regulation of HIF-1. The first part of the thesis addresses the impact of the severity and duration of oxygen depletion on HIF-1alpha protein accumulation and HIF-1 transcriptional activity. A special focus was put on the influence of the transcription factor p53 on HIF-1. I found that p53 only accumulates under prolonged anoxia (but not hypoxia), thus limiting its influence on HIF-1 to severe hypoxic conditions. At low expression levels, p53 inhibits HIF-1 transactivity. I attributed this effect to a competition between p53 and HIF-1alpha for binding to the transcriptional co-factor p300, since p300 overexpression reverses this inhibition. This assumption is corroborated by competitive binding of IVTT-generated p53 and HIF-1alpha to the CH1-domain of p300 in vitro. High p53 expression, on the other hand, affects HIF-1alpha protein negatively, i.e., p53 provokes pVHL-independent degradation of HIF-1alpha. Therefore, I conclude that low p53 expression attenuates HIF-1 transactivation by competing for p300, while high p53 expression negatively affects HIF-1alpha protein, thereby eliminating HIF-1 transactivity. Thus, once p53 becomes activated under prolonged anoxia, it contributes to terminating HIF-1 responses. In the second part of my study, I intended to further characterize the effects induced by prolonged periods of low oxygen, i.e., hypoxia, as compared to anoxia, with respect to alterations in HIF-1alpha mRNA. Prolonged anoxia, but not hypoxia, showed pronounced effects on HIF-1alpha mRNA. Long-term anoxia induced destabilization of HIF-1alpha mRNA, which manifests itself in a dramatic reduction of the half-life. The mechanistic background points to natural anti-sense HIF-1alpha mRNA, which is induced in a HIF-1-dependent manner, and additional factors, which most likely influence HIF-1alpha mRNA indirectly via anti-sense HIF-1alpha mRNA mediated trans-effects. In summary, the data provide new information concerning the impact of p53 on HIF-1, which might be of importance for the decision between pro- and anti-apoptotic mechanisms depending upon the severity and duration of hypoxia. Furthermore, the results of this project give further insights into a novel mechanism of HIF-1 regulation, namely mRNA down-regulation under prolonged anoxic incubations. These mechanisms appear to be activated only in response to prolonged anoxia, but not to hypoxia. These considerations regarding HIF-1 regulation should be taken into account when prolonged incubations to hypoxic or anoxic conditions are analyzed at the level of HIF-1 stability regulation.

In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die begonnene Analyse zur Genregulation durch den potentiellen Transkriptionsregulator PepR1 aus Lactobacillus delbrückii subsp. lactis DSM7290 fortgesetzt. PepR1 wurde aufgrund von Aminosäuresequenz-Ähnlichkeiten zu Proteinen der CcpASubfamilie, die zur GalR/LacI-Familie transkriptioneller Regulatoren gehört,identifiziert. Das pepR1-Gen ist divergierend zum pepQ-Gen angeordnet, welches für die Peptidase Q kodiert. Beide Gene besitzen eine gemeinsame intergene Region von 152 bp. Bei Promotorstudien im heterologen E. coli mit einem partiellen β-Galaktosidase-Gen (´lacZ) aus E. coli, welches mit einem Teilbereich der intergenen Region von pepR1 und pepQ sowie den ersten sechs Kodons des pepQ-Gens fusioniert wurde, erhöhte die Anwesenheit von PepR1 in trans die gemessene Aktivität des β-Galaktosidase-Fusionskonstruktes um einen Faktor von 1,95; während zwei im cre-Operator mutierte Varianten desselben Promotors nur 1,26- bzw. 1,21-fach erhöhte Aktivitäten zeigten. Analog ausgeführte Analysen mit den ebenfalls cre-ähnliche Elemente enthaltenden Promotorbereichen der Peptidasegene pepI und pepX ließen keine signifikante Beeinflussung der Expression der Reporterkonstrukte durch PepR1 erkennen. Bandshift-Analysen mit gereinigten PepR1-Protein und dem nicht modifizierten pepQ-Promotorfragment sowie einer Variante mit einem in zwei Basenpaaren mutierten cre-Operator zeigten die vollständige Retardierung beider DNA-Fragmente. Diese Resultate konnten die 14 bp palindromische cre-Sequenz als den cis-aktiven Operator für die Wirkung des DNA-bindenden Regulators PepR1 bestätigen. Die CcpA-äquivalente Funktion von PepR1 aus Lb. delbrückii subsp. lactis als pleiotroper Regulator wurde durch die partielle Komplementation einer ccpA-Mutation von Staphylococcus xylosus C2a durch das pepR1-Gen von Lactobacillus delbrückii subsp. lactis nachgewiesen. In der durch das plasmidkodiert vorliegende pepR1-Gen komplementierten ccpA-Mutante von Staphylococcus xylosus C2a war die Zucker-vermittelte Repression der α-Gluko-sidase in Gegenwart von Glukose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zum Wildtyp fast komplett wiederhergestellt. Die autogene Regulation von pepR1 wurde in E. coli durch die parallele Expression des mit dem promotorlosen ´lacZ-Gen translational fusionierten pepR1-Promotors und dem unter der Kontrolle des eigenen bzw. des E. coli lac-Promotors exprimierten PepR1 gezeigt. Die Anwesenheit von PepR1 in trans reprimierte in beiden Fällen die Aktivität des PpepR1-´lacZ-Reporterkonstruktes um einen Faktor von zwei. Die Transkripte der Peptidasegene pepI, pepQ, pepX und des pepR1-Gens wurden parallel zur Bestimmung der zugehörigen Aktivitäten der Peptidasen I, Q, und X über den Wachstumsverlauf von in Glukose oder Laktose wachsenden Zellen von Lb. delbrückii subsp. lactis verfolgt. Beim Wachstum mit Glukose war die PepQ-Aktivität gegenüber Laktose durchschnittlich um einen Faktor von 1,8 erhöht, die Menge an pepQ-mRNA korrelierte mit den Aktivitäten. Die Aktivitäten der Pep I und der Pep X waren bei in Laktose kultivierten Zellen leicht erhöht, sie zeigten jedoch Wachstumsphasen-abhängige Modulationen bei den Aktivitäten sowie Abweichungen bei der Korrelation von enzymatischer Aktivität zur Menge an spezifischer mRNA. Die Menge an pepR1-spezifischer mRNA variierte Wachstums-phasenabhängig sowohl bei der Glukose- als auch der Laktose-Kultur mit einem Faktor von zwei bis drei. Die lac-Region von Lactobacillus delbrückii subsp. lactis DSM7290 wurde kloniert, sequenziert und partiell charakterisiert. Durch den Vergleich mit DNA-Sequenzdaten von bekannten lac-Genen anderer Milchsäurebakterien konnten drei offene Leserahmen ermittelt werden. Das lacP-Gen (1881 bp), dessen unvollständiger 5´-Genabschnitt durch Inverse PCR komplettiert wurde, kodiert für eine Permease. Drei Basenpaare stromabwärts von lacP beginnt das Gen lacZ (3024 bp) für die β-Galaktosidase, auf die in gleicher Leserichtung 51 bp stromabwärts, das an seinem 3´-Ende nur unvollständig vorliegende lacR´ folgt. Northern-Blot-Analysen konnten zeigen, daß lacP und lacZ (sowie vermutlich auch lacR´) bei Wachstum von Lb. delbrückii subsp. lactis DSM7290 in Medium mit dem Zucker Laktose als mRNA von circa 6,15 kb Größe gemeinsam transkribiert werden. Die durch CcpA/PepR1-vermittelte Kontrolle über cre-Operatoren des lac-Promotors konnte mit zwei Translationsfusionen von Plac mit dem ´lacZ aus E. coli in S. xylosus lac- bzw. lac- und ccpA-Mutanten gezeigt werden.

NbdA und MucR sind Multi-Domänenproteine aus Pseudomonas aeruginosa. Beide Proteine besitzen eine ähnliche Domänenorganisation mit einer N-terminalen, membranständigen MHYT-Domäne sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne im Cytoplasma. Die cytosolischen Domänen von MucR sind beide aktiv, während NbdA neben der intakten EAL-Domäne eine degenerierte GGDEF-Domäne mit dem Motiv AGDEF aufweist. Bioinformatischen Vorhersagen zufolge soll die MHYT-Domäne eine sensorische Funktion für diatomische Gase wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoff vermitteln. Die phänotypische Charakterisierung der markerlosen PAO1-Deletionsmutanten \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR und \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR zeigte, dass NbdA und MucR nicht in die NO-induzierte Dispersion involviert sind. Ebenso konnte in einem neu etablierten heterologen in-vivo-System in E. coli keine NO-sensorische Funktion der Proteine detektiert werden. Im Weiteren wurde festgestellt, dass die MHYT-Domäne keinen ersichtlichen Einfluss auf die Enzymaktivität von NbdA und MucR unter aeroben Bedingungen hat. Demzufolge fungiert die Membrandomäne vermutlich weder als Sensor für Sauerstoff, noch für NO. Anhand heterologer Komplementationstests konnte eine PDE-Aktivität des NbdA-Volllängenproteins nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die degenerierte AGDEF-Domäne einen regulatorischen Effekt auf die EAL-Domäne hat, der essentiell für die in- vivo-Aktivität von NbdA ist. In-vivo-Untersuchungen bestätigten die postulierte DGC-Aktivität von MucR. Weiterhin konnte belegt werden, dass MucR ein bifunktionelles Enzym ist. Entgegen den Erwartungen scheint es jedoch im Planktonischen als DGC und im Biofilm als PDE zu fungieren. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der homologen Überexpression von nbdA in P. aeruginosa, welche teilweise unerwartete Phänotypen ergab. Anhand der homologen Überproduktion einer inaktiven NbdA-Variante stellte sich heraus, dass die Hemmung der Motilität unabhängig von der Aktivität von NbdA auftritt. Massenspektrometrische Analysen deuteten daraufhin, dass NbdA lokal c-di-GMP hydrolysiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass NbdA eine Trigger-PDE ist, deren primäre Funktion die Regulation anderer makromolekularer Zielmoleküle ist. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ist bekannt, dass das NbdA-Homolog Pfl01_1252 mit den Homologen von MucR (Pfl01_2525) und SadC (Pfl01_4451) interagiert. Ergebnisse einer früheren Arbeit lassen eine Interaktion von NbdA und SadC ebenso in P. aeruginosa vermuten. Daher ist denkbar, dass sich NbdA im gleichen Netzwerk wie MucR und SadC befindet und deren Aktivität reguliert.

Bei Asthma handelt es sich um eine chronische Entzündung der Atemwege, die durch bronchiale Hyperreagibilität, reversible Atemwegsobstruktion und airway remodeling gekennzeichnet ist. Letzteres bezieht sich dabei auf die permanenten strukturellen Veränderungen in den Atemwegen, die zur Verdickung der Bronchialwand beitragen und für die bei Asthmatikern auftretende progressive und irreversible Abnahme der Lungenfunktion verantwortlich sind. Die epithelial zu mesenchymale Transition (EMT), ein physiologischer Prozess bei dem epitheliale Zellen den motilen und invasiven Phänotyp von Fibroblasten übernehmen, ist dabei eng mit der Zerstörung der epithelialen Barriere, subepithelialer Fibrose und der Akkumulation von Myofibroblasten assoziiert, die bei airway remodeling auftreten. Obwohl Wachstumsfaktoren wie der transforming growth factor β (TGF-β) als wichtige Induktoren von EMT gelten, weisen jüngste Ergebnisse auf eine EMT-modifizierende Wirkung von inflammatorischen Mediatoren hin. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, den Effekt der inflammatorischen Zytokine IL-4, IL- 17 und IL-22, die in der Pathogenese von allergischem (IL-4) bzw. nicht-allergischem (IL-17/ -22) Asthma involviert sind, auf die TGF-β induzierte EMT in vitro zu untersuchen. Keines der Zytokine war dabei in der Lage, selbstständig EMT induzieren, allerdings verstärkten und beschleunigten sie den EMT-Prozess in Kombination mit TGF-β, wobei die kombinierte Stimulation mit allen 3 Zytokinen einen additiven Effekt zeigte. Obwohl die Zytokine allein kurzzeitig die Transkription von EMT-essentiellen Transkriptionsfaktoren förderten, nahm deren Transkriptmenge sowie Proteinabundanz rasch wieder ab. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Stimulation mit TGF-β jedoch stark verringert, was auf eine essentielle Rolle des mRNA-stabilisierenden Effektes von TGF-β bei der Induktion von EMT hindeutet. Obwohl inhalierte Kortikosteroide als goldene Standardtherapie in der Asthmabehandlung gelten, verbleiben 5-10% der Asthmatiker therapieresistent. Desweiteren wird airway remodeling durch die Langzeit-Behandlung mit Kortikosteroiden nicht unterdrückt, weswegen neue therapeutische Ansätze entwickelt werden müssen. Naturstoffe mit ihrer strukturellen Komplexität sowie ihrem breiten Spektrum an biologischen Aktivitäten können dabei als potentielle Leitstrukturen dienen. In dieser Arbeit wurde das therapeutische Potenzial der Naturstoffe Cyclonerodiol und Oxacyclododecindion bezüglich Asthma-relevanter Pathomechanismen in vitro untersucht. Cyclonerodiol, das zuvor bereits als Inhibitor des IL-4 Signalweges charakterisiert wurde, hemmte auch den IL-13 Signalweg, der ebenfalls mit allergischem Asthma assoziiert ist. Auf mRNA- und Proteinebene reduzierte der Naturstoff die Expression inflammatorischer Zytokine und Chemokine, die an der Pathogenese von allergischem Asthma beteiligt sind. Untersuchungen zum Wirkmechanismus zeigten, dass Cyclonerodiol die Interaktion des Transkriptionsfaktors STAT6 mit den MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 und somit die Serin-Phosphorylierung von STAT6 reduziert, wodurch auch die Interaktion mit dem transkriptionellen Coaktivator p300 verringert wird. Oxacyclododecindion, das bereits als potenter Inhibitor der Expression von inflammatorischen sowie fibrotischen Genen identifiziert wurde, hemmte charakteristische Merkmale von schwerem, Glukokortikoidresistentem Asthma wie die durch IL-17 induzierte Expression inflammatorischer Gene. Die Substanz inhibierte zudem die durch TGF-β induzierte EMT wesentlich stärker als das potente Glukokortikoid Dexamethason. Studien zum Wirkmechanismus weisen darauf hin,dass es sich bei Oxacyclododecindion um einen Kinaseinhibitor mit TAK1 als potentieller Zielstruktur handeln könnte.

In dieser Arbeit wurde die Wirkung der a,b-ungesättigten Aldehyde Crotonaldehyd (CA), trans-2-Hexenal (HX), und des N-Nitrosodiethanolamin (NDELA) untersucht. Als Kontrollsubstanzen wurde das als Aneugen bekannte Diethylstilbestrol (DES) und die als Klastogene bekannten Mutagene Mitomycin C (MMC) und Bleomycin (BLM) eingesetzt. Es wurde die Technik der vorzeitigen Chromosomenkondensation (PCC) an unstimulierten Lymphozyten in der G0-Phase eingesetzt, die für 1 Stunde mit dem jeweiligen Mutagen inkubiert worden waren. Das Ausmaß der mutagenen Schädigung bei den PCCs wurde lichtmikroskopisch durch Auszählen von Chromatinelementen analysiert. Ze llen mit mehr als 46 Chromatinelementen wurden als geschädigt gewertet. Die Resultate der PCC-Studien wurden mit den Ergebnissen aus 48 Stunden-Metaphasenkulturen verglichen. Mit der Fluoreszenz plus Giemsa (FPG)-Technik wurden die Mitosen, die zum erstenmal nach Mutagenapplikation das Metaphasestadium erreicht hatten, identifiziert. Die Metaphasenanalyse aus 48 Stunden-Kulturen zeigte für CA bei 60microM und für HX bei 100microM eine schwach signifikante Erhöhung der Anzahl aberranter Metaphasen. Die für CA zusätzlich durchgeführten 73 Stunden-Kulturen, bei denen die Mutagenbehandlung erst 48 Stunden nach Kulturansatz durchgeführt wurden, ergab ab 240microM eine schwach signifikante Erhöhung aberranter Metaphasen im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten. Die Analyse der Metaphasen aus 48 Stunden-Kulturen nach NDELA-Behandlung ergab, daß sich die Zahl der aberranten Metaphasen nur bei einer Konzentration von 2000microM signifikant im Vergleich zu den Zellen aus den Kontrollkulturen erhöhte. Die anderen getesteten NDELA-Konzentrationen auch die in den 73 Stunden-Kulturen eingesetzten erhöhten die Aberrrationsrate in den Metaphasechromosomen, allerdings statistisch nicht signifikant. Nach MMC-Behandlung (6microM) zeigten 27,5%, nach DES-Behandlung (100microM) 7,6% und nach Bleomycin-Behandlung (10microg/ml) 8,8% der Metaphasen Aberrationen. Damit war die Anzahl geschädigter Metaphasen im Vergleich zu den Zellen unbehandelter Kontrollkulturen nach MMC-Inkubation (6microM) und nach Bleomycin-Applikation (10microg/ml) statistisch hoch signikant, nach DES-Inkubation (100microM) allerdings nicht signifikant erhöht. Die PCC-Technik erwies sich als die im Vergleich zur Metaphasenanalyse sensitivere Methode. Alle getesteten Substanzen erhöhten die Anzahl der Chromatinelemente/Zelle dosisabhängig. Unbehandelte Lymphozyten wiesen zwischen 1,0 und 1,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Dabei waren zwischen 6,1 und 15,8% der unbehandelten Zellen geschädigt. Nach CA-Inkubation (240microM) stieg die Zahl geschädigter PCCs auf 48,7% an, wobei 3,4 Fragmente pro geschädigte Zelle zu beobachten waren. Nach Behandlung der Zellen mit HX(150microM) waren 42,9% der Zellen geschädigt und wiesen 4,6 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Damit war die Zunahme der Schädigung im Vergleich zur Kontrolle hoch signifikant. Die Inkubation mit NDELA schädigte die Lymphozyten in der G0-Phase bereits ab einer Konzentration von 1000microM hoch signifikant. Dabei waren 56,6% der Lymphozyten geschädigt und es traten 4,1 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Nach Inkubation mit MMC (20microM) waren 46,3% der Zellen geschädigt und wiesen 3,3 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Die Behandlung der Lymphozyten mit DES (200microM) induzierte in 26,3% der Zellen mehr als 46 Chromatinelemente pro Zelle, wobei 2,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auftraten. Nach Behandlung der Lymphozyten mit a,b-ungesättigten Aldehyden wurde in den PCCs zusätzlich ein interessantes Phänomen beobachtet: die vorzeitig kondensierten Chromosomen erschienen im Vergleich zu den PCCs unbehandelter Zellen weniger stark kondensiert. Um das Ausmaß der Entspiralisierung erfassen zu können, wurden die PCCs zunächst semiquantitativ gemäß ihrem Kondensationsgrad in 4 Kategorien eingeteilt, wobei der Kategorie 1 die am stärksten kondensierten PCCs, der Kategorie 4 die am wenigsten kondensierten PCCs zugeordnet wurden. Bei einer CA-Konzentration von 480microM waren 55,6% und einer HX-Konzentration von 300microM waren 57,4% der untersuchten Zellen Kategorie 4 zuzuordnen. Durch die Kombination der PCC-Technik mit der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung und den Einsatz einer Painting Sonde (exemplarisch für Chromosom 4) wurde die Längenveränderung der PCCs genauer quantifiziert werden. Dazu wurde die Länge der Chromosom 4-PCC vor und nach Behandlung mit Crotonaldehyd (240microM und 480microM) mit einem computergestützten Programm ausgemessen. So ergab sich nach Crotonaldehyd-Behandlung (480microM) durchschnittlich eine Längenzunahme um das zwei- bis dreifache. Elongierte PCCs wurden nach Inkubation der Lymphozyten mit NDELA und Bleomycin nicht beobachtet; nach Inkubation mit den Mutagenen MMC (20microM) und DES (200microM) trat dieses Phänomen nur leicht auf. Reparaturkinetikstudien mit den Hemmstoffen Arabinofuranosylcytosin, Hydroxyharnstoff und Novobiocin lassen eine verstärkte Excisionsreparatur als Ursache für die beobachtete verminderte Kondensation der PCCs nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden unwahrscheinlich erscheinen. Die nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden beobachtete verminderte Kondensation der PCCs ist eher das Resultat von Veränderungen der mitotischen Faktoren und/oder Chromatinstrukturen. Möglicherweise interferieren a,b-ungesättigte Aldehyde mit den Phosphorylierungsprozessen der Histone H1 und/oder H3, die für die PCC-Induktion bedeutsam sind und die durch die Aktivität der mitotischen Faktoren vermittelt werden.

The number of sequenced genomes increases rapidly due to the development of faster, better and new technologies. Thus, there is a great interest in automation, and standardization of the subsequent processing and analysis stages of the generated enormous amount of data. In the current work, genomes of clones, strains and species of Streptococcus were compared, which were sequenced, annotated and analysed with several technologies and methods. For sequencing, the 454- and Illumina-technology were used. The assembly of the genomes mainly was performed by the gsAssembler (Newbler) of Roche, the annotation was performed by the annotation pipeline RAST, the transfer tool RATT or manually. Concerning analysis, sets of deduced proteins of several genomes were compared to each other and common components, the so-called core-genome, of the used genomes of one or closely related species determined. Detailed comparative analysis was performed for the genomes of isolates of two clones to gather single nucleotide variants (SNV) within genes. This work focusses on the pathogenic organism Streptococcus pneumoniae. This species is a paradigm for transformability, virulence and pathogenicity as well as resistance mechanisms against antibiotics. Its close relatives S. mitis, S. pseudopneumoniae and S. oralis have no pathogenicity potential as high as S. pneumoniae available and are thus of high interest to understand the evolution of S. pneumoniae. Strains of two S. pneumoniae clones were chosen. One is the ST10523 clone, which is associated with patients with cystic fibrosis and is characterized by long-term persistence. This clone is lacking an active hyaluronidase, which is one of the main virulence factors. The lack of two phage clusters possibly contributed to the long persistence in the human host. The clone ST226 shows a high penicillin resistance but interestingly one strain is sensitive against penicillin. Here it could be seen that the penicillin resistance mainly arose from the presence of mosaic-PBPs, while special alleles of MurM and CiaH - both genes are associated with penicillin-resistance – were present in resistant and sensitive strains as well. Penicillin resistance of S. pneumoniae is the result of horizontal gene transfer, where DNA of closely related species, mainly S. mitis or S. oralis, served as donor. The transfer of DNA from the high-level penicillin-resistant strain S. oralis Uo5 to the sensitive strain S. pneumoniae R6 was intentioned to reveal the amount of transferred DNA and whether it is possible to reach the high resistance level of S. oralis Uo5. Altogether, about 19kb of S. oralis DNA were transferred after three successive transformation steps, about 10-fold less than during transfer from S. mitis, which is more closely related to S. pneumoniae, as donor. MurE was identified as new resistance determinant. Since the resistance level of the donor strain could not be reached, it is assumed, that further unknown factors are present which contribute to penicillin resistance. The comparison of S. pneumoniae and its close relatives was performed using deduced protein sequences. 1.041 homologous proteins are common to the four complete genomes of S. pneumoniae R6, S. pseudopneumoniae IS7493, S. mitis B6 and S. oralis Uo5. Most of the virulence and pathogenicity factors described for S. pneumoniae could also be found in commensal species. These observations were confirmed by further investigations by Kilian et al. (Kilian, et al., 2019). After adding 26 complete S. pneumoniae genomes to the analysis, only 104 gene products could be identified as specific for this species. Investigations of a larger number of related streptococci, which were isolated from human and several primates, confirmed the presence of most of the virulence factors of human pneumococci in S. oralis and S. mitis strains from primates. While NanBC is common among S. pneumoniae and is missing in all S. oralis, all S. oralis contain a ß-N-acetyl-hexosaminidase which vice versa is missing in S. pneumoniae. The occurrence of S. oralis also in free-living chimpanzees suggests the assumption, that this species is part of the commensal flora of these Old-World monkeys unlike S. pneumoniae which has evolved with its human host. Compared to S. pneumoniae, S. oralis shows an amazing variability in factors important for biosynthesis of peptidoglycan and teichoic acid (PBP, MurMN, lic-cluster). Some streptococci contain a second PGP3 homologue. Additional analyses with further isolates, especially of wild animals, are necessary to determine host-specific components.

We isolated an encysted ciliate from a geothermal field in Iceland. The morphological features of this isolate fit the descriptions of Dexiotricha colpidiopsis (Kahl, 1926) Jankowski, 1964 very well. These comprise body shape and size in vivo, the number of somatic kineties, and the positions of macronucleus and contractile vacuole. Using state-of-the-art taxonomic methods, the species is redescribed, including phylogenetic analyses of the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene as molecular marker. In the phylogenetic analyses, D. colpidiopsis clusters with the three available SSU rRNA gene sequences of congeners, suggesting a monophyly of the genus Dexiotricha. Its closest relative in phylogenetic analyses is D. elliptica, which also shows a high morphological similarity. This is the first record of a Dexiotricha species from a hot spring, indicating a wide temperature tolerance of this species at least in the encysted state. The new findings on D. colpidiopsis are included in a briefly revision of the scuticociliate genus Dexiotricha and an identification key to the species. Słowa kluczowe: Dexiotricha, hot spring, morphology, phylogeny, SSU rRNA gene

Bei dem in dieser Arbeit untersuchten Antibiotikum Vancoresmycin handelt es sich um ein neuartiges Tetramsäurederivat, das aus der Fermentationsbrühe des Aktinomyceten Amycolatopsis vancoresmycina gewonnen wurde. Da der Wirkungsmechanismus und mögliche Resistenzmechanismen unbekannt sind, soll diese Arbeit zu deren Aufklärung beitragen. Dazu wurden verschiedene Determinanten für die Resistenz gegen Vancoresmycin in Streptococcus pneumoniae R6 analysiert. Zuerst wurden acht vancoresmycinresistente Labormutanten von Streptococcus pneumoniae R6 bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml Vancoresmycin isoliert und phänotypisch charakterisiert. Es konnte eine bakteriolytische Wirkung von Vancoresmycin auf S. pneumoniae gezeigt werden. Zur Identifizierung genetischer Resistenzdeterminanten wurden verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden Genbanken von der Mutante aR6 erstellt und nach der resistenzvermittelnden DNA-Sequenz durch Transformation des sensitiven Rezipienten S. pneumoniae R6 gesucht. Zum anderen wurden die Transkriptome der Mutanten aR6, eR6, fR6 und gR6 mit dem des Referenzstammes R6 durch mikroarraybasierte Studien verglichen, um Transkriptmengenunterschiede zu detektieren. Durch das Screening der Genbanken konnten zwei Determinanten identifiziert werden, deren Funktionen durch Insertion des IS10-R-Elementes eingeschränkt waren. Dabei handelte es sich um das Gen rpsI, das für das kleine ribosomale Protein S9 codiert, und um das Gen dexS, das für eine Dextranglucosidase codiert. Der Stamm R6-rpsI::IS10-R zeichnete sich durch ein verlangsamtes Wachstum aus, was zu der beobachteten erhöhten Vancoresmycinresistenz beitragen könnte. Für das Gen dexS konnte eine direkte Beteiligung an der Resistenz gegenüber Vancoresmycin nicht nachgewiesen werden. Durch einen Transkriptomvergleich der Mutanten aR6, eR6 und fR6 mit dem Referenzstamm R6 wurde festgestellt, dass die Transkriptmengen des Genes copY, das für einen Transkriptionsrepressor codiert, und der Gene eines Cyl-Operons, deren Genprodukte vermutlich an der Bildung, Modifikation und Sezernierung eines Cytolysins beteiligt sind, in den Mutanten aR6, eR6 und fR6 erhöht waren. Mit Hilfe ausführlicher Analysen wurde nachgewiesen, dass sowohl das Gen copY als auch die Gene des Cyl-Operons nicht direkt an einer Resistenz gegenüber Vancoresmycin beteiligt sind. Im Transkriptom der Mutante gR6 fielen zwei Gene (spr0812 = abcA und spr0813 = abcB), die für einen ABC-Transporter codieren, durch erhöhte Transkriptmengen im Vergleich zu den entsprechenden Transkriptmengen des Referenzstammes R6 auf. Die Funktion dieses ABC-Transporters bei der Resistenz gegenüber Vancoresmycin wurde detailliert analysiert, da ein Aminosäureaustausch im C-terminalen Ende der Permeaseuntereinheit AbcB in der Mutante gR6 identifiziert wurde (Gln581 ® Stop). Durch Transformation des Rezipienten R6 mit der entsprechenden DNA-Sequenz konnte für die Transformanten (gTR) eine erhöhte Vancoresmycinresistenz gezeigt werden. Außerdem konnte durch Deletion des ABC-Transporter-Operons in der Mutante gR6 eine MHK-Erniedrigung auf das Ausgangsniveau des Referenzstammes R6 herbeigeführt werden. Die im Transkriptom der Mutante gR6 detektierten erhöhten Transkriptmengen der Gene abcA und abcB wurden durch quantitative Real-Time-PCR verifiziert. In der Transformante gTR wurden ebenfalls erhöhte Transkriptmengen der Gene abcA und abcB nachgewiesen. Sowohl in der Mutante gR6 als auch in der Transformante gTR waren die Transkriptmengen der Gene abcA und abcB etwa um das Sechsfache im Vergleich zu den jeweiligen Transkriptmengen des Referenzstammes R6 erhöht. Um die Ursache der erhöhten Transkriptmengen aufzuklären, wurde die Promotoraktivität des ABC-Transporter-Operons in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR mit Hilfe von lacZ- Reporterfusionskonstrukten analysiert. Die Promotoraktivitäten in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR unterschieden sich nicht von der des Referenzstammes R6. Dieses Resultat lässt vermuten, dass die erhöhten Transkriptmengen der Gene abcA und abcB nicht auf eine gesteigerte Promotoraktivität zurückgeführt werden können, sondern dass die Stabilität der Transkripte durch die Nonsensemutation in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR erhöht war. In der Literatur werden homologe ABC-Transporter aus Bacillus subtilis bzw. S. mutans beschrieben, die in eine Resistenz gegenüber Bacitracin involviert sind (Ohki et al., 2003; Tsuda et al., 2002). Aufgrund dessen wurde eine Beteiligung des hier untersuchten ABC-Transporters an einer Bacitracinresistenz überprüft. Mit Hilfe einer MHK-Bestimmung für Bacitracin wurde ein fünffach erniedrigter MHK-Wert für die Mutante gR6 und für die Transformante gTR im Vergleich zum Referenzstamm R6 festgestellt. Das bedeutet, dass der mutierte ABC-Transporter der Mutante gR6 sowohl in eine erhöhte Resistenz gegenüber Vancoresmycin als auch in eine erhöhte Sensitivität gegenüber Bacitracin involviert ist.

The heart is reported to show a net consumption of lactate. This may contribute up to 15% to the total body lactate disposal. In this work, the consumption of lactate was shown for the first time on the single cell level with the new FRET-based lactate sensor Laconic. Research published until today, almost exclusively reports the monocarboxylate transporter 1 (MCT1) as the transporter responsible for myocardial lactate uptake. As this membrane transporter transports lactate together with H+ in a stoichiometry of 1:1, lactate transport is coupled to pH regulation. Consequently, interactions of MCT1 and acid/base regulating proteins (carbonic anhydrases (CAs and sodium bicarbonate co-transporters (NBCs)) are described in the oocyte expression system, skeletal muscle and cancer cells. In this work it is shown that activity of extracellular CA increases lactate uptake into mouse cardiomyocytes by 27% and lactate induced JA/B by 42.8% to 46.2%. This effect is most likely mediated via NBC/CA interaction because inhibition of extracellular CA reduces HCO3-- dependent acid extruding JA/B by 53.3% to 78.4%. This may link lactate uptake to cellular respiration. When lactate was applied in medium gassed with 100% N2, lactate induced acidification was 12.6% faster than in medium gassed with 100% O2. Thus, CO2 produced on the pathway transferring redox energy from substrates like glucose and lactate to ADP and phosphate via oxidative phosphorylation, may support further lactate uptake. The findings of this work suggest an auto regulation of lactate uptake via CO2 release in ventricular mouse cardiomyocytes.

In der vorliegenden Arbeit wurden Wirkstoffe aus unterschiedlichen Substanzklassen auf ihre antineoplastische Aktivität an humanen Tumorzellinien untersucht. Einige der getesteten Substanzen zeigten gute Ansätze für einen möglichen späteren Einsatz in der Tumortherapie. Die Alkaloide Lycorin und Lycobetain zeigten im Sulforhodamin B-Assay eine sehr gute Wachstumshemmung. Der IC50-Wert der Substanzen lag bei allen getesteten humanen Tumorzellinien unter 3 microM. Trotz der hervorragenden Wachstumshemmung konnte für Lycorin kein Wirkmechanismus gefunden werden. Ein Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus konnte jedoch gezeigt werden. Für Lycobetain kristallisierte sich eine duale Hemmung von Topoisomerase I und II als möglicher Wirkmechanismus heraus. Die Aktivität von Topoisomerase II konnte durch 100 microM Lycobetain vollständig inhibiert werden. Bereits bei 10 microM Lycobetain war keine Topoisomerase I Aktivität mehr detektierbar, was nachweislich auf der Stabilisierung des DNA-Topoisomerase-Komplexes beruhte. Diese resultierte in einer Induktion von DNA-Strangbrüchen, Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus und schließlich der Induktion von Apoptose. Alle diese Eigenschaften deuteten auf eine Topoisomerase-Hemmung als Wirkmechanismus von Lycobetain hin. Untersuchungen von fünf Flavonoiden aus der chinesischen Heilpflanze Scutellaria baicalensis zeigten, daß Baicalin, Baicalein, Skullcapflavon II und Wogonin das Wachstum verschiedener humaner Tumorzellinien hemmten, während Wogonosid bis zu Konzentrationen von 100 microM keine Wirkung zeigte. Baicalein und Baicalin wiesen trotz großer Strukturübereinstimmung keinen einheitlichen Wirkmechanismus auf. Baicalein hemmt, wie Lycobetain, die Aktivität der Topoisomerasen I und II, wobei für Topoisomerase I eine Stabilisierung des binären Intermediates von Topo-isomerase und DNA nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zu Lycobetain interkaliert Baicalein nicht in doppelsträngige DNA, kompetiert jedoch mit dem Hoechst-Farbstoff H33258 um die Bindung an die kleine Furche der DNA. Die Induktion von DNA-Strangbrüchen, sowie der Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus und die Induktion von Apoptose konnten auch für Baicalein gezeigt werden. Messungen mit Baicalin ergaben keinen Hinweis auf Hemmung von humanen Topoisomerasen. Zellzyklusanalysen zeigten einen Arrest in der G0/G1-Phase, was im Gegensatz zu Baicalein auf einen völlig unterschiedlichen, bisher nicht geklärten, Mechanismus hindeutet. Skullcapflavon II hemmte Topoisomerase I und II ab Konzentrationen von 100 microM. Die Stabilisierung des DNA-Topoisomerase-Komplexes konnte jedoch für diese Substanz nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der Struktur könnte jedoch auf einen anderen Mechanismus der Topoisomerase-Inhibierung, möglicherweise die Bindung an die freie Topoisomerase I und die damit verbundene Hemmung der Komplexbildung, geschlossen werden. Für Wogonin konnte in dieser Arbeit kein Wirkmechanismus gefunden werden. In unserer Arbeitsgruppe wurden verschiedene indigoide Bisindole synthetisiert [Hössel, 1996; Hössel, nicht veröffentlicht], die ebenfalls auf ihre antineoplastische Wirkung untersucht wurden. Ein großes Problem stellte dabei die schlechte Löslichkeit dieser Substanzklasse dar. Der Vergleich der Substanzen im Sulforhodamin B-Assay an der Zellinie LXFL529L ergab sehr unterschiedliche Ergebnisse. Indirubin und 5-Jod-Indirubin waren die besten Wachstumshemmstoffe mit IC50-Werten unter 10 microM. Die indigoiden Bisindole besaßen die Fähigkeit in Doppelstrang-DNA zu interkalieren und an die kleine Furche der DNA zu binden, während dies für Deoxytopsentin nicht nachzuweisen war. Im Tubulinpolymerisationsassay hemmten Indirubin, 5-Jod-Indirubin und Bisindolylindol die Polymerisation von Tubulinmonomeren. Im Vergleich zur Referenzsubstanz Colchicin war diese Hemmung jedoch für die Wirkung der Substanzen nicht von Bedeutung. Messungen zur Hemmung der cyclinabhängigen Kinase 1 (cdk1) weisen darauf hin, daß die indigoiden Substanzen ein inhibitorisches Potential für Zellzykluskinasen besitzen. Neben cdk1 hemmen Indirubin und 5-Jod-Indirubin unter anderem cdk5, eine Kinase, die an Mikrotubuliproteinen assoziiert vorliegen kann. Mittels Western-Blotting konnte gezeigt werden, daß die eingesetzte Tubulinpräperation cdk5 enthält. Die geringfügige Hemmung der Tubulinpolymerisation läßt sich möglicherweise durch die Hemmung von mit Tubulin assoziierter cdk5 erklären. Aus dem Labor von Stalina Melnik, Moskau, Rußland wurden unserer Arbeitsgruppe 13 Wirkstoffe zur Untersuchung zur Verfügung gestellt. Bei den Substanzen handelte es sich um Indolocarbazole und Bisindolylmaleimide, die sich durch verschiedene Zuckersubstitutionen an R1 sowie verschiedene Reste an X und R2 unterschieden. Im Sulforhodamin B-Assay konnte mit Ausnahme der Substanzen 1 und 11 für alle Substanzen ein IC50-Wert unter 10 microM ermittelt werden, was auf eine hohe wachstumshemmende Potenz hinweist. Wegen der Strukturähnlichkeit mit Staurosporin wurde zunächst die Inhibierung der Proteinkinase C überprüft. Am isolierten zytosolischen Extrakt konnte, ebenfalls mit Ausnahme der Substanzen 1 und 11, eine Hemmung der PKC nachgewiesen werden, wobei sich die IC50-Werte zwischen 0,4 und 34 microM bewegten. Im Gegensatz dazu waren nur zwei Substanzen (4 und 10) in der Lage in der Zellkultur die PKC-Aktivität im niedrigen Konzentrationsbereich zu hemmen. Bei den Substanzen 2 und 5 war ein IC50-Wert ermittelbar, der aber mindestens zehnfach höher lag als bei der Messung am isolierten Enzym. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, daß die Substanz das Zielprotein in der Zelle nicht erreichen kann. Die Strukturverwandschaft mit den Topoisomerase-Inhibitoren NB 506 und Rebeccamycin, deutete auf humane Topoisomerasen als potentiellen Angriffspunkt der Wirkstoffe hin. Tatsächlich erwiesen sich mehrere Substanzen als mögliche Hemmstoffe von Topoisomerase I und/oder II (siehe Tabelle 13). Ein weiteres Phänomen war die Fähigkeit aller Substanzen, sich an die kleine Furche der DNA anzulagern, während keine Interkalationsfähigkeit nachweisbar war. Die Induktion von Strangbrüchen war lediglich für die Substanzen 4 und 8 im unteren mikromolaren Bereich nachweisbar, während die meisten erst ab 50 microM DNA-Schäden induzierten. Die beste Wirkung zeigten aber auch diese Substanzen bei Untersuchungen zur Hemmung von cyclinabhängigen Kinasen. Dabei muß berücksichtigt werden, daß es sich bei der cdk1 um ein isoliertes Enzym handelt und die Hemmung im zellulären System möglicherweise nicht meßbar ist. Aufgrund der in dieser Arbeit erhaltenen Daten konnte für drei Indolocarbazole ein potentieller Wirkmechanismus gefunden werden. Für Substanz 8 ist die Hemmung von Topoisomerasen ein möglicher Wirkmechanismus, während Substanz 10 sich als möglicher Proteinkinase C-Hemmstoff herausstellte. Substanz 4 scheint einen potentiellen cdk1 Hemmstoff darzustellen.

Das Zweikomponentensystem CiaRH, bestehend aus der membranständigen Histidinkinase CiaH und dem cytoplasmatischen Responseregulator CiaR, wurde als erste nicht-PBP-Resistenzdeterminante in Streptococcus pneumoniae entdeckt. Es beeinflusst neben der β-Laktamresistenz noch weitere Phänotypen, darunter die genetische Kompetenz, die Autolyse und die Virulenz, was seine Bedeutung für die Physiologie der Zelle unterstreicht. Im Zuge dieser Arbeit wurden sieben verschiedene ciaH-Allele aus spontanen β laktamresistenten Labormutanten charakterisiert. Die Allele, deren eine bis zwei Punktmutationen sich über den gesamten Genbereich erstrecken, wurden mit Hilfe der Janus Kassette in den Wildtyp-Stamm R6 eingebracht und untersucht. Es konnte durch β Galaktosidaseassays von Promotor-lacZ-Fusionen gezeigt werden, dass alle ciaH-Allele eine Aktivierung des CiaRH-Systems vermitteln. Diese bewegt sich, bezogen auf den CiaR-regulierten Promotor PhtrA, je nach Allel zwischen dem 4- und dem 26-fachen im Vergleich zum Wildtyp. Phänotypische Studien konnten zeigen, dass die Aktivierung des CiaRH-Systems in allen Fällen zu einer Erhöhung der β-Laktamresistenz, sowie einer verzögerten Autolyse führt. Durch den neu hergestellten alternativen Rifampin-Resistenzmarker RKL222 konnte zudem der Kompetenzphänotyp der Stämme mit verändertem ciaH untersucht und ein Verlust der Kompetenz nachgewiesen werden. Die Ausprägung der Phänotypen korreliert dabei weitestgehend mit der Stärke der CiaRH-Aktivierung. Die abgestufte Aktivierungsstärke der unterschiedlichen ciaH-Allele könnte in Zukunft bei der Untersuchung verschiedener regulatorischer Aspekte von CiaRH von Nutzen sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, welches oder welche der 30 Gene des CiaR-Regulons die CiaRH-Abhängigkeit des Resistenz-, Kompetenz- und Autolysephänotyps von S. pneumoniae vermitteln. Dazu wurde die Bedeutung der stark regulierten Gene ccnA E und htrA phänotypisch näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die durch ccnA-E kodierten csRNAs die Haupteffektoren der genannten Phänotypen sind. Ihr Fehlen hebt den Kompetenzblock, die verzögerte Lyse und größtenteils auch die β Laktamresistenz eines aktivierten CiaRH-Systems auf. Die Serinprotease HtrA dagegen hat keinen deutlichen Effekt auf Resistenz und Autolyse, trägt aber zum Kompetenzblock, der bei aktiviertem CiaRH-System auftritt, bei. In dem kompetenzinhibierenden Medium BHI führt nur die gemeinsame Deletion von ccnA-E und htrA zur Wiederherstellung der Kompetenz, wie beim ciaR-Deletionsstamm, während in dem ebenfalls kompetenzinhibierenden Medium THB die Deletion von htrA dafür ausreicht. Die Identifizierung der csRNAs und HtrA als Effektoren der CiaRH-abhängigen Phänotypen stellt die Basis für weiterführende Analysen über die regulatorischen Zusammenhänge zwischen CiaRH und den Phänotypen dar. In dieser Arbeit konnte zudem erstmals gezeigt werden, dass unter den Genprodukten des CiaR-Regulons die Serinprotease HtrA, die csRNAs und das Mannose-Phosphotransferasesystem ManLMN einen regulatorischen Einfluss auf die Aktivität des CiaRH-Systems ausüben. Die Deletion ihrer Gene führte zu einer unterschiedlich starken Aktivierung der CiaR-abhängigen Genregulation. Da der stärkste aktivierende Effekt durch das Fehlen von HtrA vermittelt wurde, wurde die Art dieser Regulation im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass im Falle einer htrA-Deletion die Aktivierung von CiaR ohne Beteiligung der Histidinkinase CiaH geschieht. Zudem ist der regulatorische Effekt offenbar unabhängig vom Medium und wird nicht über Veränderungen der genetischen Kompetenz vermittelt. Im Zuge dieser Untersuchungen wurde zusätzlich festgestellt, dass die Deletion der Gene comAB und comDE, die für die Kompetenzinduktion essentiell sind, einen inhibitorischen Effekt auf die CiaRH-Aktivität hat. Damit konnten in dieser Arbeit zwei bislang unbekannte Regulationswege identifiziert werden, die die Aktivität des CiaRH-Systems beeinflussen. Im Gegensatz zur Mehrzahl der Zweikomponentensysteme ist CiaRH offensichtlich nicht darauf ausgelegt, starke Änderungen der Genexpression zu vermitteln. Die CiaRH-Aktivität befindet sich vielmehr unter den verschiedensten physiologischen Bedingungen auf einem recht konstanten mittleren Aktivierungsniveau. Stärkere Abweichungen von diesem Niveau führen zur deutlichen Beeinträchtigung der Zellfitness. Die Homöostase der CiaRH-Aktivität ist folglich für S. pneumoniae von großer Bedeutung und muss durch Regulationsmechanismen sichergestellt werden. Regelkreise, wie die in dieser Arbeit identifizierten Regulationswege, stellen dabei eine Möglichkeit dar. Insbesondere die gegenseitige Beeinflussung von CiaRH und den Komponenten des eigenen Regulons kann zur Aufrechterhaltung eines gleichbleibenden Aktivitätsniveaus von CiaRH beitragen. Es zeigt sich mehr und mehr, dass es sich bei CiaRH um ein für die Zellphysiologie bedeutendes System handelt, dessen Aktivität durch ein regulatorisches Zusammenspiel von äußeren und inneren Faktoren gesteuert wird.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde Knochenmarksmaterial von 110 Leukämiepatienten auf das Vorliegen von p53-Gen-Deletionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Interphasezellkerne als auch Metaphasen der Leukämiezellen mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) mit der p53-Gen-Sonde untersucht. Dabei konnte in keinem der 55 untersuchten Patienten mit lymphatischer Leukämie eine Alleldeletion des p53-Gens nachgewiesen werden. Da die p53-Gen-Deletion nach den Literaturangaben bei etwa 7% der Patienten mit lymphatischer Leukämie vorkommt, widersprechen die eigenen Ergebnisse diesen Angaben. Als Grund kann die zu geringe Anzahl der untersuchten Fälle genannt werden. Bei den 55 hier untersuchten Patienten, die an myeloischer Leukämie erkrankt waren, konnte in 7 Fällen (13%) eine Deletion im p53-Gen mittels FISH nachgewiesen werden. Der Anteil der gefundenen p53-Gen-Deletionen war deutlich höher als aufgrund der Literaturangaben erwartet. Die sieben Patienten, bei denen eine p53-Gen-Deletion nachgewiesen wurde, waren alle an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt. Alle Patienten, die eine p53-Gen-Deletion aufwiesen, zeigten auch einen numerisch und strukturell aberranten Karyotyp. Im zweiten Arbeitsabschnitt wurden Knochenmarkszellen von 21 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen mittels spektraler Karyotypisierung (SKY) untersucht und mit dem zytogenetischen Routinebefund verglichen. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen, die durch die konventionelle zytogenetische Untersuchung nicht identifiziert werden konnten. Bei 17 (81%) der Fälle wurden durch SKY zusätzliche Chromosomenaberrationen festgestellt. Nur bei 4 (19%) der Fälle wurde der zytogenetische Befund bestätigt. Im dritten Arbeitsabschnitt wurden Meningeome untersucht. Bei 22 Meningeomen (17 benigne und 5 atypische Meningeomen) wurde mittels Interphase-FISH nach einer Alleldeletion des p53-Gens gesucht. Es konnte jedoch in keinem Fall eine solche Deletion nachgewiesen werden. Weiterhin wurden bei 24 Meningeomen 96 frische Biopsieproben von verschiedenen Tumorarealen mit G-Bänderungstechnik zytogenetisch analysiert. Zur besseren Aufklärung komplex aberranter Karyotypen wurden zwei Fälle (Nr. 1 und Nr. 7) auch mittels SKY-Analyse untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob zytogenetische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors vorliegen. Es gab bei 13 von 24 Meningeomen (54%) zytogenetische Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen innerhalb eines Tumors. 24 (83%) von 29 Meningeomen wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft und 5 (17%) von 29 Meningeomen in den Tumorgrad II. Die Tumorgradverteilung in dieser Arbeit entspricht den Literaturangaben. 13 von 24 Tumoren wiesen entweder einen normalen Karyotyp oder nur eine Monosomie 22 auf. Alle 13 Tumoren wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft. Vier Meningeome wiesen stark aberrante Karyotypen auf, was vermutlich ein Zeichen für die Tumorprogression darstellt. Es wurde auch untersucht, ob eine Korrelation zwischen dem zytogenetischen und histologischen Befunden vorliegt. In der vorliegenden Arbeit hat bei sechs Fällen der histologische Befund nicht mit dem zytogenetischen Befund übereingestimmt, da die Tumore in den Tumorgrad I eingestuft wurden, der zytogenetische Befund aber einen aberranten Chromosomensatz aufwies, der normalerweise nicht bei niedriggradigen Meningeomen, sondern bei atypischen und anaplastischen Meningeomen vorkommt. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination verschiedener zytogenetischer und molekularzytogenetischer Methoden zur Charakterisierung Chromosomaler Aberrationen bei Meningeomen sinnvoll ist.

Der rasante Anstieg an ß-lactamresistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweites medizinisches Problem dar. Für die Bekämpfung von resistenten Stämmen ist es wichtig, den Mechanismus der Resistenzentstehung zu verstehen. Die im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehenden S. pneumoniae-Isolate entstammen zwei unterschiedlichen Strategien zur Untersuchung der Entstehung und Verbreitung ß-lactamresistenter Pneumokokken. Die im Fokus des ersten Teils der vorliegenden Arbeit stehende Glycosyltransferase CpoA wurde von Grebe et al. (1997) als Resistenzdeterminante in zwei spontan-resistenten Labormutanten, P104 und P106, entdeckt. Beide wurden ausgehend von dem sensitiven S. pneumoniae R6 auf einer erhöhten Piperacillinkonzentration selektioniert. Berg et al. und Edman et al., beschrieben CpoA biochemisch als a-Galactosyl-Glycosyl-Diacylglycerin-Synthase, die einen Galactosylrest von UDP-Galaktose auf Glycosyldiacylglycerin (GlcDAG) überträgt (Berg et al., 2001; Edman et al., 2003) und so Galactosyl-Glycosyldiacylglycerin (GalGlcDAG), das Hauptglycolipid der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae bildet. Durch Detektion der Glycolipide in R6, P104, P106 und R6ΔcpoA konnten diese in vitro Daten in vivo bestätigt werden. Keine der cpoA-Mutanten wies eine detektiertbare Menge an GalGlcDAG auf. Neben der Veränderung des Glycolipidverhältnisses offenbarte die Darstellung der Membranlipide auch eine Änderung des Phospholipidverhältnisses. Die phänotypische Charakterisierung der cpoA-Mutanten zeigte eine pleiotropen Phänotyp, der mit einer verlangsamten Generationszeit, einer verminderten Säuretoleranz, einem erhöhten Bedarf an zweiwertigen Magnesiumionen, dem Verlust der natürlichen Transformierbarkeit, einer verzögerten Triton-induzierte Zelllyse, sowie eine reduzierte Bacitracinresistenz einher ging. Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse konnte gezeigt werden, dass vor allem Membranproteine, wie PTS-Systeme und ABC-Transporter, eine unterschiedliche Expressionsstärke im Vergleich zum Parentalstamm R6 aufwiesen. Als Grundlage für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit diente ein von Todorava (2010) durchgeführtes Transformationsexperiment, indem der sensitive S. pneumoniae R6 mit chromosomaler DNA des hochresistenten S. oralis Uo5 transformiert wurde. In sechs Transformationsschritten mit sukzessiv ansteigender Antibiotikakonzentration, konnten sechs Transformanten mit einer stufenweise erhöhten ß-Lactamresistenz generiert werden. Durch die Arbeiten von Todorova et al. (2015), konnte bereits gezeigt werden, dass drei niederaffine PBPs, sowie die Aminosäureligase MurE den Resistenzanstieg der ersten drei Selektionsschritte vermitteln. In dieser Arbeit wurde sich mit den Transformanten der Selektionsschritte vier, fünf und sechs beschäftigt. Durch Genomsequenzierung und anschließende Überprüfung bestimmter Sequenzbereiche konnten die Grenzen des horizontalen Gentransfers aufgewiesen werden. Der Resistenzanstieg in den letzten drei Selektionsschritten wurde nicht durch die Übertragung resistenter Uo5-Gene, sondern einzig durch Punktmutationen vermittelt. Die Charakterisierung, sowie die phänotypischen Auswirkungen der Veränderungen standen nach ihrer Identifizierung im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. In der Transformante des vierten Selektionsschrittes, PCPC, konnten zwei Punktmutationen identifiziert werden. Eine Punktmutation innerhalb des Histidinkinasegens ciaH des Zweikomponentensystems CiaRH und eine weitere in spr1992, welches für ein hypothetisches Protein codiert. Bei CiaH handelt es sich um die erste nicht-PBP-Resistenzdeterminante, die in S. pneumoniae entdeckt wurde (Guenzi et al., 1994). Es zeigte sich, dass das neu entdeckte ciaH-Allel (ciaH773) eine Hyperaktivität des CiaRH-Systems bewirkt und zur Instabilität neigt. Um das Risiko von sekundären Mutationen zu mindern, wurde die Expression von ciaH773 unter die Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors gestellt. Es konnte gezeigt werden, dass ciaH773 einen 11-fachen Anstieg der CiaR-vermittelten Genregulation, sowie eine Erhöhung der ß-Lactamresistenz bewirkt und zum Verlust der natürlichen Transformierbarkeit führt. Neben der Punktmutation in ciaH, konnte im vierten Selektionsschritt noch eine weitere Veränderung in spr1992 identifiziert werden. Beim Genprodukt von spr1992 handelt es sich um hypothetisches Protein. Blastanalysen lassen auf eine regulatorische Funktion von Spr1992 schließen. Die innerhalb dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten stark auf einen Beitrag der Punktmutation in spr1992 zur CiaR-vermittelten Genregulation, sowie zur Cefotaximresistenz in PCPC hin. Zukünftige Untersuchungen könnten den Zusammenhang von spr1992 mit dem CiaRH-System weiter spezifizieren.Innerhalb des fünften Selektionsschrittes konnte eine 10 bp Deletion in der Serinprotease HtrA detektiert werden, die aufgrund der Lokalisation im ersten Drittel der Serinprotease mit einem Knockout von HtrA vergleichbar ist. Es konnte gezeigt werden, dass die HtrA-Deletion zu einer weiteren Steigerung der CiaRH-vermittelten Genregulation, sowie zu einer Erhöhung der ß-Lactamresistenz führt. Durch Einbringen des ciaH773-Allels in S. pneumoniae R6 und anschließender htrA-Deletion konnte dieser regulatorische Effekt auch im Wildtyp-Hintergrund nachgewiesen werden. Durch anschließend durchgeführte globalen Transkriptomanalysen konnten weitere Einblicke in die regulatorische Funktion von HtrA im Hintergrund eines hyperaktiven CiaRH-Systems gewonnen werden. In PCPCCO, der Transformante des sechsten Selektionsschrittes, konnte eine Punktmutation im Penicillin-bindenden Protein 2b innerhalb des bereits im dritten Selektionsschritt ausgetauschten Uo5-Sequenzbereiches als Resistenzdeterminante identifiziert werden. Durch Einbringen von Q406P in S. pneumoniae R6 konnte das Resistenz vermittelnde Potential dieser Veränderung auch im Wildtyphintergrund nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass eine Resistenzdeterminante, die über horizontalen Gentransfer auf S. pneumoniae übertragen wurde, durch eine sekundäre Mutation, das Resistenzniveau ihres Rezipienten weiter steigern kann.

Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst mit der β-Lactamresistenz, Kompetenz, Autolyse, Bakteriocinproduktion und Virulenz eine Vielzahl an Phänotypen in Streptococcus pneumoniae und ist daher von großer physiologischer Bedeutung. Es setzt sich aus der membrangebundenen Sensorkinase CiaH und dem cytoplasmatisch lokalisierten Response Regulator CiaR zusammen. Das CiaRH System ist unter sehr vielen Wachstumsbedingungen aktiv. CiaH ist allerdings für die Aktivierung von CiaR unter bestimmten Bedingungen verzichtbar. CiaR ist jedoch in seiner phosphorylierten Form aktiv, was die Frage nach einer alternativen Phosphatquelle für CiaR aufwirft. Der sog. Crosstalk durch eine fremde Sensorkinase oder niedermolekulare Phosphodonoren wie Acetylphosphat stellen mögliche Wege zur alternativen Phosphorylierung von CiaR dar. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Gene des Acetylphosphat-Stoffwechsels inaktiviert, was zu einer Änderung der Produktion von Acetylphosphat führen sollte. Anschließende Messungen der zellulären Acetylphosphatmenge und der CiaR-abhängigen Promotoraktivitäten in Abwesenheit der Sensorkinase CiaH zeigten klar, dass mit sinkendem Acetylphosphat auch die CiaR-vermittelte Genexpression reduziert wurde. Diese Korrelation legt den Schluss nahe, dass Acetylphosphat tatsächlich den wesentlichen alternativen Phosphodonor für CiaR darstellt. Allerdings wurden auch Hinweise für geringfügigen Crosstalk durch eine andere Sensorkinase erhalten. Im Zuge dieser Experimente ergab sich weiterhin, dass ein Enzym des Acetylphosphat-Stoffwechsels, die Acetatkinase, eine besondere Rolle bei der alternativen Phosphorylierung von CiaR spielt. Eine Reihe von Befunden legt den Schluss nahe, dass Acetatkinase und CiaR möglicherweise interagieren. Eine solche regulatorische Rolle der Acetatkinase ist bisher nicht beschrieben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CiaR-Aktivität durch die Bifunktionalität von CiaH auf nahezu konstantem Niveau gehalten wird. Dabei kann wahrscheinlich Acetat, ein exkretiertes Endprodukt des Acetylphosphat-Stoffwechsels, zur Stimulierung der Phosphataseaktivität von CiaH dienen. Dies könnte von physiologischer Bedeutung sein, um eine von Acetylphosphat ausgehende Phosphorylierung von CiaR durch Acetat im Medium durch Dephosphorylierung zu begrenzen. Somit könnten Acetylphosphat und Acetat Gegenspieler zur Regulation der CiaR-Aktivität darstellen. Ein einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde auf die Auswirkungen von Mutationen in CiaH auf die CiaR-Aktivität eingegangen. Das CiaRH-System wurde als erste Nicht-PBP-Resistenzdeteminante in β-lactamresistenten Labormutanten von S. pneumoniae R6 entdeckt, wobei eine Mutation im Sensorkinasegen ciaH (ciaH306, T230P) eine Erhöhung der CiaR-abhängigen Genexpression vermittelte. Weitere ciaH-Mutationen wurden in anderen spontanresistenten Labormutanten beschrieben. Die Laborallele vermitteln eine Steigerung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität zwischen vier- und 26-fach. Phänotypische Folgen sind die Verringerung der β-Lactamsuszeptibilität, der Verlust der Kompetenz und verändertes Wachstum von S. pneumoniae R6. Im Zuge dieser Arbeit wurden zum ersten Mal veränderte ciaH-Allele in klinischen Pneumokokken-Isolaten identifiziert und charakterisiert. Es zeigte sich eine Verbreitung in Isolaten der Serotypen 6, 7, 9, 19 und 23. Im Gegensatz zu den Laborallelen vermitteln die klinischen Allele eine bis zu dreifache Erhöhung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität. Lediglich das Allel ciaHTpVT beeinflusst die Phänotypen β-Lactamresistenz und Kompetenz. Weiterhin erfolgte die Charakterisierung der Kinase- und Phosphataseaktivitäten der klinischen ciaH-Allele. Hierbei zeigten sich Abweichungen der Stärken beider Funktionen, wobei für ciaH306 ein Phosphatasedefekt festgestellt wurde.

Die Evolution plastidärer und eubakterieller Nukleotid-Transporter, die man aufgrund biochemischer und molekularer Eigenschaften zur Familie der nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporter zusammenfasst, ist noch völlig ungeklärt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die evolutive Sequenzverwandtschaft dieser nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transportern aus Pflanzen und Eubakterien eingehender untersucht. So konnten folgende wichtige Fragestellungen beantwortet werden: 1. Ist der nicht-mitochondriale Nukleotid-Transporter ausschließlich auf intrazelluläre Bakterien und Plastiden beschränkt? Unter Anwendung molekularbiologischer Techniken sowie der Computer-gestützten Analyse laufender Genom- und EST-Projekte wurde im gesamten Organismenreich (Eu- und Prokaryoten) nach weiteren homologen nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transportern gesucht. Aufgrund der gewonnenen Daten konnte postuliert werden, dass die nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporter innerhalb der Eukaryoten ausschließlich auf Plastiden-haltige Organismen beschränkt und damit im gesamten Pflanzenreich verbreitet sind. Innerhalb der Prokaryoten wurden Mitglieder dieser Transporter-Familie bislang nur in einigen wenigen endosymbiontisch bzw. endoparasitisch lebenden Eubakterien identifiziert, die der Gattung Rickettsiales und Chlamydiales angehören. 2. Wie haben sich diese Transporter innerhalb der beiden Organismenreiche entwickelt? Aufgrund der molekularen Identifizierung eines nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporters aus Cyanophora paradoxa, konnte ein monophyletischer Ursprung aller homologen plastidären Transportproteine postuliert werden, da somit die älteste bzw. ursprünglichste Pflanze ein entsprechendes Transportsystem besitzt. Darüber hinaus wurde angenommen, dass im Verlauf der Pflanzenevolution zwischen niederen und höheren Pflanzen infolge der Ausbildung höherer Organisationsformen (Vielzeller) und der Differenzierung in Gewebe bzw. Organen Genduplikationen stattgefunden haben. Das eingeschränkte Vorkommen der nicht-mitochondrialen Nukleotid- Transporter innerhalb der Eubakterien wurde dadurch erklärt, dass die Chlamydien und Rickettsien als obligat intrazellulär lebende Eubakterien von der Außenwelt abgeschirmt sind und daher keine Möglichkeit zum Genaustausch mit weiteren Bakterienspezies besitzen. Dass Vorkommen eines solchen Transportsystems in Vertreter wurde in dieser Arbeit als mögliche Folge eines horizontaler Gentransfers diskutiert. 3. Woher stammt das Gen (Ursprung des Gens) und über welche möglichen evolutiven Wege könnte es auf die jeweiligen Organismen übertragen worden sein? Zahlreiche Indizien sprechen für eine de novo -Entstehung der pflanzlichen Nukleotid-Transporter im Zuge der primären Endosymbiose zwischen einem heterotrophen Eukaryoten und einem Cyanobakterium (Entstehung der ersten Pflanzenzelle). Bei dieser Neuentstehung wurde ein möglicher evolutiver Zusammenhang zwischen den mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Nukleotid- Transportern indiziert, der für eine homologe Entwicklung der Sequenzmotive GLGANVALIF/V, MAYIPLD und GKSGGA in beiden Transporter-Familie sprechen könnte. Für den chlamydialen Nukleotid-Transporter wurde in der vorliegender Arbeit postuliert, dass Chlamydien dieses Gen sowie einige andere pflanzliche Gene mittels horizontalen Gentransfer aus einer frühen, einzelligen Pflanzenzelle erworben haben. Ferner wurde diskutiert, welche Wege für einen horizontaler Gentransfer zwischen Rickettsien und Chlamydien bzw. Rickettsien und Pflanzen möglich sein könnten, um das Vorkommen rickettsieller Nukleotid-Transporter zu erklären. 4. Inwiefern haben sich die Transporteigenschaften nicht-mitochondrialer Nukleotid- Transporter im Laufe ihrer divergenten Entwicklung verändert? Der nicht-mitochondriale Nukleotid-Transporters aus Holospora obtusa (NPTHo), einem obligaten Endosymbiont des Pantoffeltierchens, zeichnet sich im Vergleich zu den bisher charakterisierten Nukleotid-Transporter durch einzigartige Transporteigenschaften aus, die dem intrazellulären Eubakterium einen erheblichen Selektionsvorteil verleihen. Aus den kinetischen Daten des NPTHo- Protein wurde ein neuer Phosphat-gekoppelten Transportmechanismus postuliert, der auf die nichtmitochondrialen Nukleotid-Transporter übertragen ist, wodurch sich die generellen Probleme des bislang postulierten einfachen ATP/ADP-Antiports lösen lassen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Membranproteine mit strukturellen Ähnlichkeiten zu Anion:Cation-Symportern, insbesondere zu den Transportern der NaPi1- Familie aus Tieren untersucht. Neben den bereits bekannten Anion-Transporter (ANTR) aus Arabidopsis thaliana (ROTH et al., 2004) wurde in dieser Arbeit eine homologe Proteinfamilie aus Oryza sativa identifiziert. Dabei konnte die funktionelle Verwandtschaft der Proteine AtANTR5 aus A. thaliana und OsANTR5.1 aus O. sativa mittels Komplementation der antr5-Mutante nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung der physiologischen Bedeutung des AtANTR5-Proteins in der Phosphathomöostase, im Stickstoffstoffwechsel oder bei Pathogenbefall. Mittels GFP-Fusionsexperimenten konnte für AtANTR5 eine subzelluläre Lokalisierung im Golgi-Apparat festgestellt werden. Durch AtANTR5-Promotor-GUS-Pflanzen wurde die gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des Membranproteins untersucht. AtANTR5 weist in den meisten Geweben eine sehr geringe Transkriptmenge auf und ist mittels GUS-Färbung nur in Pollen detektierbar. Dennoch ist das AtANTR5-Protein für die ganze Pflanze von essentieller Bedeutung, da eine Inaktivierung des Gen zu gravierenden phänotypischen Veränderungen, gekennzeichnet durch zwergenhaften Wuchs, eingerollten Blättern und Blattläsionen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu tierischen Phosphattransportern, wurde zunächst der Einfluss von AtANTR5 auf die Phosphathomöostase in entsprechenden „knock out“-Mutanten untersucht. Es konnte jedoch keine Veränderungen im Phosphathaushalt festgestellt werden. Vielmehr weist die antr5-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Aminosäuren, Ammonium und Salz auf. Offensichtlich ist die durch AtANTR5 Transportaktivität innerhalb des Golgi-Apparates von außerordentlichen Wichtigkeit für den pflanzlichen Stoffwechsel. Des weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen AtANTR5 und Pathogenabwehr festgestellt werden. „Northern-Blot“-Analysen zeigten eine Induktion der AtANTR5-Expression als Antwort auf Pathogenbefall durch P. syringae. Zytologische sowie histochemische Analysen haben bei antr5-Pflanzen die Ausprägung zahlreicher Abwehrmechanismen, wie Ablagerungen von Callose in den Zellwänden, Akkumulation von phenolischen Metaboliten, Salizylsäure, PR Proteinen und Wasserstoffperoxid oder Absterben der Zellen, gezeigt. Weiterhin konnte eine erhöhte Resistenz der antr5-Pflanzen gegenüber dem Befall von P. syringae ermittelt werden. Durch die Expression des NahG-Gens in antr5-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Expression der PR-Gene Salizylsäure abhängig, das spontane Absterben der Zellen jedoch Salizylsäure unabhängig war. Dieses Befund lässt den Schluss zu, dass erhöhte SA-Akkumulation und die dadurch aktivierte Abwehr, sekundäre Effekte der AtANTR5-Inaktivierung darstellen.

The screening of metagenomic datasets led to the identification of new phage-derived members of the heme oxygenase and the ferredoxin-dependent bilin reductase enzyme families. The novel bilin biosynthesis genes were shown to form mini-cassettes on metagenomic scaffolds and further form distinct clusters in phylogenetic analyses (Ledermann et al., 2016). In this project, it was demonstrated that the discovered sequences actually encode for active enzymes. The biochemical characterization of a member of the heme oxygenases (ΦHemO) revealed that it possesses a regiospecificity for the α-methine bridge in the cleavage of the heme macrocycle. The reaction product biliverdin IXα was shown to function as the substrate for the novel ferredoxin-dependent bilin reductases (PcyX reductases), which catalyze its reduction to PEB via the intermediate 15,16-DHBV. While it was demonstrated that ΦPcyX, a phage-derived member of the PcyX reductases, is an active enzyme, it also became clear that the rate of the reaction is highly dependent on the employed redox partner. It turned out that the ferredoxin from the cyanophage P-SSM2 is to date the most suitable redox partner for the reductases of the PcyX group. Furthermore, the solution of the ΦPcyX crystal structure revealed that it adopts an α/β/α-sandwich fold, typical for the FDBR-family. Activity assays and subsequent HPLC analyses with different variants of the ΦPcyX protein demonstrated that, despite their similarity, PcyX and PcyA reductases must act via different reaction mechanisms. Another part of this project focused on the biochemical characterization of the FDBR KflaHY2 from the streptophyte alga Klebsormidium flaccidum. Experiments with recombinant KflaHY2 showed that it is an active FDBR which produces 3(Z)-PCB as the main reaction product, like it can be found in reductases of the PcyA group. Moreover, it was shown that under the employed assay conditions the reaction of BV to PCB proceeds in two different ways: Both 3(Z)-PΦB and 18¹,18²-DHBV occur as intermediates. Activity assays with the purified intermediates yielded PCB. Hence, both compounds are suitable substrates for KflaHY2. The results of this work highlight the importance of the biochemical experiments, as catalytic activity cannot solely be predicted by sequence analysis.

The study provides insights into the dynamic processes of vascular epiphyte vegetation in two host tree species of lowland forest in Panama. Further, a novel approach is presented to examine the possible role of host tree identity in the structuring of vascular epiphyte communities: For three locally common host tree species (Socratea exorrhiza, Marila laxiflora, Perebea xanthochyma) we created null models of the expected epiphyte assemblages assuming that epiphyte colonization reflected random distribution of epiphytes in the forest. In all three tree species, abundances of the majority of epiphyte species (69 – 81 %) were indistinguishable from random, while the remaining species were about equally over- or underrepresented compared to their occurrence in the entire forest plot. Permutations based on the number of colonized trees (reflecting observed spatial patchiness) yielded similar results. Finally, a Canonical Correspondence Analysis also confirmed host-specific differences in epiphyte assemblages. In spite of pronounced preferences of some epiphytes for particular host trees, no epiphyte species was restricted to a single host. We conclude that the epiphytes on a given tree species are not simply a random sample of the local species pool, but there are no indications of host specificity either. To determine the qualitative and quantitative long-term changes in the vascular epiphyte assemblage of the host tree Socratea exorrhiza, in the lowland forest of the San Lorenzo Crane Plot, we followed the fate of the vascular epiphyte assemblage on 99 individuals of this palm species, in three censuses over the course of five years. The composition of the epiphyte assemblage changed little during the course of the study. While the similarity of epiphyte vegetation decreased on single palm individuals through time, the similarity analyzed over all palms increased. Even well-established epiphyte individuals experienced high mortality with only 46 % of the originally mapped individuals surviving the following five years. We found a positive correlation between host tree size and epiphyte richness and detected higher colonization rates of epiphytes per surface area on larger trees. Epiphyte assemblages on single Socratea exorrhiza trees were highly dynamic while the overall composition of the epiphyte vegetation on the host tree species in the study plot was rather stable. We suggest that higher recruitment rates due to localized seed dispersal by already established epiphytes on larger palms promote the colonization of epiphytes on larger palms. Given the known growth rates and mortality rates of the host tree species, the maximum time available for colonization and reproduction of epiphytes on a given Socratea exorrhiza tree is estimated to be about 60 years. Changes in the epiphyte vegetation of c. 1000 individuals of the host tree species Annona glabra at Barro Colorado Island over the course of eight year were documented by means of repeated censuses. Considerable increase in the abundance of the dominating epiphyte species and ongoing colonization of the host tree species suggests that the epiphyte vegetation has not reached a steady state in the maximal 80 years since the establishment of the host tree. Epiphyte species composition as a whole was rather stable. We disentangled the relationship between epiphyte colonization and tree size/available time for colonization with the finding that tree size explained only a low proportion of colonization while other factors like connectivity to dispersal source and time explain may explain a larger part. Epiphyte populations are patchily distributed and examined species exhibit properties of a metapopulation with asynchronous local population growth, high local population turnover, a positive relationship between regional occurrence and patch population size, and negatively correlated relationship between extinction and patch occupancy. The documented metapopulation processes highlight the importance of not colonized suitable habitat for the conservation of epiphytes.

Das Zytosol ist der Hauptort der Proteinbiosynthese. Während viele Proteine im Zytosol bleiben, muss ein Großteil zu unterschiedlichen Kompartimenten der Zelle transportiert werden. Die korrekte Lokalisation der Polypeptide ist essentiell für die Homöostase der Zelle. Werden Proteine fehlgeleitet oder gar nicht transportiert, können diese in der Zelle aggregieren, was zu Stress bis hin zum Zelltod führen kann. Obwohl der Import mitochondrialer Proteine über die verschiedenen Membranen der Mitochondrien sehr gut erforscht ist, war lange unklar, wie diese Proteine zu ihrem Zielorganell transportiert werden. In den letzten Jahren wurde diese Wissenslücke teilweise gefüllt, neue zytosolische Faktoren wurden identifiziert und alternative Transportwege aufgedeckt. Eine solche Entdeckung war der Transportweg namens ER-SURF. Hier werden mitochondriale Proteine an die Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert, wo sie vom Co-Chaperon Djp1 gebunden und zu den Mitochondrien gebracht werden. Im Zuge der Studie zu ER-SURF wurde ein Protein identifiziert, das bisher noch uncharakterisiert war. Dieses Protein nannten wir Ema19 („Efficient Mitochondria Targeting–Associated Protein 19”). Es ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das vier Transmembrandomänen besitzt. Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von Ema19 für die Zelle zu analysieren. Durch ein Alignment konnte ich feststellen, dass das Protein bis in den Menschen hoch konserviert ist, was auf eine wichtige Rolle für die Zelle schließen ließ. Da Ema19 im Zusammenhang mit dem ER-SURF Transportweg identifiziert wurde, habe ich zunächst eine mögliche Rolle für den Transport und Import mitochondrialer Proteine in unterschiedlichen Experimenten getestet. Im Laufe der Arbeit wurde jedoch deutlich, dass Ema19 keine direkte Rolle beim Import von mitochondrialen Proteinen spielt. Allerdings konnte ich durch mehrere unabhängige Versuche einen Zusammenhang mit der Lokalisation und dem Abbau mitochondrialer Proteine feststellen. Fehlt Ema19 in der Zelle, ist vor allem das mitochondriale Protein Oxa1 mehr am endoplasmatischen Retikulum vorzufinden. Ebenso konnte ich feststellen, dass Oxa1, sowie das Intermembranraumprotein Erv1, langsamer abgebaut werden als in Wildtypzellen. Diese Experimente geben erste Hinweise auf eine mögliche Rolle von Ema19 für den Abbau mitochondrialer Proteine an der ER-Membran. Nichtsdestotrotz bleiben noch viele Fragen offen und weitere Versuche sind nötig, um diese Hypothese weiter zu unterstützen.

Das Zwei-Komponenten System CiaRH von S. pneumoniae ist an der ß-Laktam-Resistenz, Regulation der genetischen Kompetenz, Lyse und Virulenz beteiligt. Unter den 16 Promotoren, die von diesem System kontrolliert werden, befanden sich die fünf stärksten Promotoren in intergenen Regionen. Hieraus resultierte die Vermutung, dass diese Promotoren die Expression von kleinen nichtkodierenden RNAs steuern könnten. Mittels Northern-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass von diesen Promotoren aus kleine RNAs mit einer Größe von 87 bis 151 Basen exprimiert werden. Im Stamm mit deletierten ciaR waren diese RNAs nicht bzw. kaum detektierbar. Die fünf CiaRH-abhängigen kleinen RNAs wurden csRNAs benannt (cia controlled small RNAs). Durch Northern-Analyse an vier verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums konnte gezeigt werden, dass die csRNAs in hoher Konzentration sowohl während der exponentiellen als auch in der stationären Wachstumsphase in den Zellen von S. pneumoniae vorhanden sind. Mittels 3´-RACE-Analyse wurde die Länge der csRNAs auf die Base genau bestimmt. csRNA1, csRNA2, csRNA3 und csRNA4 bestehen aus 87 bis 101 Nukleotiden. csRNA5 besitzt dagegen eine Länge aus 151 Basen. Die Promotoren der stromabwärts der kleinen RNAs liegenden Gene wurden mittels 5´-RACE-Analyse kartiert und ihre Expression mittels realtime RT-PCR-Analyse im Wildtyp, im ciaR-Deletionsstamm und einem Stamm mit aktiviertem CiaRH-System untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass diese Gene unabhängig von CiaRH exprimiert werden. Um die Beteiligung der csRNAs an den CiaRH-assoziierten Phänotypen aufzuklären, wurden die Gene für alle fünf csRNAs deletiert und mit verschiedenen Antibiotika-Resistenz-Genen ersetzt. Durch Kombination aller Deletionen wurde der Stamm S. pneumoniae RK12345 konstruiert, welcher keine csRNA mehr exprimiert. In Stamm RK12345 konnte eine erniedrigte Transformationseffizienz und eine erhöhte Lyserate im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae R6 beobachtet werden. Hierdurch wurde gezeigt, dass die csRNAs eine Rolle bei den CiaRH-regulierten Prozessen spielen. Kleine RNAs üben ihren regulatorischen Effekt meist durch Wechselwirkung mit der mRNA ihrer Zielgene aus. Die beiden RNA-Moleküle interagieren hierbei über komplementäre Sequenzbereiche. Durch diese Basenpaarungen kommt es zur Hemmung oder Aktivierung der Translation bzw. zum Abbau des RNA-RNA-Interaktionskomplexes. Um die Ursachen der csRNA-vermittelten phänotypischen Veränderungen bestimmen zu können, wurde die Identifizierung der csRNA-Zielgene angestrebt. Mittels bioinformatischer Analyse wurde eine große Anzahl putativer Zielgene vorhergesagt, wovon nach Anlegung verschiedener Kriterien letztendlich 13 zu den weiteren Untersuchungen eingesetzt wurden. Um diese teilweise uncharakterisierten Gene auf eine posttranskriptionelle Regulation durch die csRNAs untersuchen zu können, wurde ein integratives Translations Probe Plasmid namens pTP3 konstruiert. Dieses Plasmid ermöglicht die Klonierung von 5´-Genfragmenten vor das ´lacZ-Gen, wodurch in frame-Zielgen´-´lacZ-Fusionsproteine entstehen. Die Expression des entstandenen Fusionsgens erfolgt hierbei von einem konstitutiven CiaRH-unabhängigen Promotor, namens PvegT. Die Klonierung und Untersuchung der ß-Galaktosidase- Expression der Zielgen´-´lacZ-Fusionsproteine ergab, dass die klonierten Fragmente der Gene spr0081, comC, spr1645 und cibB durch die csRNAs reguliert werden. Die Untersuchung dieser vier Zielgene bei Expression von den eigenen Promotoren und Intaktheit der entsprechenden mRNAs zeigte, dass letztendlich zwei Gene posttranskriptionell negativ durch die csRNAs reguliert werden. Interessanterweise ist eines dieser Zielgene das comC-Gen, welches für das Vorläuferpeptid des Kompetenz-Phäromons CSP kodiert. Diese Beobachtung könnte eine mögliche Ursache für die csRNA-abhängige veränderte Transformierbarkeit von Stamm RK12345 darstellen. Das zweite Zielgen der csRNAs, spr0081, kodiert für einen bisher uncharakterisierten ABC-Transporter, welcher möglicherweise am Transport eines Kohlenhydrats beteiligt ist. Letztendlich wurde die direkte Interaktion der in vitro produzierten mRNA dieser beiden Zielgene mit den csRNAs durch die Entwicklung und Etablierung einer neuartigen Methode der Bandshift-Analyse untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass die mRNA von comC mit allen fünf csRNAs Interaktions-komplexe bildet und die mRNA von spr0081 befähigt ist mit vier csRNAs Interaktionskomplexe zu bilden. Schließlich wurde der Effekt einzelner RNAs auf die Expression des ComC´-´lacZ-Fusionsproteins getestet. Hierbei konnte gezeigt werden, dass csRNA1, csRNA2 und csRNA3 einerseits bzw. csRNA4 und csRNA5 andererseits genügen, um den Effekt aller fünf RNAs ausüben zu können. Die stärkste Hemmungsaktivität einer einzelnen csRNA konnte bei csRNA4 festgestellt werden.

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in die drei Themenschwerpunkte FICTION-Technik (Fluorescence-Immunophenotyping and Interphase Cytogenetic as a Tool for Investigation of Neoplasms), SKY-Technik (Spectral Karyotyping) und Kultivierungsverfahren. Mittels der FICTION-Technik konnte gezeigt werden, dass die Trisomie 12 bei 53 untersuchten B-CLL-Patienten mit etwa 11% deutlich seltener auftrat, als in der Literatur beschrieben. Es scheint eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer Trisomie 12 und einer atypischen B-CLL vorzuliegen, da drei der sechs Fälle mit Trisomie 12 eine atypische B-CLL Variante darstellten. Bei einem Fall konnte der Trisomie 12 tragende Klon über 13 Monate beobachtet werden und zeigte in diesem Zeitraum keine signifikante Veränderung. Der Klon blieb weitestgehend stabil. Eine aus Vorversuchen von Doris Herrmann vermutete Existenz einer Monosomie 12 bei B-CLL-Patienten (persönliche Miteilung) hat sich nicht bestätigt. Bei allen untersuchten Proben lagen die Zellen mit Monosomie 12 unter dem ermittelten cut off level von 10,2% für die Hybridisierung. Als zweiter Schwerpunkt wurde die Einsatzfähigkeit der SKY-Technik in der Tumorzytogenetik durch die Analyse von 20 Tumorfällen ausgetestet. Unter den 20 untersuchten tumorzytogenetischen Fällen konnte bei 12 der durch G-Bänderung erhobene Befund verbessert und erweitert werden. Bei drei Fällen wurden neue, in der G-Bandenanalyse nicht gefundene Aberrationen identifiziert und in fünf Fällen bestätigte sich der G-Bandenbefund. Die SKY-Technik erwies sich als wertvolle Methode zur weiteren Charakterisierung von komplex aberranten Karyotypen oder zur Identifikation von Markerchromosomen, wobei nicht alle Aberrationen aufklärt werden konnten. Unter den 20 untersuchten Fällen wurde bei zwei myeloischen Erkrankungen neben einer Monosomie 7 die Translokation t(3;21)(q26;q22) gefunden. Möglicherweise kommt diese häufiger als bisher beschrieben in myeloischen Erkrankungen vor, weil sie durch die G-Bandenanalyse nicht sicher erkannt wird. Vorzugsweise scheint sie neben einer Monosomie 7 aufzutreten. In dem Schwerpunkt, der sich mit der Kultivierung von neoplastischen B-Zellen beschäftigte, konnte ein neues Kultivierungsverfahren für B-Zellen entwickelt werden. Eine Kultivierung mit MP-6 Zellen konditioniertem ISCOVE-Medium und dem Phorbolester TPA zeigte in 15 von 20 Proben einen synergistischen Effekt auf die Proliferationssteigerung (um das 1,5-21 fache) gegenüber dem TPA-Standardansatz in RPMI-Medium. Durch eine Metaphasenanalyse von fünf Fällen mit numerischen Mosaikbefunden konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen aberranten und normalen Klonen bei beiden Kultivierungsarten etwa gleich blieb. Eine Lebend-Tot-Bestimmung vor und nach der Kultivierung zeigte, dass nach 72-stündiger Kultivierung in den Kulturen mit dem höchsten Mitoseindex die durchschnittlich Lebendzellzahl am geringsten (ca. 70%) war.

Cell division and cell elongation are fundamental processes for growth. In contrast to animal cells, plant cells are surrounded by rigid walls and therefore loosening of the wall is required during elongation. On the other hand, vacuole size has been shown to correlate with cell size and inhibition of vacuolar expansion limits cell growth. However, the specific role of the vacuole during cell elongation is still not fully resolved. Especially the question whether the vacuole is the leading unit during cellular growth or just passively expands upon water uptake remains to be answered. Here, we review recent findings about the contribution of the vacuole to cell elongation. In addition, we also discuss the connection between cell wall status and vacuolar morphology. In particular, we focus on the question whether vacuolar size is dictated by cell size or vice versa and share our personnel view about the sequential steps during cell elongation.

Arctic, Antarctic and alpine biological soil crusts (BSCs) are formed by adhesion of soil particles to exopolysaccharides (EPSs) excreted by cyanobacterial and green algal communities, the pioneers and main primary producers in these habitats. These BSCs provide and influence many ecosystem services such as soil erodibility, soil formation and nitrogen (N) and carbon (C) cycles. In cold environments degradation rates are low and BSCs continuously increase soil organic C; therefore, these soils are considered to be CO2 sinks. This work provides a novel, nondestructive and highly comparable method to investigate intact BSCs with a focus on cyanobacteria and green algae and their contribution to soil organic C. A new terminology arose,basedonconfocallaserscanningmicroscopy(CLSM) 2-D biomaps, dividing BSCs into a photosynthetic active layer (PAL) made of active photoautotrophic organisms and a photosynthetic inactive layer (PIL) harbouring remnants of cyanobacteria and green algae glued together by their remaining EPSs. By the application of CLSM image analysis (CLSM–IA) to 3-D biomaps, C coming from photosynthetic activeorganismscouldbevisualizedasdepthprofileswithC peaks at 0.5 to 2mm depth. Additionally, the CO2 sink character of these cold soil habitats dominated by BSCs could be highlighted, demonstrating that the first cubic centimetre of soil consists of between 7 and 17% total organic carbon, identified by loss on ignition.

Die Phagozytose apoptotischer Zellen ist ein essentieller Schritt bei der Embryogenese und dem Erhalt der Gewebehomöostase. Phagozyten beseitigen dabei nicht nur die sterbenden Zellen und verhindern damit eine Freisetzung immunogener zellulärer Bestandteile ins umliegende Gewebe, sondern unterdrücken aktiv pro-inflammatorische Antworten, wie die Sekretion von TNFalpha oder die Produktion von NO. Das Wissen über die zugrunde liegenden Prozesse und Mechanismen ist noch lückenhaft. Auch wenn bereits eine Vielzahl von beteiligten Rezeptoren und Reaktionen der Phagozytenzellen auf apoptotische Zellen (AZ) bekannt sind, sind die verantwortlichen und vermutlich sehr komplexen Signalwege noch relativ wenig erforscht. Die Produktion von kleinen reaktiven Molekülen wie NO oder Sauerstoffradikale (ROS) durch Makrophagen ist ein initialer Schritt zur Bekämpfung von Pathogenen. Zu Beginn meiner Promotion lagen noch keinerlei Daten bezüglich eines Einflusses apoptotischen Materials auf die ROS-Produktion aktivierter Makrophagen vor. Der grundlegende anti-inflammatorische Makrophagenphänotyp nach der Phagozytose von AZ führte zur Hypothese, dass auch diese durch AZ beeinflusst würde. Diese Überlegung bildete den Ausgangspunkt für meine Studien: Zunächst gelang es mir, ein Testsystem zur Untersuchung anti-inflammatorischer Effekte in Makrophagen nach der Phagozytose von AZ zu etablieren. Dabei konnte ich zeigen, dass die von mir verwendeten apoptotischen Jurkat-Zellen von murinen RAW264.7-Makrophagen aufgenommen werden und deren pro-inflammatorische Antwort, gemäß der Literatur, zu hemmen vermögen. In durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte ich mittels eines Redox-sensitiven Farbstoffs zeigen, dass AZ im Gegensatz zu nekrotischen oder vitalen Zellen die TPA-vermittelte ROS-Produktion in Makrophagen inhibieren. Sowohl durch EMSA und Western Blot-Analysen, als auch durch die Verwendung von d/n PPARgamma und PKCalpha-überexprimierenden Makrophagen, konnte ich nachweisen, dass die initiale Hemmung des ‚oxidative burst’ (innerhalb 1 Stunde) über eine PPARgamma-induzierte Inhibition der PKCalpha-vermittelt wird. Für diese reicht eine Bindung von AZ an die Makrophagen aus, während zu späteren Zeitpunkten andere, noch unbekannte Faktoren involviert scheinen. Dieser Mechanismus scheint auch in primären humanen Makrophagen von Bedeutung zu sein. Die Beobachtung, dass es nach der Behandlung aktivierter Makrophagen mit AZ zu einer verminderten IFNgamma-vermittelten NO-Produktion bei stark exprimierter iNOS kommt, ließ die Theorie zu, dass nicht - wie bisher vermutet - TGFbeta für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch hier gelang es mir, neue Erkenntnisse über den zugrunde liegenden Mechanismus der AZ-vermittelten NO-Inhibition zu erlangen: Mittels eines Aktivitäts-Assays und durch Einsatz des spezifischen Arginaseinhibitors nor-NOHA konnte ich zeigen, dass der Einfluss von AZ auf aktivierte Makrophagen nicht etwa deren iNOS-Aktivität verringert, sondern vielmehr aus einer erhöhten Arginaseaktivität resultiert. Diese führt scheinbar zu einer verminderten Substratverfügbarkeit für die iNOS und hemmt so die NO-Produktion. Western Blot- und quantitative PCR-Versuche zeigten eine erhöhte Arginase II-Expression nach Stimulation mit AZ, welches ebenfalls meine Theorie unterstützt. Ferner konnte ich durch den Einsatz von AZ-konditioniertem Medium zeigen, dass ein noch unbekannter, von AZ sekretierter löslicher Faktor für die Hemmung der NO-Produktion verantwortlich ist. Die Beobachtung einer sehr frühen COX-2-Expression nach der Inkubation von Makrophagen mit AZ und das Nichtvorhandensein entsprechender Beobachtungen in der Literatur führten dazu, dass ich mich im letzten Teil meiner Arbeit mit dem hierfür verantwortlichen Mechanismus befasste: Unter Verwendung eines Luziferase-Assays, bei dem das Luziferasegen mit der 3´-UTR oder AREs des COX-2-Gens gekoppelt war, konnte ich zeigen, dass - wie schon bei der Inhibition der NO-Produktion durch die Arginase II - ein von AZ sekretierter löslicher Faktor für eine schnelle, AZ-spezifische und höchstwahrscheinlich durch COX-2-mRNA-Stabilisierung vermittelte Proteinexpression verantwortlich war. Eine schnelle Erhöhung der COX-2-mRNA nach AZ-Stimulus sowie jüngste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, welche eine erhöhte COX-2-mRNA-Halbwertszeit zeigen, unterstützen diese Hypothese. Die von mir gewonnenen neuen Erkenntnisse über die Makrophagenreprogrammierung nach der Erkennung von AZ tragen zu einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Mechanismen bei. Es besteht die hoffnungsvolle Aussicht, dass das Verstehen und die Manipulation der ablaufenden Prozesse bei der Phagozytose von AZ eines Tages einerseits neue Therapiemöglichkeiten zur Behandlung von Infektions- und Autoimmunkrankheiten und andererseits verbesserte Strategien zur Bekämpfung von Krebs ermöglichen werden.

Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) wurden im Jahre 2002 in Bordetella‐Phagen entdeckt und stellen eine einzigartige Klasse unter den Retroelementen dar. Durch einen speziellen „Copy‐and‐ Replace“ Mechanismus sind sie in der Lage ein bestimmtes Zielgen zu hypermutieren. Bei diesem Mutagenic Homing‐Prozess wird die RNA der Templat‐Region (TR) durch die elementeigene reverse Transkriptase (RT) transkribiert. Die dabei entstandene mutierte cDNA wird anschließend in die variable Region (VR) des Zielgens inkorporiert und dieses somit diversifiziert. Hierbei steht der experimentelle Nachweis für die Hypermutation durch die RT noch aus. Zudem spielt das akzessorische Protein (Avd) eine weitere wichtige Rolle im Mutagenic Homing Prozess, wobei dessen tatsächliche Funktion noch nicht charakterisiert werden konnte. Bis dato gibt es vor allem Analysen in Bezug auf das Bordetella‐Phagen DGR, womit sich die Frage nach anderen Systemen und allgemeiner Anwendbarkeit stellt. Daher war die Analyse des Nostoc sp. PCC 7120 DGR Hauptgegenstand dieser Arbeit, wobei der Fokus auf der Untersuchung der reversen Transkripase (nRT), sowie der Charakterisierung des akzessorischen Proteins (nAvd) aus dem Nostoc sp. PCC 7120 DGR lag. Die nRT konnte überexprimiert werden, wobei sie nur teilweise löslich vorlag. Eine effektive Aufreinigung der nRT konnte mit den hier getesteten Methoden nicht erzielt werden, sodass andere Aufreinigungsmethoden erprobt werden müssen. Zudem war die nRT nicht lagerfähig, wodurch eine regelmäßige neue Proteinpräparation nötig war. In Aktivitätsstudien konnten erste Hinweise auf eine Aktivität der nRT erhalten werden. Dabei konnten die entstandenen Nukleinsäuren nicht nur detektiert, sondern auch mittels analytischem Verdau als DNA identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die synthetisierte cDNA mittels PCR amplifiziert und die PCR‐Produkte anschließend sequenziert werden. Hierbei wurden jedoch keine Adenin‐spezifischen oder sonstigen Mutationen beobachtet. Somit konnte kein Nachweis für Hypermutation durch die RT erbracht werden. Bei Untersuchungen bezüglich einer möglichen Interaktion zwischen nRT und nAvd konnte keine erhöhte nRT‐Aktivität durch die nAvd festgestellt werden. Die Untersuchungen der nAvd zeigten, dass diese Nukleinsäuren bindet. Hierbei waren Präferenzen gegenüber verschiedenen Nukleinsäuren zu beobachten. Vor allem RNA/DNA‐Hybride zeigt die höchste Affinität gegenüber der nAvd, während dsDNA eine höhere Affinität zur nAvd aufweist als ssRNA. Zudem ist die nAvd in der Lage Nukleinsäuren zu hybridisieren. Hierbei hybridisiert sie ATreiche DNA‐Moleküle von mittlerer Länge (48 bp) am effizientesten. Ein von der nAvd katalysierter Strangaustausch konnte nicht beobachtet werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die nAvd selbst bis 95 °C hitzestabil ist und im Anschluss an Hitzestress weiterhin Nukleinsäuren hybridisieren kann. Darüber hinaus ist sie befähigt Nukleinsäuren unter Hitzestress zu stabilisieren. Diese Ergebnisse lassen auf eine Rolle der nAvd als Lotse oder zur Stabilisierung von Nukleinsäuren schließen.

Potassium (K) is essential for the processes critical for plant performance, including photosynthesis, carbon assimilation, and response to stress. K also influences translocation of sugars in the phloem and regulates sucrose metabolism. Several plant species synthesize polyols and transport these sugar alcohols from source to sink tissues. Limited knowledge exists about the involvement of K in the above processes in polyol-translocating plants. We, therefore, studied K effects in Plantago major, a species that accumulates the polyol sorbitol to high concentrations. We grew P. major plants on soil substrate adjusted to low-, medium-, or high-potassium conditions. We found that biomass, seed yield, and leaf tissue K contents increased in a soil K-dependent manner. K gradually increased the photosynthetic efficiency and decreased the non-photochemical quenching. Concomitantly, sorbitol levels and sorbitol to sucrose ratio in leaves and phloem sap increased in a K-dependent manner. K supply also fostered plant cold acclimation. High soil K levels mitigated loss of water from leaves in the cold and supported cold-dependent sugar and sorbitol accumulation. We hypothesize that with increased K nutrition, P. major preferentially channels photosynthesis-derived electrons into sorbitol biosynthesis and that this increased sorbitol is supportive for sink development and as a protective solute, during abiotic stress

Most of the mitochondrial proteins in yeast are encoded in the nuclear genome, get synthesized by cytosolic ribosomes and are imported via TOM and TIM23 into the matrix or other subcompartments of mitochondria. The mitochondrial DNA in yeast however also encodes a small set of 8 proteins from which most are hydrophobic membrane proteins and build core components of the OXPHOS complexes. They get synthesized by mitochondrial ribosomes which are descendants of bacterial ribosomes and still have some similarities to them. On the other hand, mitochondrial ribosomes experienced various structural and functional changes during evolution that specialized them for the synthesis of the mitochondrial encoded membrane proteins. The mitoribosome contains mitochondria-specific ribosomal proteins and replaced the bacterial 5S rRNA by mitochondria-specific proteins and rRNA extensions. Furthermore, the mitoribosome is tethered to the inner mitochondrial membrane to facilitate a co-translational insertion of newly synthesized proteins. Thus, also the assembly process of mitoribosomes differs from that of bacteria and is to date not well understood. Therefore, the biogenesis of mitochondrial ribosomes in yeast should be investigated. To this end, a strain was generated in which the gene of the mitochondrial RNA-polymerase RPO41 is under control of an inducible GAL10-promoter. Since the scaffold of ribosomes is built by ribosomal RNAs, the depletion of the RNA-polymerase subsequently leads to a loss of mitochondrial ribosomes. Reinduction of Rpo41 initiates the assembly of new mitoribosomes, which makes this strain an attractive model to study mitoribosome biogenesis. Initially, the effects of Rpo41 depletion on cellular and mitochondrial physiology was investigated. Upon Rpo41 depletion, growth on respiratory glycerol medium was inhibited. Furthermore, mitochondrial ribosomal 21S and 15S rRNA was diminished and mitochondrial translation was almost completely absent. Also, mitochondrial DNA was strongly reduced due to the fact that mtDNA replication requires RNA primers that get synthesized by Rpo41. Next, the effect of reinduction of Rpo41 on mitochondria was tested. Time course experiments showed that mitochondrial translation can partially recover from 48h Rpo41 depletion within a timeframe of 4.5h. Sucrose gradient sedimentation experiments further showed that the mitoribosomal constitution was comparable to wildtype control samples during the time course of 4.5h of reinduction, suggesting that the ribosome assembly is not fundamentally altered in Gal-Rpo41 mitochondria. In addition, the depletion time was found to be critical for recovery of mitochondrial translation and mitochondrial RNA levels. It was observed that after 36h of Rpo41 depletion, the rRNA levels and mitochondrial translation recovered to almost 100%, but only within a time course of 10h. Finally, mitochondria from Gal-Rpo41 cells isolated after different timepoints of reinduction were used to perform complexome profiling and the assembly of mitochondrial protein complexes was investigated. First, the steady state conditions and the assembly process of mitochondrial respiratory chain complexes were monitored. The individual respiratory chain complexes and the super-complexes of complex III, complex IV and complex V were observed. Furthermore, it was seen that they recovered from Rpo41 depletion within 4.5h of reinduction. Complexome profiles of the mitoribosomal small and large subunit discovered subcomplexes of mitoribosomal proteins that were assumed to form prior to their incorporation into assembly intermediates. The complexome profiles after reinduction indeed showed the formation of these subcomplexes before formation of the fully assembled subunit. In the mitochondrial LSU one subcomplex builds the membrane facing protuberance and a second subcomplex forms the central protuberance. In contrast to the preassembled subcomplexes, proteins that were involved in early assembly steps were exclusively found in the fully assembled subunit. Proteins that assemble at the periphery of the mitoribosome during intermediate and late assembly steps where found in soluble form suggesting a pool of unassembled proteins that supply assembly intermediates with proteins. Taken together, the findings of this thesis suggest a so far unknow building-block model for mitoribosome assembly in which characteristic structures of the yeast mitochondrial ribosome form preassembled subcomplexes prior to their incorporation into the mitoribosome.

Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Verbindungen aus imperfekten Pilzen zu selektieren und zu isolieren, die ueber die Hemmung des JAK2-STAT-1alpha-Signalweges die Induktion der iNOS-Expression in humanen A549/8-Zellen, humanen Lungen-Alveolarepithel-Karzinom-Zellen, negativ beeinflussen. Es konnten drei Verbindungen aus unterschiedlichen Penicillium-Staemmen isoliert werden, die durch Reportergen-Analysen betreffend der Wirkung der Rohfermentationsprodukte auf die iNOS-, eNOS-Promotor-Aktivitaet sowie der STAT-1alpha-abhaengigen Promotor-Aktivitaet selektiert wurden. Die Substanzen Sporogen-A01, S-Curvularin sowie S14-95 zeigten in den Reportergen-Analysen aehnliche Aktivitaeten, die sich nur in der Potenz unterschieden. Waehrend Sporogen-A01 und S-Curvularin eine, wenn auch konzentrationsunabhaengige, Hemmung auf die NF-kappaB-abhaengige Promotor-Aktivitaet in HeLa-S3-Zellen zeigten, so ergab sich fuer S14-95 kein Einfluss auf diesen Signaltransduktionsweg. Bei S14-95 scheint es sich um eine spezifisch die IFN-gamma-abhaengigen Wege der transkriptionellen Aktivierung der iNOS hemmende Verbindung zu handeln. Die Effekte dieser Substanz auf den humanen TNF-alpha-Promotor liegen wie auch fuer S-Curvularin bei 80% Hemmung und auch der humane COX-2-Promotor wurde durch alle drei Substanzen in Reportergen-Analysen stark gehemmt. In A549/8-Zellen zeigten die Substanzen keine (S14-95 und S-Curvularin) oder lediglich geringe (Sporogen-A01) Wirkung auf die Zellproliferation. Die Verbindungen stellen wichtige Strukturen dar, die bei der pharmakologischen Unterdrueckung der NO-Produktion in pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen koennten. Im zweiten Teil wurde in humanen DLD1-Zellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen, und A549/8-Zellen die Regulation der iNOS-Expression durch kleine G-Proteine der Rho-Familie, die bekanntermassen in den Signaltransduktionsweg von Cytokinen involviert sind, untersucht. Atorvastatin und Lovastatin (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer), die Ras- und Rho-Proteine gleichermassen indirekt hemmen, indem sie ihre essentielle Membranverankerung verhindern, erhoehten die Cytokin-induzierte NO-Produktion und iNOS-mRNA-Expression in den untersuchten humanen Zellen auf das 2 bis 4-fache, ohne jedoch selbst die Expression der iNOS induzieren zu koennen. DLD1- und AKN1-Zellen, die stabil mit einem 16kb-Fragment des humanen iNOS-Promotors vor einem Luziferase-Reportergen transfiziert worden waren, zeigten in Gegenwart von Atorvastatin oder Lovastatin eine mehr als 2,5-fache Steigerung der Cytokin-induzierten Luziferaseaktivitaet, was fuer eine erhoehte Transkriptionsrate als Ursache der erhoehten iNOS-mRNA-Spiegel spricht. In A549/8piNOS(16)Luc-Zellen erhoehten die beiden Statine die Luziferaseaktivitaet dagegen in einem weitaus geringerem Masse, so dass in diesen Zellen eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen, im Sinne einer erhoehten iNOS-mRNA-Stabilitaet, anzunehmen ist. Die beobachtete Statin-vermittelte Verstaerkung der Cytokin-induzierten iNOS-mRNA-Expression und iNOS-Promotoraktivitaet konnte durch Substitution von Mevalonat und Geranylgeranylpyrophosphat wieder vollstaendig aufgehoben werden, waehrend die Koinkubation mit FPP nur eine geringfuegige Reduktion zur Folge hatte. Die Superinduktion war somit das Ergebnis einer spezifischen Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und beruhte auf der Hemmung posttranslational geranylgeranylierter Proteine. Vor dem Hintergrund, dass die kleinen G-Proteine der Rho-Familie vorwiegend geranylgeranyliert und die der Ras-Familie hauptsaechlich farnesyliert werden, scheint die Cytokin-induzierte iNOS-Expression durch Rho-Proteine negativ reguliert zu werden. Diese Hypothese konnte dadurch verifiziert werden, dass auch Clostridium difficile Toxin B - das durch UDP-Glucosylierung saemtliche Rho-Proteine (Rho, Rac, Cdc42) direkt inaktiviert, Ras-Proteine jedoch unbeeinflusst laesst - die Cytokin-induzierte iNOS-mRNA-Expression in den humanen Zellen auf mehr als das Dreifache zu steigern vermochte.

Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst die genetische Kompetenz, das Lyseverhalten, die Virulenz und die Resistenz gegen Cefotaxim von S. pneumoniae. Der entscheidende Einfluss von CiaRH für S. pneumoniae zeigt sich auch darin, dass in mehreren Transkriptomstudien eine große Zahl von Genen identifiziert wurde, die in Abhängigkeit des Zwei-Komponenten Systems transkribiert werden. In dieser Arbeit konnten nun die Gene, deren Transkription direkt durch Bindung des Response Regulators CiaR in ihrem Promotorbereich reguliert wird, eindeutig definiert werden. Durch die Kombination von transkriptionellen Reportergenfusionen in dem neu konstruierten Promoter Probe Plasmid pPP2, Bandshiftassays und Mutageneseexperimenten wurde als Bindestelle von CiaR ein Direct Repeat mit der Sequenz TTTAAG-N5-TTTAAG identifiziert. Für 16 Promotoren mit dieser Bindestelle wurden eine Bindung von CiaR und eine CiaRH abhängige Expression nachgewiesen. Von den 16 Promotoren sind 15 positiv und nur einer negativ reguliert. Insgesamt besteht das CiaRH Regulon aus 30 Genen, wobei 19 Gene in 6 Operons organisiert sind. Zum CiaRH Regulon gehören ciaRH selbst, eine Vielzahl von Genen, die am Zellwandmetabolismus beteiligt sind (lic1 Operon, dlt Operon), die Gene von fünf kleinen nicht-kodierenden RNAs (ccnA-E), die Stressprotease HtrA, das Chromosomensegregationsprotein ParB, die Peptidyl-Prolyl Isomerase PpmA, die Maltoseverwertungsgene malMP, das Phosphotransferasesystem ManLMN und mehrere Gene mit unbekannter Funktion. Die eindeutige Identifizierung der Gene des Regulons des Zwei-Komponenten Systems CiaRH ermöglicht eine detaillierte Analyse der Zusammenhänge mit den cia-vermittelten Phänotypen. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde darauf eingegangen, welche Rolle die Histidinkinase CiaH spielt und woher das Phosphat für die Phosphorylierung des Response Regulators CiaR stammt. Es wurde durch Einbringen der Mutation D51A in CiaR gezeigt, dass das Aspartat an dieser Stelle des Proteins entscheidend für die Aktivität von CiaR als transkriptionellen Regulator ist. CiaH ist hingegen während des exponentiellen Wachstums in C-Medium für die Aktivität von CiaR verzichtbar. Die Promotoren des CiaRH Regulons zeigten in Abwesenheit der Kinase während dieser Wachstumsphase keine veränderte Aktivität. Die Phosphorylierung von CiaR muss daher auch über einen anderen Weg, beispielsweise über Acetylphosphat, erfolgen können. Deshalb wurde auch der Einfluss der Inaktivierung von spxB, dem Gen für eine Pyruvatoxidase, welche die Synthese eines Großteils des zellulären Acetylphosphats in S. pneumoniae katalysiert, untersucht. Eine entscheidende Rolle wurde für CiaH bei Eintritt in die stationäre Wachstumsphase beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass zu diesem Zeitpunkt nur bei vorhandenem CiaH ein Anstieg der Aktivität der Promotoren des CiaRH Regulons stattfindet. Dies deutet darauf hin, dass die Histidinkinase beim Übergang in die stationäre Phase ein Signal erhält, das die Aktivierung des CiaRH Regulons stimuliert. Möglicherweise können daraus Ansätze zur Identifizierung des bisher unbekannten Signals von CiaH entwickelt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die apoptoseinduzierende und wachstumshem-mende Potenz der Mistelextrakte Helixor Abietis (Tannenmistel), Mali (Apfelbaummistel) und Pini (Kiefernmistel) sowie der isolierten Mistellektine I und III auf die humane Leukämiezellli-nie MOLT-4 und isolierte Lymphozyten gesunder Probanden mittels 1- und 2-Parameter-Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Eine mögliche antimutagene und DNA-stabilisierende Wirkung der Frischpflanzenextrakte Helixor A, M und P auf kulti-vierte Lymphozyten gesunder Versuchspersonen wurde anhand des SCE- und Mikronuk-leus- Tests untersucht. Sowohl bei der durchflusszytometrischen und fluoreszenzmikroskopi-schen Auswertung als auch bei den Mutagenitätstests sollten außerdem eventuelle ge-schlechtsspezifische und wirtsbaumspezifische Wirkungen der drei unfermentierten Mis-telpräparate analysiert werden. Nach 72 h Inkubation der lymphatischen Leukämiezellen mit den Mistelextrakten Helixor A, M und P (2,5 150 microg/ml) bei unterschiedlichen FKS-Konzentrationen (15 2,5 %) konnte eine dosisabhängige Zunahme der apoptotischen Zellpopulation bei abnehmendem FKS-Gehalt festgestellt werden. Dabei zeigte das Präparat aus der Kiefernmistel die stärkste apopto-seinduzierende und wachstumshemmende Potenz, gefolgt von dem Präparat aus der Apfel-baummistel und dem Extrakt aus der Tannenmistel. Eine 72 h Kultivierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes gesunder weiblicher und männlicher Probanden mit den drei Helixor-Präparaten (50 200 microg/ml) resultierte ebenfalls in der Induktion des programmierten Zelltodes, wobei auch hier Helixor Pini das stärkste a-poptoseinduzierende Potential aufwies. Durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikrosko-pisch konnten keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede nachgewiesen wer-den. Die Bestimmung der Wachstumsrate mithilfe des Trypanblau-Ausschlusstests ergab je-doch eine signifikant niedrigere Wachstumsrate für Lymphozyten weiblicher Probanden bei Helixor Mali Konzentrationen von 100 und 200 microg/ml. Für die Leukämiezelllinie MOLT-4 konnte nach 72 h Inkubation mit den Mistellektinen I und III im Konzentrationsbereich von 0,05 20 ng/ml die Induktion des programmierten Zelltodes sowohl durchflusszytometrisch als auch fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden, wobei Mistellektin III die stärkere Wirkung zeigte. Nach 72 h Kultivierung isolierter Lymphozyten gesunder weiblicher und männlicher Proban-den mit den beiden isolierten Lektinen konnte ebenfalls ein signifikanter Anstieg der apopto-tischen Zellpopulation verzeichnet werden. Auch hier wies Mistellektin III die stärkere apop-toseinduzierende Potenz auf, signifikante geschlechtsspezifische Unterschiede traten nicht auf. Die Auswertung des SCE-Tests ergab nach 71 h Inkubation mit den Mistelpräparaten Helixor A, M und P (2,5 20 microg/ml) eine signifikante Abnahme der SCE-Rate bei Vollblutkulturen ge-sunder weiblicher und männlicher Probanden. Es traten jedoch keine wirtsbaumspezifischen oder geschlechtsspezifischen Unterschiede auf und auch die Zellzyklusverteilung und das Proliferationsverhalten veränderten sich unter Einwirkung der drei Extrakte nicht. Nach einer 71 h Kombinationsbehandlung der Helixor-Präparate mit den Zytostatika Cyc-lophosphamid (40 microg/ml), 5-Fluorouracil (5 microg/ml) bzw. Methotrexat (3 microg/ml) konnte eben-falls eine Abnahme der SCE-Rate, die durch die drei Zytostatika signifikant erhöht wurde, nachgewiesen werden. Die durch CP, 5 FU und MTH induzierten Veränderungen der Zell-zykluskinetik und des Proliferationsindexes konnten durch Helixor A, M und P jedoch nicht signifikant beeinflusst werden. Die Bestimmung der SCE-Rate ergab keine wirtsbaumspezifi-schen oder geschlechtsspezifischen Unterschiede. Nach Durchführung des Mikronukleus-Tests an Vollblutkulturen gesunder männlicher und weiblicher Blutspender konnte unter Einwirkung der Helixor-Extrakte Abietis, Mali und Pini (2,5 20 microg/ml) eine schwach signifikante Abnahme der MN-Rate festgestellt werden, wäh-rend der Mitose-Index unbeeinflusst blieb. Auch hier traten keine geschlechtsspezifischen o-der wirtsbaumspezifischen Unterschiede auf. Eine 71 h Kombinationsbehandlung der Lymphozyten mit den Frischpflanzenextrakten (2,5 20 microg/ml) und den Zytostatika CP (40 microg/ml), 5 FU (5 microg/ml) bzw. MTH (3 microg/ml) ergab eine signifikante bzw. hoch signifikante Abnahme der MN-Rate. Geschlechtsspezifische oder wirtsbaumspezifische Unterschiede wurden nicht gefunden. Der Mitose-Index wurde durch die Behandlung nicht wesentlich verändert.

Für alle Organismen ist es wichtig, sich gegen das Eindringen exogener DNA bzw. RNA wie z.B. Viren oder transposablen Elementen zur Wehr zu setzen um die Integrität ihres eigenen Genoms zu bewahren. Zudem müssen innerhalb eines Organismus oft ganze Genfamilien reguliert werden. Die RNA-Interferenz stellt ein optimales Mittel sowohl für die Abwehr exogener Nukleinsäuren, als auch für die Regulierung endogener Gene dazu bereit. Das Herzstück der RNAi stellen kleine regulatorische siRNAs dar, die Homologie-abhängig Reaktionen in einer Zelle hervorrufen können, wie z.B. das transkriptionelle oder das posttranskriptionelle Silencing. Bei dem Mechanismus der RNAi sind zudem mehrere Komponenten beteiligt um diese siRNAs zu synthetisieren, zu stabilisieren und zu ihrem Zielort zu bringen um dort das Silencing zu vermitteln. Dabei spielen die Enzyme Dicer und RNA abhängige RNA-Polymerasen eine wichtige Rolle in der Synthese. Argonauten, bzw. eine Unterklasse von ihnen, die Piwi-Proteine sind für das eigentliche Silencing des Zielgens wichtig und spielen, wie auch die 2´-O-Methyltransferase Hen1, eine Rolle in der Stabilisierung der siRNAs. In Paramecium tetraurelia weiß man, dass endogene Genfamilien, wie z.B. die Oberflächen-Antigene RNAi-vermittelt reguliert werden. Zudem ist bekannt, dass man RNAi-Mechanismen, die diesem endogenen Mechanismus ähneln, artifiziell durch das Einbringen einer doppelsträngigen RNA induzieren kann. Dies kann entweder durch das Verfüttern von Bakterien geschehen, die zur Synthese einer dsRNA in ihrem Inneren veranlasst werden und diese anreichern, oder durch die Injektion eines Transgens in den Makronukleus, dessen Transkript ebenfalls zu einer dsRNA umgesetzt wird. Der Fokus dieser Arbeit lag auf dem exogenen, durch ein injiziertes Transgen induzierten RNAi-Mechanismus in Paramecium tetraurelia und dessen genauere Charakterisierung. Dabei konnte gezeigt werden, dass dieser RNAi-Mechanismus eine Temperaturabhängigkeit aufweist, wie es auch für RNAi-Mechanismen in anderen Organismen beschrieben wurde. Im Rahmen dieser Arbeit konnte jedoch die Ursache diese Temperaturabhängigkeit nicht aufgeklärt werden. Dafür konnte gezeigt werden, dass zwei Klassen an siRNAs an diesem Mechanismus beteiligt sind. Es konnten neben den schon in der Literatur beschriebenen primären siRNAs auch sekundäre siRNAs nachgewiesen werden, deren Synthese von einer RdRP abhängig ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Schluss gezogen werden, das diese RdRP, die für die Synthese der sekundären siRNAs verantwortlich ist, das Homolog Rdr2 ist. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese sekundären siRNAs Transitivität induzieren. Dies beschreibt die Amplifikation der siRNAs über das Ausgangsmolekül hinaus. Es konnte dargestellt werden, dass die sekundären siRNAs nicht von dem ursprünglichen Transgen synthetisiert, sondern vielmehr von einem homologen endogenen Transkript, einer mRNA, entstammen und somit als transitiv angesehen werden können. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Nukleotidyltransferase Cid2 ebenfalls in die Akkumulation dieser sekundären siRNAs involviert ist. Es konnte der Schluss gezogen werden, dass dieses Cid2 in einem Komplex mit Rdr2 vorliegt und das Template zur Generierung der sekundären siRNAs stabilisiert und so für Rdr2 zugänglich macht. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die detailliertere Untersuchung der spezifischen Stabilisierung beider siRNA-Klassen. Dabei konnte gezeigt werden, dass mehrere Piwi-Proteine in den Transgen-induzierten Mechanismus involviert sind. Die Paramecium spezifischen Piwis Ptiwi 8, Ptiwi 13 und Ptiwi 14 spielen dabei eine Rolle. Im Rahmen der durchgeführten Analysen konnte gezeigt werden, dass die Ptiwis 8 und 14 in die Akkumulation und damit in die Stabilisierung beider siRNA-Klassen involviert sind. Allerdings scheint dieser Effekt eher auf dem Ptiwi14 zu beruhen. Für das Ptiwi 13 konnte vermutet werden, dass dieses eher in die Akkumulation und spezifischen Stabilisierung der sekundären siRNAs involviert ist. Auch konnte aufgezeigt werden, dass beide Klassen an Transgen-induzierten siRNAs eine Methylgruppe an ihrem 3´ Ende tragen, welche von der 2´-O-Methyltransferase Hen1 abhängig ist und ebenfalls der Stabilisierung der siRNAs dient. Zudem konnte vermutet werden, dass diese Methylierung bereits vor dem Binden der siRNAs an eines der Ptiwis stattfindet und davon unabhängig ist. Somit konnten Rückschlüsse auf den zeitlichen Verlauf des Transgen-induzierten RNAi-Mechanismus gezogen werden. Über eine Lokalisation dieses Hen1-Proteins konnte ferner gezeigt werden, dass dieses Protein in bzw. an den mit der Keimbahn assoziierten Mikronuklei und dem vegetativen Makronukleus aufzufinden ist. Die Methylierung der siRNAs findet somit in den Kernen statt. Dies lässt den Schluss zu, dass der Transgen-induzierte RNAi-Mechanismus neben der posttranskriptionellen Regulation auch eine transkriptionelle Genregulation direkt am Chromatin vermitteln kann.

Die Homöostase der intrazellulären Ca2+-Konzentration ist eine essenzielle Aufgabe in allen Zellen, da Ca2+ an diversen zellulären Prozessen beteiligt ist. Besonders Neurone des auditorischen Hirnstamms sind auf eine optimale Ca2+-Regulation angewiesen, da ihr Überleben und ihre Entwicklung von der intrazellulären Ca2+-Konzentration abhängen. Neben Ca2+-bindenden Proteinen und Ca2+-ATPasen sind besonders Na+/Ca2+-Austauscher, welche sich in die Familien NCX (NCX1-3), NCKX (NCKX1-5) und CCX (NCKX6) gliedern, in vielen neuronalen und nicht-neuronalen Strukturen maßgeblich für die Ca2+-Regulation verantwortlich. In meiner Arbeit wurde die Verteilung von NCX1-3 sowie NCKX2-6 im Nucleus cochlearis(CN), superioren Olivenkomplex (SOC) und inferioren Colliculus (IC), welche Strukturen des auditorischen Hirnstamms darstellen, untersucht. Dies erfolgte auf Boten-Ribonukleinsäure(messenger ribonucleic acid, mRNA)-Ebene qualitativ mittels reverser Transkription (RT)gefolgt von genspezifischer Polymerasekettenreaktion (PCR) sowie quantitativ mittels realtime-PCR, auf Proteinebene qualitativ mittels Immunhistochemie. Um auch ontogenetische Aspekte der Ca2+-Homöostase zu berücksichtigen, wurden Ratten in einem unreifen Entwicklungsstadium (P4) sowie junge adulte Ratten (P60) analysiert. Die Genexpression aller untersuchten ncx- und nckx-Isoformen wurde mittels RT-PCR in beiden Entwicklungsstadien in CN, SOC und IC nachgewiesen. Besonders auffallend war bei den ncx-Isoformen eine im Verlauf der Entwicklung meist verstärkte Transkription, während die nckx-Isoformen in den meisten Fällen eine verminderte Transkription im adulten Tier zeigten. Mittels Immunhistochemie zeigt meine Arbeit zum ersten Mal eine entwicklungsabhängige Umverteilung der Austauscher. Während die Isoformen bei P4 hauptsächlich im Neuropil lokalisiert waren, zeigte sich im Gegensatz dazu bei P60 eine verstärkte Immunfluoreszenz innerhalb der Somata. Ausnahme war hier NCKX2, welcher im CN auch bei P60 hauptsächlich im Neuropil exprimiert wurde. Die Expression von NCX1-3 und NCKX2 im Neuropil junger auditorischer Hirnstammneurone legt eine Ca2+-regulierende Funktion im Bereich dendritischer Synapsen nahe. Die Synapsen befinden sich in diesem Alter noch in einem unreifen Zustand, so dass die Na+/Ca2+-Austauscher einen maßgeblichen Einfluss auf die synaptische Plastizität ausüben können. Abschließend deutet die Verteilung der Na+/Ca2+-Austauscher darauf hin, dass alle NCX- und NCKX-Isoformen, im Zusammenspiel mit weiteren Ca2+-regulierenden Proteinen, an der Ca2+-Homöostase in den Strukturen des auditorischen Hirnstamms beteiligt sind.

Die hier vorgelegte Arbeit konzentrierte sich auf den vakuolären Ribonukleinsäure- (RNA) Abbau in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) und die Integration in den Nukleotid- Metabolismus unter Berücksichtigung von Nukleosidtransportprozessen. Insbesondere die physiologische Bedeutung des Verlustes der RNS2-Aktivität auf die vakuolären RNA-Abbauprozesse sollte untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass RNS2 den größten Anteil an der vakuolären Ribonuklease- (RNase-) Aktivität ausmacht, wobei die Restaktivität von circa 30 Prozent ein Hinweis auf mindestens eine weitere vakuoläre RNase ist. Die vakuolären Adenylatgehalte, Abbauprodukte der RNA, in RNS2-T-DNA-Insertionslinien zeigten, dass RNS2, ähnlich wie die intrazellulären RNasen in L. esculentum, 2‘,3‘-zyklische Nukleotidmonophosphate (2‘,3‘-cNMPs) produzieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass in diesen Linien die vakuolären Enzyme sowohl RNA, als auch 2‘,3‘-cNMPs langsamer abbauen als vakuoläre Enzyme aus Wildtyp-Pflanzen. Die Akkumulation dieses zyklischen Intermediates des RNA-Abbaus lässt darauf schließen, dass die Transphosphorylierung schneller verläuft als die Hydrolyse (Abel & Glund, 1987; Löffler et al., 1992; Nürnberger et al., 1990). Es kann angenommen werden, dass ein weiteres Enzym, wie etwa eine zyklische Phosphodiesterase oder eine weitere Ribonuklease, an der Hydrolyse beteiligt ist. Ein weiterer Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der wichtigen Frage der Qualität von Vakuolenisolationen. Protoplastenkontaminationen konnten mikroskopisch ausgeschlossen werden. Die chloroplastidäre Verunreinigung war mit circa 5 Prozent gering, die cytosolische Kontamination lag jedoch je nach Isolationsmethode bei bis zu 30 Prozent im Vergleich zu Protoplasten. Es konnte darüber hinaus erstmals durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden, dass Vakuolen RNA besitzen. Diese Oligonukleotide sind vornehmlich kleine Fragmente im Größenbereich bis 50 nt. Next Generation Sequencing ermöglichte eine detaillierte Analyse von cDNA- Bibliotheken, gewonnen aus vakuolärer RNA. Diese Technik wurde unter anderem angewandt, um die Reliabilität des Experimentes zu untersuchen. Es zeigte sich eine große Varianz in der Verteilung der Counts auf die verschiedenen RNA-Loci innerhalb biologischer Replikate und unterschiedlicher Vakuolenisolationsmethoden. Erstmals konnte jedoch gezeigt werden, dass circa 70 Prozent der RNA-Fragmente in der Vakuole von mRNA stammen. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass der Abbau der wenigen rRNA-Transkripte in diesem Organell verstärkt abläuft. In A. thaliana existiert mit ENT7 lediglich ein Vertreter, der einen Export von RNA- Abbauprodukten aus der Zelle ermöglicht. Da er den namensgebenden Vertretern aus dem Reich der Säugetiere strukturell und funktionell ähnelt, ist ENT7 ein geeignetes ENT-Protein für zukünftige Kristallisations- und Strukturanalysen. In dieser Arbeit konnte ENT7-eGFP in Pichia pastoris mit großer Ausbeute (2 mg Protein pro Liter Hefekultur) synthetisiert und in stabiler Form gereinigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ENT7 ohne eGFP ebenfalls stabil und als Dimer vorliegt. Durch Bindungsstudien erfolgte der Nachweis der erfolgreichen Bindung an bekannte Substrate. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass neben Nukleosiden auch Nukleobasen, aber nicht ATP gebunden werden.