Potassium (K) is essential for the processes critical for plant performance, including photosynthesis, carbon assimilation, and response to stress. K also influences translocation of sugars in the phloem and regulates sucrose metabolism. Several plant species synthesize polyols and transport these sugar alcohols from source to sink tissues. Limited knowledge exists about the involvement of K in the above processes in polyol-translocating plants. We, therefore, studied K effects in Plantago major, a species that accumulates the polyol sorbitol to high concentrations. We grew P. major plants on soil substrate adjusted to low-, medium-, or high-potassium conditions. We found that biomass, seed yield, and leaf tissue K contents increased in a soil K-dependent manner. K gradually increased the photosynthetic efficiency and decreased the non-photochemical quenching. Concomitantly, sorbitol levels and sorbitol to sucrose ratio in leaves and phloem sap increased in a K-dependent manner. K supply also fostered plant cold acclimation. High soil K levels mitigated loss of water from leaves in the cold and supported cold-dependent sugar and sorbitol accumulation. We hypothesize that with increased K nutrition, P. major preferentially channels photosynthesis-derived electrons into sorbitol biosynthesis and that this increased sorbitol is supportive for sink development and as a protective solute, during abiotic stress

Correct bioriented attachment of sister chromatids to the mitotic spindle is essential for chromosome segregation. In budding yeast, the conserved protein shugoshin (Sgo1) contributes to biorientation by recruiting the protein phosphatase PP2A-Rts1 and the condensin complex to centromeres. Using peptide prints, we identified a Serine-Rich Motif (SRM) of Sgo1 that mediates the interaction with condensin and is essential for centromeric condensin recruitment and the establishment of biorientation. We show that the interaction is regulated via phosphorylation within the SRM and we determined the phospho-sites using mass spectrometry. Analysis of the phosphomimic and phosphoresistant mutants revealed that SRM phosphorylation disrupts the shugoshin–condensin interaction. We present evidence that Mps1, a central kinase in the spindle assembly checkpoint, directly phosphorylates Sgo1 within the SRM to regulate the interaction with condensin and thereby condensin localization to centromeres. Our findings identify novel mechanisms that control shugoshin activity at the centromere in budding yeast.

The plasma membrane transporter SOS1 (SALT-OVERLY SENSITIVE1) is vital for plant survival under salt stress. SOS1 activity is tightly regulated, but little is known about the underlying mechanism. SOS1 contains a cytosolic, autoinhibitory C-terminal tail (abbreviated as SOS1 C-term), which is targeted by the protein kinase SOS2 to trigger its transport activity. Here, to identify additional binding proteins that regulate SOS1 activity, we synthesized the SOS1 C-term domain and used it as bait to probe Arabidopsis thaliana cell extracts. Several 14-3-3 proteins, which function in plant salt tolerance, specifically bound to and interacted with the SOS1 C-term. Compared to wild-type plants, when exposed to salt stress, Arabidopsis plants overexpressing SOS1 C-term showed improved salt tolerance, significantly reduced Na+ accumulation in leaves, reduced induction of the salt-responsive gene WRKY25, decreased soluble sugar, starch, and proline levels, less impaired inflorescence formation and increased biomass. It appears that overexpressing SOS1 C-term leads to the sequestration of inhibitory 14-3-3 proteins, allowing SOS1 to be more readily activated and leading to increased salt tolerance. We propose that the SOS1 C-term binds to previously unknown proteins such as 14-3-3 isoforms, thereby regulating salt tolerance. This finding uncovers another regulatory layer of the plant salt tolerance program

Most of the mitochondrial proteins in yeast are encoded in the nuclear genome, get synthesized by cytosolic ribosomes and are imported via TOM and TIM23 into the matrix or other subcompartments of mitochondria. The mitochondrial DNA in yeast however also encodes a small set of 8 proteins from which most are hydrophobic membrane proteins and build core components of the OXPHOS complexes. They get synthesized by mitochondrial ribosomes which are descendants of bacterial ribosomes and still have some similarities to them. On the other hand, mitochondrial ribosomes experienced various structural and functional changes during evolution that specialized them for the synthesis of the mitochondrial encoded membrane proteins. The mitoribosome contains mitochondria-specific ribosomal proteins and replaced the bacterial 5S rRNA by mitochondria-specific proteins and rRNA extensions. Furthermore, the mitoribosome is tethered to the inner mitochondrial membrane to facilitate a co-translational insertion of newly synthesized proteins. Thus, also the assembly process of mitoribosomes differs from that of bacteria and is to date not well understood. Therefore, the biogenesis of mitochondrial ribosomes in yeast should be investigated. To this end, a strain was generated in which the gene of the mitochondrial RNA-polymerase RPO41 is under control of an inducible GAL10-promoter. Since the scaffold of ribosomes is built by ribosomal RNAs, the depletion of the RNA-polymerase subsequently leads to a loss of mitochondrial ribosomes. Reinduction of Rpo41 initiates the assembly of new mitoribosomes, which makes this strain an attractive model to study mitoribosome biogenesis. Initially, the effects of Rpo41 depletion on cellular and mitochondrial physiology was investigated. Upon Rpo41 depletion, growth on respiratory glycerol medium was inhibited. Furthermore, mitochondrial ribosomal 21S and 15S rRNA was diminished and mitochondrial translation was almost completely absent. Also, mitochondrial DNA was strongly reduced due to the fact that mtDNA replication requires RNA primers that get synthesized by Rpo41. Next, the effect of reinduction of Rpo41 on mitochondria was tested. Time course experiments showed that mitochondrial translation can partially recover from 48h Rpo41 depletion within a timeframe of 4.5h. Sucrose gradient sedimentation experiments further showed that the mitoribosomal constitution was comparable to wildtype control samples during the time course of 4.5h of reinduction, suggesting that the ribosome assembly is not fundamentally altered in Gal-Rpo41 mitochondria. In addition, the depletion time was found to be critical for recovery of mitochondrial translation and mitochondrial RNA levels. It was observed that after 36h of Rpo41 depletion, the rRNA levels and mitochondrial translation recovered to almost 100%, but only within a time course of 10h. Finally, mitochondria from Gal-Rpo41 cells isolated after different timepoints of reinduction were used to perform complexome profiling and the assembly of mitochondrial protein complexes was investigated. First, the steady state conditions and the assembly process of mitochondrial respiratory chain complexes were monitored. The individual respiratory chain complexes and the super-complexes of complex III, complex IV and complex V were observed. Furthermore, it was seen that they recovered from Rpo41 depletion within 4.5h of reinduction. Complexome profiles of the mitoribosomal small and large subunit discovered subcomplexes of mitoribosomal proteins that were assumed to form prior to their incorporation into assembly intermediates. The complexome profiles after reinduction indeed showed the formation of these subcomplexes before formation of the fully assembled subunit. In the mitochondrial LSU one subcomplex builds the membrane facing protuberance and a second subcomplex forms the central protuberance. In contrast to the preassembled subcomplexes, proteins that were involved in early assembly steps were exclusively found in the fully assembled subunit. Proteins that assemble at the periphery of the mitoribosome during intermediate and late assembly steps where found in soluble form suggesting a pool of unassembled proteins that supply assembly intermediates with proteins. Taken together, the findings of this thesis suggest a so far unknow building-block model for mitoribosome assembly in which characteristic structures of the yeast mitochondrial ribosome form preassembled subcomplexes prior to their incorporation into the mitoribosome.

Since plants lack specialized immune cells, each cell has to defend itself independently against a plethora of different pathogens. Therefore, successful plant defense strongly relies on precise and efficient regulation of intracellular processes in every single cell. Smooth trafficking within the plant endomembrane is a prerequisite for a diverse set of immune responses. Pathogen recognition, signaling into the nucleus, cell wall enforcement, secretion of antimicrobial proteins and compounds, as well as generation of reactive oxygen species, all heavily depend on vesicle transport. In contrast, pathogens have developed a variety of different means to manipulate vesicle trafficking to prevent detection or to inhibit specific plant responses. Intriguingly, the plant endomembrane system exhibits remarkable plasticity upon pathogen attack. Unconventional trafficking pathways such as the formation of endoplasmic reticulum (ER) bodies or fusion of the vacuole with the plasma membrane are initiated and enforced as the counteraction. Here, we review the recent findings on unconventional and defense-induced trafficking pathways as the plant´s measures in response to pathogen attack. In addition, we describe the endomembrane system manipulations by different pathogens, with a focus on tethering and fusion events during vesicle trafficking.

Biological soil crusts (biocrusts) have been recognized as key ecological players in arid and semiarid regions at both local and global scales. They are important biodiversity components, provide critical ecosystem services, and strongly influence soil-plant relationships, and successional trajectories via facilitative, competitive, and edaphic engineering effects. Despite these important ecological roles, very little is known about biocrusts in seasonally dry tropical forests. Here we present a first baseline study on biocrust cover and ecosystem service provision in a human-modified landscape of the Brazilian Caatinga, South America's largest tropical dry forest. More specifically, we explored (1) across a network of 34 0.1 ha permanent plots the impact of disturbance, soil, precipitation, and vegetation-related parameters on biocrust cover in different stages of forest regeneration, and (2) the effect of disturbance on species composition, growth and soil organic carbon sequestration comparing early and late successional communities in two case study sites at opposite ends of the disturbance gradient. Our findings revealed that biocrusts are a conspicuous component of the Caatinga ecosystem with at least 50 different taxa of cyanobacteria, algae, lichens and bryophytes (cyanobacteria and bryophytes dominating) covering nearly 10% of the total land surface and doubling soil organic carbon content relative to bare topsoil. High litter cover, high disturbance by goats, and low soil compaction were the leading drivers for reduced biocrust cover, while precipitation was not associated Second-growth forests supported anequally spaced biocrust cover, while in old-growth-forests biocrust cover was patchy. Disturbance reduced biocrust growth by two thirds and carbon sequestration by half. In synthesis, biocrusts increase soil organic carbon (SOC) in dry forests and as they double the SOC content in disturbed areas, may be capable of counterbalancing disturbance-induced soil degradation in this ecosystem. As they fix and fertilize depauperated soils, they may play a substantial role in vegetation regeneration in the human-modified Caatinga, and may have an extended ecological role due to the ever-increasing human encroachment on natural landscapes. Even though biocrusts benefit from human presence in dry forests, high levels of anthropogenic disturbance could threaten biocrust-provided ecosystem services, and call for further, in-depth studies to elucidate the underlying mechanisms.

More than ten years ago, ER-ANT1 was shown to act as an ATP/ADP antiporter and to exist in the endoplasmic reticulum (ER) of higher plants. Because structurally different transporters generally mediate energy provision to the ER, the physiological function of ER-ANT1 was not directly evident. Interestingly, mutant plants lacking ER-ANT1 exhibit a photorespiratory phenotype. Although many research efforts were undertaken, the possible connection between the transporter and photorespiration also remained elusive. Here, a forward genetic approach was used to decipher the role of ER-ANT1 in the plant context and its association to photorespiration. This strategy identified that additional absence of a putative HAD-type phosphatase partially restored the photorespiratory phenotype. Localisation studies revealed that the corresponding protein is targeted to the chloroplast. Moreover, biochemical analyses demonstrate that the HAD-type phosphatase is specific for pyridoxal phosphate. These observations, together with transcriptional and metabolic data of corresponding single (ER-ANT1) and double (ER-ANT1, phosphatase) loss-of-function mutant plants revealed an unexpected connection of ER-ANT1 to vitamin B6 metabolism. Finally, a scenario is proposed, which explains how ER-ANT1 may influence B6 vitamer phosphorylation, by this affects photorespiration and causes several other physiological alterations observed in the corresponding loss-of-function mutant plants.

Regulation of metabolism is complex and involves enzymes and membrane transporters, which form networks to support energy dynamics. Lactate, as a metabolic intermediate from glucose or glycogen breakdown, appears to play a major role as additional energetic substrate, which is shuttled between glycolytic and oxidative cells, both under hypoxic and normoxic conditions. Transport of lactate across the cell membrane is mediated by monocarboxylate transporters (MCTs) in cotransport with H+, which is a substrate, a signal and a modulator of metabolic processes. MCTs form a “transport metabolon” with carbonic anhydrases (CAs), which not only provide a rapid equilibrium between CO2, HCO3– and H+, but, in addition, enhances lactate transport, as found in Xenopus oocytes, employed as heterologous expression system, as well as in astrocytes and cancer cells. Functional interactions between different CA isoforms and MCTs have been found to be isoform-specific, independent of the enzyme’s catalytic activity, and they require physical interaction between the proteins. CAs mediate between different states of metabolic acidosis, induced by glycolysis and oxidative phosphorylation, and play a relay function in coupling pH regulation and metabolism. In the brain, metabolic processes in astrocytes appear to be linked to bicarbonate transport and to neuronal activity. Here, we focus on physiological processes of energy dynamics in astrocytes as well as on the transfer of energetic substrates to neurons.

Cryptophyten verwenden neben Chlorophyll zusätzliche Lichtsammelproteine für die Photo-synthese – die Phycobiliproteine (PBP). In Cyanobakterien, Rotalgen und Glaukophyten sind PBP ebenfalls ubiquitär verbreitet. Für den Zweck der Lichtsammlung tragen die PBP- Untereinheiten kovalent gebundene offenkettige Tetrapyrrol-Chromophore an konservierten Cysteinresten. Diese Phycobiline sind in der Lage, grünes Licht zu absorbieren und es für die Photosynthese zur Verfügung zu stellen. Die Fähigkeit zur Photosynthese erlangten Crypto-phyten bei der sekundären Endosymbiose durch Aufnahme einer früheren Rotalge. Die evolutionäre Entwicklung brachte schließlich modifizierte PBP hervor. In Gegensatz zu ande-ren Organismen liegen die PBP in Cryptophyten in löslicher Form im Thylakoidlumen des Plastiden vor. Cryptophyten besitzen lediglich einen Typ an PBP, Guillardia theta verwendet Phycoerythrin PE545. Die α-Untereinheiten sind jeweils mit einem Molekül 15,16-Dihydrobi-liverdin (DHBV) und die β-Untereinheiten mit drei Molekülen Phycoerythrobilin (PEB) chromophoryliert. Die Chromophorylierung cryptophytischer Apo-PBP ist bisher wenig un-tersucht und verstanden. Aus Cyanobakterien ist jedoch bekannt, dass die Chromophorylie-rung häufig mit Hilfe von Phycobiliproteinlyasen (PBP Lyasen) stattfindet, welche die Phyco-bilinübertragung unterstützen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der eukaryotischen S-Typ-PBP Lyase GtCPES aus G. theta. Mittels Fluoreszenzspektroskopie und Zink-induzierter Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass GtCPES den Transfer von 3(Z)-PEB auf Cys82 der PBP-β-Untereinheit aus Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB) vermittelt. An der PEB-Bindung sowie am -Transfer beteiligte Aminosäuren wurden mit Hilfe Zielgerichteter Muta-genese identifiziert. Anhand spektroskopischer Binde- und Transferstudien mit den Protein-varianten wurden drei Aminosäuren in der Ligandenbindetasche ermittelt, die relevant für die Bindung sind (Trp69, Glu136, Glu168). Diese koordinieren vermutlich PEB in der Bindetasche und stabilisieren somit die Konformation. Zusätzlich konnten zwei im PEB-Transfer involvierte Aminosäuren eindeutig identifiziert werden (Trp75, Ser150). Trp75 kommt dabei eine essenzielle Bedeutung für den Transfer zu. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Met67 für die auf PEB und DHBV beschränkte Substratspezifität von GtCPES verantwortlich ist. Die Variante GtCPES_M67A bindet sowohl PEB als auch das rigide Phycocyanobilin (PCB) stabil unter Bildung eines farbigen Komplexes in vitro und in vivo in Escherichia coli. GtCPES_M67A scheint zudem in der Lage zu sein, PCB auf geeignete Apo-Proteine zu transfe-rieren. Neben der sterischen und elektrostatischen Umgebung entscheidet damit zusätzlich die Substratspezifität der PBP Lyase über die gebundenen Chromophore am PBP.

Anisotropy of tracer-coupled networks is a hallmark in many brain regions. In the past, the topography of these networks was analyzed using various approaches, which focused on different aspects, e.g., position, tracer signal, or direction of coupled cells. Here, we developed a vector-based method to analyze the extent and preferential direction of tracer spreading. As a model region, we chose the lateral superior olive—a nucleus that exhibits specialized network topography. In acute slices, sulforhodamine 101-positive astrocytes were patch-clamped and dialyzed with the GJ-permeable tracer neurobiotin, which was subsequently labeled with avidin alexa fluor 488. A predetermined threshold was used to differentiate between tracer-coupled and tracer-uncoupled cells. Tracer extent was calculated from the vector means of tracer-coupled cells in four 90° sectors. We then computed the preferential direction using a rotating coordinate system and post hoc fitting of these results with a sinusoidal function. The new method allows for an objective analysis of tracer spreading that provides information about shape and orientation of GJ networks. We expect this approach to become a vital tool for the analysis of coupling anisotropy in many brain regions

We isolated an encysted ciliate from a geothermal field in Iceland. The morphological features of this isolate fit the descriptions of Dexiotricha colpidiopsis (Kahl, 1926) Jankowski, 1964 very well. These comprise body shape and size in vivo, the number of somatic kineties, and the positions of macronucleus and contractile vacuole. Using state-of-the-art taxonomic methods, the species is redescribed, including phylogenetic analyses of the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene as molecular marker. In the phylogenetic analyses, D. colpidiopsis clusters with the three available SSU rRNA gene sequences of congeners, suggesting a monophyly of the genus Dexiotricha. Its closest relative in phylogenetic analyses is D. elliptica, which also shows a high morphological similarity. This is the first record of a Dexiotricha species from a hot spring, indicating a wide temperature tolerance of this species at least in the encysted state. The new findings on D. colpidiopsis are included in a briefly revision of the scuticociliate genus Dexiotricha and an identification key to the species. Słowa kluczowe: Dexiotricha, hot spring, morphology, phylogeny, SSU rRNA gene

NbdA und MucR sind Multi-Domänenproteine aus Pseudomonas aeruginosa. Beide Proteine besitzen eine ähnliche Domänenorganisation mit einer N-terminalen, membranständigen MHYT-Domäne sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne im Cytoplasma. Die cytosolischen Domänen von MucR sind beide aktiv, während NbdA neben der intakten EAL-Domäne eine degenerierte GGDEF-Domäne mit dem Motiv AGDEF aufweist. Bioinformatischen Vorhersagen zufolge soll die MHYT-Domäne eine sensorische Funktion für diatomische Gase wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoff vermitteln. Die phänotypische Charakterisierung der markerlosen PAO1-Deletionsmutanten \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR und \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR zeigte, dass NbdA und MucR nicht in die NO-induzierte Dispersion involviert sind. Ebenso konnte in einem neu etablierten heterologen in-vivo-System in E. coli keine NO-sensorische Funktion der Proteine detektiert werden. Im Weiteren wurde festgestellt, dass die MHYT-Domäne keinen ersichtlichen Einfluss auf die Enzymaktivität von NbdA und MucR unter aeroben Bedingungen hat. Demzufolge fungiert die Membrandomäne vermutlich weder als Sensor für Sauerstoff, noch für NO. Anhand heterologer Komplementationstests konnte eine PDE-Aktivität des NbdA-Volllängenproteins nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die degenerierte AGDEF-Domäne einen regulatorischen Effekt auf die EAL-Domäne hat, der essentiell für die in- vivo-Aktivität von NbdA ist. In-vivo-Untersuchungen bestätigten die postulierte DGC-Aktivität von MucR. Weiterhin konnte belegt werden, dass MucR ein bifunktionelles Enzym ist. Entgegen den Erwartungen scheint es jedoch im Planktonischen als DGC und im Biofilm als PDE zu fungieren. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der homologen Überexpression von nbdA in P. aeruginosa, welche teilweise unerwartete Phänotypen ergab. Anhand der homologen Überproduktion einer inaktiven NbdA-Variante stellte sich heraus, dass die Hemmung der Motilität unabhängig von der Aktivität von NbdA auftritt. Massenspektrometrische Analysen deuteten daraufhin, dass NbdA lokal c-di-GMP hydrolysiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass NbdA eine Trigger-PDE ist, deren primäre Funktion die Regulation anderer makromolekularer Zielmoleküle ist. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ist bekannt, dass das NbdA-Homolog Pfl01_1252 mit den Homologen von MucR (Pfl01_2525) und SadC (Pfl01_4451) interagiert. Ergebnisse einer früheren Arbeit lassen eine Interaktion von NbdA und SadC ebenso in P. aeruginosa vermuten. Daher ist denkbar, dass sich NbdA im gleichen Netzwerk wie MucR und SadC befindet und deren Aktivität reguliert.

MsmS is a heme-based redox sensor kinase in Methanosarcina acetivorans consisting of alternating PAS and GAF domains connected to a C-terminal kinase domain. In addition to MsmS, M. acetivorans possesses a second kinase, MA0863 with high sequence similarity. Interestingly, MA0863 possesses an amber codon in its second GAF domain, encoding for the amino acid pyrrolysine. Thus far, no function of this residue has been resolved. In order to examine the heme iron coordination in both proteins, an improved method for the production of heme proteins was established using the Escherichia coli strain Nissle 1917. This method enables the complete reconstitution of a recombinant hemoprotein during protein production, thereby resulting in a native heme coordination. Analysis of the full-length MsmS and MA0863 confirmed a covalently bound heme cofactor, which is connected to one conserved cysteine residue in each protein. In order to identify the coordinating amino acid residues of the heme iron, UV/vis spectra of different variants were measured. These studies revealed His702 in MsmS and the corresponding His666 in MA0863 as the proximal heme ligands. MsmS has previously been described as a heme-based redox sensor. In order to examine whether the same is true for MA0863, redox dependent kinase assays were performed. MA0863 indeed displays redox dependent autophosphorylation activity, which is independent of heme ligands and only observed under oxidizing conditions. Interestingly, autophosphorylation was shown to be independent of the heme cofactor but rather relies on thiol oxidation. Therefore, MA0863 was renamed in RdmS (redox dependent methyltransferase-associated sensor). In order to identify the phosphorylation site of RdmS, thin layer chromatography was performed identifying a tyrosine as the putative phosphorylation site. This observation is in agreement with the lack of a so-called H-box in typical histidine kinases. Due to their genomic localization, MsmS and RdmS were postulated to form two-component systems (TCS) with vicinal encoded regulator proteins MsrG and MsrF. Therefore, protein-protein interaction studies using the bacterial adenylate two hybrid system were performed suggesting an interaction of RdmS and MsmS with the three regulators MsrG/F/C. Due to these multiple interactions these signal transduction pathways should rather be considered multicomponent system instead of two component systems.

For modeling approaches in systems biology, knowledge of the absolute abundances of cellular proteins is essential. One way to gain this knowledge is the use of quantification concatamers (QconCATs), which are synthetic proteins consisting of proteotypic peptides derived from the target proteins to be quantified. The QconCAT protein is labeled with a heavy isotope upon expression in E. coli and known amounts of the purified protein are spiked into a whole cell protein extract. Upon tryptic digestion, labeled and unlabeled peptides are released from the QconCAT and the native proteins, respectively, and both are quantified by LC-MS/MS. The labeled Q-peptides then serve as standards for determining the absolute quantity of the native peptides/proteins. Here we have applied the QconCAT approach to Chlamydomonas reinhardtii for the absolute quantification of the major proteins and protein complexes driving photosynthetic light reactions in the thylakoid membranes and carbon fixation in the pyrenoid. We found that with 25.2 attomol/cell the Rubisco large subunit makes up 6.6% of all proteins in a Chlamydomonas cell and with this exceeds the amount of the small subunit by a factor of 1.56. EPYC1, which links Rubisco to form the pyrenoid, is eight times less abundant than RBCS, and Rubisco activase is 32-times less abundant than RBCS. With 5.2 attomol/cell, photosystem II is the most abundant complex involved in the photosynthetic light reactions, followed by plastocyanin, photosystem I and the cytochrome b6/f complex, which range between 2.9 and 3.5 attomol/cell. The least abundant complex is the ATP synthase with 2 attomol/cell. While applying the QconCAT approach, we have been able to identify many potential pitfalls associated with this technique. We analyze and discuss these pitfalls in detail and provide an optimized workflow for future applications of this technique.

Neuronal inhibition is mediated by glycine and/or GABA. Inferior colliculus (IC) neurons receive glycinergic and GABAergic inputs, whereas inhibition in hippocampus (HC) predominantly relies on GABA. Astrocytes heterogeneously express neurotransmitter transporters and are expected to adapt to the local requirements regarding neurotransmitter homeostasis. Here we analyzed the expression of inhibitory neurotransmitter transporters in IC and HC astrocytes using whole-cell patch-clamp and single-cell reverse transcription-PCR. We show that most astrocytes in both regions expressed functional glycine transporters (GlyTs). Activation of these transporters resulted in an inward current (IGly) that was sensitive to the competitive GlyT1 agonist sarcosine. Astrocytes exhibited transcripts for GlyT1 but not for GlyT2. Glycine did not alter the membrane resistance (RM) arguing for the absence of functional glycine receptors (GlyRs). Thus, IGly was mainly mediated by GlyT1. Similarly, we found expression of functional GABA transporters (GATs) in all IC astrocytes and about half of the HC astrocytes. These transporters mediated an inward current (IGABA) that was sensitive to the competitive GAT-1 and GAT-3 antagonists NO711 and SNAP5114, respectively. Accordingly, transcripts for GAT-1 and GAT-3 were found but not for GAT-2 and BGT-1. Only in hippocampal astrocytes, GABA transiently reduced RM demonstrating the presence of GABAA receptors (GABAARs). However, IGABA was mainly not contaminated by GABAAR-mediated currents as RM changes vanished shortly after GABA application. In both regions, IGABA was stronger than IGly. Furthermore, in HC the IGABA/IGly ratio was larger compared to IC. Taken together, our results demonstrate that astrocytes are heterogeneous across and within distinct brain areas. Furthermore, we could show that the capacity for glycine and GABA uptake varies between both brain regions.

Ecophysiological characterizations of photoautotrophic communities are not only necessary to identify the response of carbon fixation related to different climatic factors, but also to evaluate risks connected to changing environments. In biological soil crusts (BSCs), the description of ecophysiological features is difficult, due to the high variability in taxonomic composition and variable methodologies applied. Especially for BSCs in early successional stages, the available datasets are rare or focused on individual constituents, although these crusts may represent the only photoautotrophic component in many heavily disturbed ruderal areas, such as parking lots or building areas with increasing surface area worldwide. We analyzed the response of photosynthesis and respiration to changing BSC water contents (WCs), temperature and light in two early successional BSCs. We investigated whether the response of these parameters was different between intact BSC and the isolated dominating components. BSCs dominated by the cyanobacterium Nostoc commune and dominated by the green alga Zygogonium ericetorum were examined. A major divergence between the two BSCs was their absolute carbon fixation rate on a chlorophyll basis, which was significantly higher for the cyanobacterial crust. Nevertheless, independent of species composition, both crust types and their isolated organisms had convergent features such as high light acclimatization and a minor and very late-occurring depression in carbon uptake at water suprasaturation. This particular setup of ecophysiological features may enable these communities to cope with a high variety of climatic stresses and may therefore be a reason for their success in heavily disturbed areas with ongoing human impact. However, the shape of the response was different for intact BSC compared to separated organisms, especially in absolute net photosynthesis (NP) rates. This emphasizes the importance of measuring intact BSCs under natural conditions for collecting reliable data for meaningful analysis of BSC ecosystem services.

The screening of metagenomic datasets led to the identification of new phage-derived members of the heme oxygenase and the ferredoxin-dependent bilin reductase enzyme families. The novel bilin biosynthesis genes were shown to form mini-cassettes on metagenomic scaffolds and further form distinct clusters in phylogenetic analyses (Ledermann et al., 2016). In this project, it was demonstrated that the discovered sequences actually encode for active enzymes. The biochemical characterization of a member of the heme oxygenases (ΦHemO) revealed that it possesses a regiospecificity for the α-methine bridge in the cleavage of the heme macrocycle. The reaction product biliverdin IXα was shown to function as the substrate for the novel ferredoxin-dependent bilin reductases (PcyX reductases), which catalyze its reduction to PEB via the intermediate 15,16-DHBV. While it was demonstrated that ΦPcyX, a phage-derived member of the PcyX reductases, is an active enzyme, it also became clear that the rate of the reaction is highly dependent on the employed redox partner. It turned out that the ferredoxin from the cyanophage P-SSM2 is to date the most suitable redox partner for the reductases of the PcyX group. Furthermore, the solution of the ΦPcyX crystal structure revealed that it adopts an α/β/α-sandwich fold, typical for the FDBR-family. Activity assays and subsequent HPLC analyses with different variants of the ΦPcyX protein demonstrated that, despite their similarity, PcyX and PcyA reductases must act via different reaction mechanisms. Another part of this project focused on the biochemical characterization of the FDBR KflaHY2 from the streptophyte alga Klebsormidium flaccidum. Experiments with recombinant KflaHY2 showed that it is an active FDBR which produces 3(Z)-PCB as the main reaction product, like it can be found in reductases of the PcyA group. Moreover, it was shown that under the employed assay conditions the reaction of BV to PCB proceeds in two different ways: Both 3(Z)-PΦB and 18¹,18²-DHBV occur as intermediates. Activity assays with the purified intermediates yielded PCB. Hence, both compounds are suitable substrates for KflaHY2. The results of this work highlight the importance of the biochemical experiments, as catalytic activity cannot solely be predicted by sequence analysis.

Grape powdery mildew, Erysiphe necator, is one of the most significant plant pathogens, which affects grape growing regions world-wide. Because of its short generation time and the production of large amounts of conidia throughout the season, E. necator is classified as a moderate to high risk pathogen with respect to the development of fungicide resistance. The number of fungicidal mode of actions available to control powdery mildew is limited and for some of them resistances are already known. Aryl-phenyl-ketones (APKs), represented by metrafenone and pyriofenone, and succinate-dehydrogenase inhibitors (SDHIs), composed of numerous active ingredients, are two important fungicide classes used for the control of E. necator. Over the period 2014 to 2016, the emergence and development of metrafenone and SDHI resistant E. necator isolates in Europe was followed and evaluated. The distribution of resistant isolates was thereby strongly dependent on the European region. Whereas the north-western part is still predominantly sensitive, samples from east European countries showed higher resistance frequencies. Classical sensitivity tests with obligate biotrophs can be challenging regarding sampling, transport and especially the maintenance of the living strains. Whenever possible, molecular genetic methods are preferred for a more efficient monitoring. Such methods require the knowledge of the resistance mechanisms. The exact molecular target and the resistance mechanism of metrafenone is still unknown. Whole genome sequencing of metrafenone sensitive and resistant wheat powdery mildew isolates, as well as adapted laboratory mutants of Aspergillus nidulans, where performed with the aim to identify proteins potentially linked to the mode of action or which contribute to metrafenone resistance. Based on comparative SNP analysis, four proteins potentially associated with metrafenone resistance were identified, but validation studies could not confirm their role in metrafenone resistance. In contrast to APKs, the mode of action of SDHIs is well understood. Sequencing of the sdh-genes of less sensitive E. necator isolates identified four different target-site mutations, the B-H242R, B-I244V, C-G169D and C-G169S, in sdhB and sdhC, respectively. Based on this information it was possible to develop molecular genetic monitoring methods for the mutations B-H242R and C-G169D. In 2016, the B-H242R was thereby identified as by far the most frequent mutation. Depending on the analysed SDH compound and the sdh-genotype, different sensitivities were observed and revealed a complex cross-resistance pattern. Growth competition assays without selection pressure, with mixtures of sensitive and resistant E. necator isolates, were performed to determine potential fitness costs associated with fungicide resistance. With the experimental setups used, a clear fitness disadvantage associated with metrafenone resistance was not identified, although a strong variability of fitness was observed among the tested resistant E. necator isolates. For isolates with a reduced sensitivity towards SDHIs, associated fitness costs were dependent on the sdh-genotype analysed. Competition tests with the B-H242R genotypes gave evidence that there are no fitness costs associated with this mutation. In contrast, the C-G169D genotypes were less competitive, indicating a restricted fitness compared to the tested sensitive partners. Competition assays of field isolates, which exhibited several resistances towards different fungicide classes, indicated that there are no fitness costs associated with a multiple resistant phenotype in E. necator. Overall, these results clearly indicate the importance to analyse a representative number of isolates with sensitive and resistant phenotypes.

Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) wurden im Jahre 2002 in Bordetella‐Phagen entdeckt und stellen eine einzigartige Klasse unter den Retroelementen dar. Durch einen speziellen „Copy‐and‐ Replace“ Mechanismus sind sie in der Lage ein bestimmtes Zielgen zu hypermutieren. Bei diesem Mutagenic Homing‐Prozess wird die RNA der Templat‐Region (TR) durch die elementeigene reverse Transkriptase (RT) transkribiert. Die dabei entstandene mutierte cDNA wird anschließend in die variable Region (VR) des Zielgens inkorporiert und dieses somit diversifiziert. Hierbei steht der experimentelle Nachweis für die Hypermutation durch die RT noch aus. Zudem spielt das akzessorische Protein (Avd) eine weitere wichtige Rolle im Mutagenic Homing Prozess, wobei dessen tatsächliche Funktion noch nicht charakterisiert werden konnte. Bis dato gibt es vor allem Analysen in Bezug auf das Bordetella‐Phagen DGR, womit sich die Frage nach anderen Systemen und allgemeiner Anwendbarkeit stellt. Daher war die Analyse des Nostoc sp. PCC 7120 DGR Hauptgegenstand dieser Arbeit, wobei der Fokus auf der Untersuchung der reversen Transkripase (nRT), sowie der Charakterisierung des akzessorischen Proteins (nAvd) aus dem Nostoc sp. PCC 7120 DGR lag. Die nRT konnte überexprimiert werden, wobei sie nur teilweise löslich vorlag. Eine effektive Aufreinigung der nRT konnte mit den hier getesteten Methoden nicht erzielt werden, sodass andere Aufreinigungsmethoden erprobt werden müssen. Zudem war die nRT nicht lagerfähig, wodurch eine regelmäßige neue Proteinpräparation nötig war. In Aktivitätsstudien konnten erste Hinweise auf eine Aktivität der nRT erhalten werden. Dabei konnten die entstandenen Nukleinsäuren nicht nur detektiert, sondern auch mittels analytischem Verdau als DNA identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die synthetisierte cDNA mittels PCR amplifiziert und die PCR‐Produkte anschließend sequenziert werden. Hierbei wurden jedoch keine Adenin‐spezifischen oder sonstigen Mutationen beobachtet. Somit konnte kein Nachweis für Hypermutation durch die RT erbracht werden. Bei Untersuchungen bezüglich einer möglichen Interaktion zwischen nRT und nAvd konnte keine erhöhte nRT‐Aktivität durch die nAvd festgestellt werden. Die Untersuchungen der nAvd zeigten, dass diese Nukleinsäuren bindet. Hierbei waren Präferenzen gegenüber verschiedenen Nukleinsäuren zu beobachten. Vor allem RNA/DNA‐Hybride zeigt die höchste Affinität gegenüber der nAvd, während dsDNA eine höhere Affinität zur nAvd aufweist als ssRNA. Zudem ist die nAvd in der Lage Nukleinsäuren zu hybridisieren. Hierbei hybridisiert sie ATreiche DNA‐Moleküle von mittlerer Länge (48 bp) am effizientesten. Ein von der nAvd katalysierter Strangaustausch konnte nicht beobachtet werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die nAvd selbst bis 95 °C hitzestabil ist und im Anschluss an Hitzestress weiterhin Nukleinsäuren hybridisieren kann. Darüber hinaus ist sie befähigt Nukleinsäuren unter Hitzestress zu stabilisieren. Diese Ergebnisse lassen auf eine Rolle der nAvd als Lotse oder zur Stabilisierung von Nukleinsäuren schließen.

The biodiversity of the cyanobacterial lichen flora of Vietnam is chronically understudied. Previous studies often neglected the lichens that inhabit lowlands especially outcrops and sand dunes that are common habitats in Vietnam. A cyanolichen collection was gathered from lowlands of central and southern Vietnam to study their diversity and distribution. At the same time, cultured photobionts from those lichens were used for olyphasic taxonomic approach. A total of 66 cyanolichens were recorded from lowland regions in central and southern of Vietnam, doubles the number of cyanolichens for Vietnam. 80% of them are new records for Vietnam in which a new species Pyrenopsis melanophthalma and two new unidentified lichinacean taxa were described. A notably floristic segregation by habitats was indicated in the communities. Saxicolous Lichinales dominated in coastal outcrops that corresponded to 56% of lichen species richness. Lecanoralean cyanolichens and basidiolichens were found in the lowland forests. Precipitation correlated negatively to species richness in this study, indicating a competitive relationship. Eleven cyanobacterial strains including 8 baeocyte-forming members of the genus Chroococcidiopsis and 3 heterocyte-forming species of the genera Nostoc and Scytonema were successfully isolated from lichens. Phylogenetic and morphological analyses indicated that Chroococcidiopsis was the unique photobiont in Peltula. New mophological characters were found in two Chroococcidiopsis strains: (1) the purple content of cells in one photobiont strain that was isolated from a new lichinacean taxon, and (2) the pseudofilamentous feature by binary division from a strain that was isolated from Porocyphus dimorphus. With respect to heterocyte-forming cyanobiont, Scytonema was confirmed as the photobiont in the ascolichen Heppia lutosa applying the polyphasic method. The genus Scytonema in the basidiolichens Cyphellostereum was morphologically examinated in lichen thalli. For the first time the intracellular haustorial system of basidiolichen genus Cyphellostereum was noted and investigated. Phylogenetic analysis of photobiont strains Nostoc from Pannaria tavaresii and Parmeliella brisbanensis indicated that a high selectivity occurred in Parmeliella brisbanensis that were from different regions of the world, while low photobiont selectivity occurred among Pannaria tavaresii samples from different geographical regions. The herewith presented dissertation is therefore an important contribution to the lichen flora of Vietnam and a significant improvement of the actual knowledge about cyanolichens in this country.

Membrane proteins are generally soluble only in the presence of detergent micelles or other membrane-mimetic systems, which renders the determination of the protein’s molar mass or oligomeric state difficult. Moreover, the amount of bound detergent varies drastically among different proteins and detergents. However, the type of detergent and its concentration have a great influence on the protein’s structure, stability, and functionality and the success of structural and functional investigations and crystallographic trials. Size-exclusion chromatography, which is commonly used to determine the molar mass of water-soluble proteins, is not suitable for detergent-solubilised proteins because the protein–detergent complex has a different conformation and, thus, commonly exhibits a different migration behaviour than globular standard proteins. Thus, calibration curves obtained with standard proteins are not useful for membrane-protein analysis. However, the combination of size-exclusion chromatography with ultraviolet absorbance, static light scattering, and refractive index detection provides a tool to determine the molar mass of protein–detergent complexes in an absolute manner and allows for distinguishing the contributions of detergent and protein to the complex. The goal of this thesis was to refine the standard triple-detection size-exclusion chromatography measurement and data analysis procedure for challenging membrane-protein samples, non-standard detergents, and difficult solvents such as concentrated denaturant solutions that were thought to elude routine approaches. To this end, the influence of urea on the performance of the method beyond direct influences on detergents and proteins was investigated with the help of the water-soluble bovine serum albumin. On the basis of the obtained results, measurement and data analysis procedures were refined for different detergents and protein–detergent complexes comprising the membrane proteins OmpLA and Mistic from Escherichia coli and Bacillus subtilis, respectively. The investigations on mass and shape of different detergent micelles and the compositions of protein–detergent complexes in aqueous buffer and concentrated urea solutions showed that triple-detection size-exclusion chromatography provides valuable information about micelle masses and shapes under various conditions. Moreover, it is perfectly suited for the straightforward analysis of detergent-suspended proteins in terms of composition and oligomeric state not only under native but, more importantly, also under denaturing conditions.

Der rasante Anstieg an ß-lactamresistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweites medizinisches Problem dar. Für die Bekämpfung von resistenten Stämmen ist es wichtig, den Mechanismus der Resistenzentstehung zu verstehen. Die im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehenden S. pneumoniae-Isolate entstammen zwei unterschiedlichen Strategien zur Untersuchung der Entstehung und Verbreitung ß-lactamresistenter Pneumokokken. Die im Fokus des ersten Teils der vorliegenden Arbeit stehende Glycosyltransferase CpoA wurde von Grebe et al. (1997) als Resistenzdeterminante in zwei spontan-resistenten Labormutanten, P104 und P106, entdeckt. Beide wurden ausgehend von dem sensitiven S. pneumoniae R6 auf einer erhöhten Piperacillinkonzentration selektioniert. Berg et al. und Edman et al., beschrieben CpoA biochemisch als a-Galactosyl-Glycosyl-Diacylglycerin-Synthase, die einen Galactosylrest von UDP-Galaktose auf Glycosyldiacylglycerin (GlcDAG) überträgt (Berg et al., 2001; Edman et al., 2003) und so Galactosyl-Glycosyldiacylglycerin (GalGlcDAG), das Hauptglycolipid der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae bildet. Durch Detektion der Glycolipide in R6, P104, P106 und R6ΔcpoA konnten diese in vitro Daten in vivo bestätigt werden. Keine der cpoA-Mutanten wies eine detektiertbare Menge an GalGlcDAG auf. Neben der Veränderung des Glycolipidverhältnisses offenbarte die Darstellung der Membranlipide auch eine Änderung des Phospholipidverhältnisses. Die phänotypische Charakterisierung der cpoA-Mutanten zeigte eine pleiotropen Phänotyp, der mit einer verlangsamten Generationszeit, einer verminderten Säuretoleranz, einem erhöhten Bedarf an zweiwertigen Magnesiumionen, dem Verlust der natürlichen Transformierbarkeit, einer verzögerten Triton-induzierte Zelllyse, sowie eine reduzierte Bacitracinresistenz einher ging. Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse konnte gezeigt werden, dass vor allem Membranproteine, wie PTS-Systeme und ABC-Transporter, eine unterschiedliche Expressionsstärke im Vergleich zum Parentalstamm R6 aufwiesen. Als Grundlage für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit diente ein von Todorava (2010) durchgeführtes Transformationsexperiment, indem der sensitive S. pneumoniae R6 mit chromosomaler DNA des hochresistenten S. oralis Uo5 transformiert wurde. In sechs Transformationsschritten mit sukzessiv ansteigender Antibiotikakonzentration, konnten sechs Transformanten mit einer stufenweise erhöhten ß-Lactamresistenz generiert werden. Durch die Arbeiten von Todorova et al. (2015), konnte bereits gezeigt werden, dass drei niederaffine PBPs, sowie die Aminosäureligase MurE den Resistenzanstieg der ersten drei Selektionsschritte vermitteln. In dieser Arbeit wurde sich mit den Transformanten der Selektionsschritte vier, fünf und sechs beschäftigt. Durch Genomsequenzierung und anschließende Überprüfung bestimmter Sequenzbereiche konnten die Grenzen des horizontalen Gentransfers aufgewiesen werden. Der Resistenzanstieg in den letzten drei Selektionsschritten wurde nicht durch die Übertragung resistenter Uo5-Gene, sondern einzig durch Punktmutationen vermittelt. Die Charakterisierung, sowie die phänotypischen Auswirkungen der Veränderungen standen nach ihrer Identifizierung im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. In der Transformante des vierten Selektionsschrittes, PCPC, konnten zwei Punktmutationen identifiziert werden. Eine Punktmutation innerhalb des Histidinkinasegens ciaH des Zweikomponentensystems CiaRH und eine weitere in spr1992, welches für ein hypothetisches Protein codiert. Bei CiaH handelt es sich um die erste nicht-PBP-Resistenzdeterminante, die in S. pneumoniae entdeckt wurde (Guenzi et al., 1994). Es zeigte sich, dass das neu entdeckte ciaH-Allel (ciaH773) eine Hyperaktivität des CiaRH-Systems bewirkt und zur Instabilität neigt. Um das Risiko von sekundären Mutationen zu mindern, wurde die Expression von ciaH773 unter die Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors gestellt. Es konnte gezeigt werden, dass ciaH773 einen 11-fachen Anstieg der CiaR-vermittelten Genregulation, sowie eine Erhöhung der ß-Lactamresistenz bewirkt und zum Verlust der natürlichen Transformierbarkeit führt. Neben der Punktmutation in ciaH, konnte im vierten Selektionsschritt noch eine weitere Veränderung in spr1992 identifiziert werden. Beim Genprodukt von spr1992 handelt es sich um hypothetisches Protein. Blastanalysen lassen auf eine regulatorische Funktion von Spr1992 schließen. Die innerhalb dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten stark auf einen Beitrag der Punktmutation in spr1992 zur CiaR-vermittelten Genregulation, sowie zur Cefotaximresistenz in PCPC hin. Zukünftige Untersuchungen könnten den Zusammenhang von spr1992 mit dem CiaRH-System weiter spezifizieren.Innerhalb des fünften Selektionsschrittes konnte eine 10 bp Deletion in der Serinprotease HtrA detektiert werden, die aufgrund der Lokalisation im ersten Drittel der Serinprotease mit einem Knockout von HtrA vergleichbar ist. Es konnte gezeigt werden, dass die HtrA-Deletion zu einer weiteren Steigerung der CiaRH-vermittelten Genregulation, sowie zu einer Erhöhung der ß-Lactamresistenz führt. Durch Einbringen des ciaH773-Allels in S. pneumoniae R6 und anschließender htrA-Deletion konnte dieser regulatorische Effekt auch im Wildtyp-Hintergrund nachgewiesen werden. Durch anschließend durchgeführte globalen Transkriptomanalysen konnten weitere Einblicke in die regulatorische Funktion von HtrA im Hintergrund eines hyperaktiven CiaRH-Systems gewonnen werden. In PCPCCO, der Transformante des sechsten Selektionsschrittes, konnte eine Punktmutation im Penicillin-bindenden Protein 2b innerhalb des bereits im dritten Selektionsschritt ausgetauschten Uo5-Sequenzbereiches als Resistenzdeterminante identifiziert werden. Durch Einbringen von Q406P in S. pneumoniae R6 konnte das Resistenz vermittelnde Potential dieser Veränderung auch im Wildtyphintergrund nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass eine Resistenzdeterminante, die über horizontalen Gentransfer auf S. pneumoniae übertragen wurde, durch eine sekundäre Mutation, das Resistenzniveau ihres Rezipienten weiter steigern kann.

Bei Asthma handelt es sich um eine chronische Entzündung der Atemwege, die durch bronchiale Hyperreagibilität, reversible Atemwegsobstruktion und airway remodeling gekennzeichnet ist. Letzteres bezieht sich dabei auf die permanenten strukturellen Veränderungen in den Atemwegen, die zur Verdickung der Bronchialwand beitragen und für die bei Asthmatikern auftretende progressive und irreversible Abnahme der Lungenfunktion verantwortlich sind. Die epithelial zu mesenchymale Transition (EMT), ein physiologischer Prozess bei dem epitheliale Zellen den motilen und invasiven Phänotyp von Fibroblasten übernehmen, ist dabei eng mit der Zerstörung der epithelialen Barriere, subepithelialer Fibrose und der Akkumulation von Myofibroblasten assoziiert, die bei airway remodeling auftreten. Obwohl Wachstumsfaktoren wie der transforming growth factor β (TGF-β) als wichtige Induktoren von EMT gelten, weisen jüngste Ergebnisse auf eine EMT-modifizierende Wirkung von inflammatorischen Mediatoren hin. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, den Effekt der inflammatorischen Zytokine IL-4, IL- 17 und IL-22, die in der Pathogenese von allergischem (IL-4) bzw. nicht-allergischem (IL-17/ -22) Asthma involviert sind, auf die TGF-β induzierte EMT in vitro zu untersuchen. Keines der Zytokine war dabei in der Lage, selbstständig EMT induzieren, allerdings verstärkten und beschleunigten sie den EMT-Prozess in Kombination mit TGF-β, wobei die kombinierte Stimulation mit allen 3 Zytokinen einen additiven Effekt zeigte. Obwohl die Zytokine allein kurzzeitig die Transkription von EMT-essentiellen Transkriptionsfaktoren förderten, nahm deren Transkriptmenge sowie Proteinabundanz rasch wieder ab. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Stimulation mit TGF-β jedoch stark verringert, was auf eine essentielle Rolle des mRNA-stabilisierenden Effektes von TGF-β bei der Induktion von EMT hindeutet. Obwohl inhalierte Kortikosteroide als goldene Standardtherapie in der Asthmabehandlung gelten, verbleiben 5-10% der Asthmatiker therapieresistent. Desweiteren wird airway remodeling durch die Langzeit-Behandlung mit Kortikosteroiden nicht unterdrückt, weswegen neue therapeutische Ansätze entwickelt werden müssen. Naturstoffe mit ihrer strukturellen Komplexität sowie ihrem breiten Spektrum an biologischen Aktivitäten können dabei als potentielle Leitstrukturen dienen. In dieser Arbeit wurde das therapeutische Potenzial der Naturstoffe Cyclonerodiol und Oxacyclododecindion bezüglich Asthma-relevanter Pathomechanismen in vitro untersucht. Cyclonerodiol, das zuvor bereits als Inhibitor des IL-4 Signalweges charakterisiert wurde, hemmte auch den IL-13 Signalweg, der ebenfalls mit allergischem Asthma assoziiert ist. Auf mRNA- und Proteinebene reduzierte der Naturstoff die Expression inflammatorischer Zytokine und Chemokine, die an der Pathogenese von allergischem Asthma beteiligt sind. Untersuchungen zum Wirkmechanismus zeigten, dass Cyclonerodiol die Interaktion des Transkriptionsfaktors STAT6 mit den MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 und somit die Serin-Phosphorylierung von STAT6 reduziert, wodurch auch die Interaktion mit dem transkriptionellen Coaktivator p300 verringert wird. Oxacyclododecindion, das bereits als potenter Inhibitor der Expression von inflammatorischen sowie fibrotischen Genen identifiziert wurde, hemmte charakteristische Merkmale von schwerem, Glukokortikoidresistentem Asthma wie die durch IL-17 induzierte Expression inflammatorischer Gene. Die Substanz inhibierte zudem die durch TGF-β induzierte EMT wesentlich stärker als das potente Glukokortikoid Dexamethason. Studien zum Wirkmechanismus weisen darauf hin,dass es sich bei Oxacyclododecindion um einen Kinaseinhibitor mit TAK1 als potentieller Zielstruktur handeln könnte.

Im Verlauf dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression des tonoplastidären Dicarboxylat Transporters zu einem erhöhten Gehalt an Malat bei gleichzeitig vermindertem Citratgehalt in den Überexpressions-Pflanzen führt. Somit konnte, ähnlich wie in den k.o.-Pflanzen, ein reziprokes Verhalten von Citrat und Malat aufgezeigt werden. Elektrophysiologische Analysen an Oozyten von X. laevis in Zusammenhang mit Aufnahmeversuchen an Proteoliposomen zeigten weiterhin, dass der Transport von Citrat ebenfalls durch den TDT katalysiert wird. Anhand eines negativen Einwärts-Strom an Oozyten konnte gezeigt werden, dass dieser Citrat-Transport elektrogen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Citrat2-H die transportierte Form von Citrat darstellt. Dieses wird vermutlich zusammen mit drei Protonen transportiert. Die Dianionen Malat und Succinat, sowie höchstwahrscheinlich auch Fumarat, werden ebenfalls über den TDT transportiert. Unter Standardbedingungen werden diese in die Vakuole importiert. Im Gegenzug wird Citrat aus der Vakuole exportiert. Die trans-stimulierende Wechselwirkung von Malat, Succinat und Fumarat auf den Citrat Transport und vice versa bestärkt den in dieser Arbeit postulierten Antiport der jeweiligen Carboxylate über den Tonoplasten. Dieser ist jedoch nicht obligat, was an dem verringerten Transport von Citrat ohne Gegensubstrat über die Membran gezeigt werden konnte. Unter Trockenstress und osmotischen Stress konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die erhöhte Expression des TDT maßgeblich an der Akkumulation von Malat und der Mobilisierung von Citrat unter den genannten Stressbedingungen beteiligt ist. Letztlich konnte mittels Säurestressexperimenten nachgewiesen werden, dass die Malatakkumulation, bei gleichzeitigem Citrat Abbau nicht zwingend miteinander gekoppelt sind, unter Säurestress müssen daher weitere regulatorische Effekte auf den Malat-Import bzw. den Citrat-Export vorherrschen.

Es wurde zuerst das intrinsische Puffersystem der Oozyte charakterisiert, als Grundlage für eine weitere Untersuchung des \(CO_2/HCO_3^{-}\)-Puffersystem. Der \(pK_s\) des intrinsischen Puffersystem betrug 6,9 bei einer totalen Konzentration von 40 mM. Auf Basis des bestimmten \(pK_s\) von 6,9 wurden Carnosin und dessen Derivate als mobile Puffer identifiziert, die die Mobilität der \(H^+\) bestimmen. Aus der apparenten Diffusionskonstanten der \(H^+\) konnte der Anteil an mobilen Puffern am gesamten intrinsischen Puffersystem bestimmt werden, er betrug 37,5% bzw. 15 mM. Intrazelluläre CA erhöhte die Effektivität (Geschwindigkeit) des \(CO_2/HCO_3^{-}\)-Puffersystems, aber nicht die Pufferkapazität im Gleichgewicht. Damit dieser Effekt quantifiziert werden kann, musste die bestehende Definition der Pufferkapazität von Koppel & Spiro aus dem Jahre 1914 um eine zeitliche Komponente erweitert werden. Dafür wurde die Nettoreaktionsgeschwindigkeit r als Maß für die Dynamik eines Puffer oder einer Mischung aus verschiedenen Puffern hergeleitet und durch die numerische Lösung eines Systems an ODEs ausgerechnet . Ohne CA befand sich das \(CO_2/HCO_3^{-}\) bei der Applikation von Butyrat nicht mehr zu jeder Zeit im Gleichgewicht \( ( r\neq 0 ) \), was zu einer erhöhten \(\Delta pH_i/\Delta t\) führte. Nicht nur die Effektivität der Pufferung wurde durch die CA erhöht, auch die apparente Mobilität der Protonen wurde in Anwesenheit von \(CO_2/{HCO_3^{-}}\) erhöht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass \(H^+\) alle theoretisch nötigen Voraussetzungen erfüllt, die es braucht, um als Signalmolekül, ähnlich dem Calcium, fungieren zu können. So wird über die hohe Pufferung und den geringen Anteil an mobilen Puffern (37,5 % in der Oozyte) die Mobilität der \(H^+\) gesenkt, so dass sich Mikrodomänen mit aktiven Konzentrationen ausbilden können. Damit sich unter diesen Umständen eine Mikrodomäne ausbilden kann, ist ein Flux von \(0,8\cdot 10^6 H^+ /s\) nötig. Die Ausbildung von solchen Mikrodomänen kann physiologisch zur lokalen Modulation zellulärer Prozesse führen, da wichtige Bestandteile von Signalkaskaden, wie G-Proteine, pH-sensitiv sind. Die CA spielt für die Signalwirkung der \(H^+\) eine wichtige Rolle, so konnte gezeigt werden, dass CA-Aktivtät zu einer Unterscheidbarkeit von metabolischer und respiratorischer Ansäuerung führt, die ohne CA-Aktivität nicht möglich wäre.

Schon bei seiner Entdeckung konnte eine Verbindung des Zwei-Komponenten Systems CiaRH mit der natürlichen Kompetenzentwicklung und der β-Laktamresistenz in S. pneumoniae beobachtet werden. Mutationen in der Histidinkinase CiaH bewirken eine sogenannte Hyperaktivierung dieses Systems, welche zu einem vollständigen Verlust der Kompetenz und einem Anstieg der β-Laktamresistenz führen. Der über das CiaRH System vermittelte Kompetenzphänotyp ist dabei abhängig von der Serinprotease HtrA und den csRNAs. Die Serinprotease HtrA reduziert hierbei, durch Proteolyse, die Menge des Kompetenz spezifische Peptid CSP. In dieser Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass die csRNAs ihre negative Wirkung auf die Kompetenz ausüben, indem sie comC post-transkriptionell reprimieren. Wahrscheinlich wird hierbei die Initiation der Transaltion inhibiert, wobei die Stabilität der mRNA zusätzlich verringert werden könnte. ComC kodiert für das CSP Vorläuferpeptid. Daher üben die csRNAs noch vor der proteolytischen Wirkung von HtrA einen negativen Effekt auf die CSP Produktion aus. Anhand von comC-Translationsfusionen in S. pneumoniae Stämmen mit und ohne csRNAs, sowie in dem Stamm mit hyperaktivem ciaH202-Allel konnte eindeutig gezeigt werden, dass die csRNAs negativ auf die comC-Translation wirken. Mittels weiterer comC-Translationsfusionen, in Stämmen mit einzelnen csRNAs, ließ sich eine additive Wirkung der einzelnen csRNAs auf die comC-Translation nachweisen. Das bedeutet, dass eine csRNA alleine nicht in der Lage ist die Kompetenz zu reprimieren. Eine Kombination aus csRNA1, csRNA2 und csRNA3 allerdings ist sogar ohne die Anwesenheit von HtrA in der Lage, die Kompetenzentwicklung vollständig zu unterdrücken. Der Effekt der csRNAs auf die comC-Translation hat Auswirkungen auf die sich entwickelnde Kompetenz, was anhand von β-Galaktosidasemessungen des frühen Kompetenzpromotors PcomX gezeigt wurde. Hier konnte allerdings ein stark positiver Effekt der csRNA4 und csRNA5 auf diesen Promotor beobachtet werden. Weitere Versuche zeigten, dass dieser Effekt auch auf den frühen Kompetenzpromotor PcomC, aber nicht auf den späten Kompetenzpromotor Pcib zu beobachten ist. Hierbei scheint es sich um einen Regulationsmechanismus der csRNAs zu handeln, welcher die CSP-Produktion erhöht, ohne die Expression der Gene, die für die DNA Aufnahme und den Einbau verantwortlich sind, zu verändern. Der einerseits negative Effekt aller csRNAs auf die comC-Translation und andererseits positive Effekt der csRNA4 und csRNA5 sprechen dafür, dass die csRNAs an der Feinabstimmung der Kompetenzentwicklung beteiligt sind. Tatsächlich lassen sich Unterschiede im Zeitverlauf der Stämme mit einzelnen csRNAs erkennen. Vor allem kann ein Kompetenzpeak, wie im Wildtyp beobachtet, nicht mehr im csRNA-Deletionsstamm nachgewiesen werden. Die csRNAs scheinen die Kompetenzentwicklung bis zu einem gewissen Grad zu reprimieren. Ist aber der Schwellenwert überschritten, wirkt ein Teil positiv und trägt somit dazu bei, dass die Kompetenzentwicklung ohne Einschränkungen abläuft. Des Weiteren konnten, durch gezielte Mutationen in der comC mRNA, Bereiche in dieser identifiziert werden, welche für die Bindung der csRNAs an die mRNA essentiell sind. Hierzu gehört zum einen der Bereich zwischen der Shine-Dalgarno Sequenz und dem Startkodon sowie der Bereich direkt nach dem Startkodon AUG. Zum anderen gibt es Hinweise darauf, dass Mutationen, welche die Stabilität der mRNA beeinflussen könnten, die Regulation durch die csRNAs aufheben. Anhand einer komplementären Veränderung der csRNA4 konnte der negative Effekt dieser csRNA auf die Translation der veränderten comC mRNA wieder hergestellt werden. Die hier erbrachten Ergebnisse konnten einen weiteren kompetenzregulierenden Faktor identifizieren. Außerdem ergaben sich einige Hinweise, die dazu beitragen können, in weiteren Studien die komplexe Regulation der Kompetenzentwicklung besser zu verstehen. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem, ebenfalls schon bei der Entdeckung des CiaRH Systems beschriebenen, Anstieg der β-Laktamresistenz. Für diesen, durch ein hyperaktives CiaRH System vermittelten Anstieg konnte, wie schon bei der Kompetenz, ein wesentlicher Effekt der csRNAs nachgewiesen werden. Eine Deletion aller csRNAs in einem Stamm mit hyperaktivem CiaRH System bewirkt einen Zusammenbruch der Resistenz auf Wildtyp Niveau. Im Gegensatz zur Kompetenz konnte hier aber kein deutlicher Effekt der Serinprotease HtrA beobachtet werden. Wie schon bei der Kompetenz lag das Augenmerk dieser Arbeit auf dem Effekt der einzelnen csRNAs auf den Anstieg der β-Laktamresistenz. Hier konnte eine größtenteils additive Wirkung der csRNAs nachgewiesen werden. Allerdings wurden Stämme isoliert, in welchen die β-Laktamresistenz um das 10-fache im Vergleich zu dem Stamm mit hyperaktivem CiaRH System anstieg. Hierbei handelt es sich um Stämme, die csRNA4 oder csRNA5 enthalten. Da eine starke Instabilität in diesen Stämmen zu beobachten war, ist davon auszugehen, dass es hier zu Zusatzmutationen kam, welche den Resistenzanstieg bewirken. Allerdings konnte nachgewiesen werden, dass der beobachtete Resistenzanstieg nur im Zusammenhang mit csRNA4 vermittelt wird. Falls es hier zu Zusatzmutationen im Genom kam, wäre deren vermittelter Resistenzanstieg von csRNA4 abhängig. Da im Falle der β-Laktamresistenz die computerbasierte Zielgensuche keinen geeigneten Kandidaten erbrachte und keines der bekannten csRNA regulierten Gene die Resistenz beeinflusst, wurde hier eine globale Transkriptomanalyse zur Zielgensuche durchgeführt. Anhand dieser globalen Transkriptomanalyse konnten zwei neue potenzielle CiaR regulierte Gene, pavB und spr0091, identifiziert werden. Des Weiteren konnten zwei Gene, spr0264 und oxlT, identifiziert werden, deren Translation negativ durch die csRNAs reguliert wird. Hier konnte gezeigt werden, dass der UTP Metabolismus der Zelle betroffen ist. Hierrüber könnte die Menge an UDP verändert werden, welches zur Aktivierung von Vorläuferstufen der Zellwandbiosynthese benötigt wird. Ob diese beiden Transporter an dem Anstieg der Resistenz beteiligt sind, wurde bisher nicht untersucht. Die innerhalb dieser Arbeit durchgeführten globalen Transkriptomanalysen stellen allerdings eine gute Basis zur weiteren Identifikation von möglichen potenziellen csRNA Zielgenen dar. Hierüber könnte eventuell auch das β-Laktam spezifische Zielgen identifiziert werden. Das der deutliche Effekt der csRNAs, sekundär auf ein schon bekanntes β-Laktamresistenzgen zurückzuführen ist, ist dabei durchaus denkbar. Die in dieser Arbeit nachgewiesenen Regulationen der csRNAs bezüglich der Kompetenz- und β-Laktamresistenz konnten einen großen Beitrag zum besseren Verständnis dieser Regulations-mechanismen in S. pneumoniae leisten. Des Weiteren bilden die hier ermittelten Ergebnisse eine gute Basis für weitere Experimente.

Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) stellen einen neuen Typus Retroelement dar, die gezielt einen Teil einer codierenden Sequenz des Wirtsgenoms über einen Copy and Replace-Mechanismus hypermutieren und somit zur Erzeugung biologischer Diversität beitragen können. Trotz dieser einzigartigen Eigenschaften und dem potentiellen Wert dieser Elemente für Industrie und Forschung konzentrierten sich seit der Beschreibung des ersten DGRs vor über zehn Jahren die meisten Publikationen auf mechanistische Eigenschaften des Prototypen aus dem Bordetella Bakteriophagen. Allerdings sind zahlreiche Fragen zur Funktionsweise dieser Elemente noch immer ungeklärt. Ebenso wurden bisher extensivere, vergleichende Studien, die weitere Vertreter dieser Elemente berücksichtigen, noch nicht durchgeführt. Die vorliegende Dissertation leistet einen wichtigen Beitrag zum tieferen Verständnis diversitätsgenerierender Retroelemente. Das eigens für diesen Zweck konzipierte Programm DiGReF erlaubte eine umfassende Analyse der Bestände öffentlicher Datenbanken auf DGRs in sequenzierten Genomen. Mit Hilfe dieser Daten konnten weitere Aspekte dieser Elemente aufgeklärt werden, die eine Analyse ihrer Verteilung, ihrer phylogenetischen Beziehungen, ihrer Struktur und eine Charakterisierung der einzelnen Elemente einer DGR-Kassette umfassten. So konnte gezeigt werden, dass das zuvor für wenige Elemente beschriebene Merkmal der Adeninsubstitution eine gemeinsame Eigenschaft aller DGRs ist, während keine C-, T- oder G-Substitionen auftreten. Ebenso fanden sich erste Belege dafür, dass die beiden essentiellen Elemente Template Repeat und reverse Transkriptase nicht notwendigerweise ein gemeinsames Transkript besitzen. Außerdem konnte erstmalig die Gruppe der weitgehend uncharakterisierten akzessorischen Proteine umfassender beschrieben und ein Consensusmotiv ermittelt werden. Für künftige Studien werden die DiGReF-Software und die Ergebnisse dieser Arbeit von grundlegender Bedeutung sein. Der zweite Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die experimentelle Charakterisierung zweier Kernkomponenten von DGRs, der reversen Transkriptase und den akzessorischen Proteinen. Während die Aufreinigung einer DGR-assoziierten reversen Transkriptase noch weitere experimentelle Arbeiten erfordern wird, konnte das akzessorische Protein Alr3496 aus der Blaualge Nostoc sp. PCC 7120 erfolgreich in rekombinanter Form aufgereinigt werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Alr3496 diverse Nucleinsäuresubstrate bindet, und in der Lage ist, die Hybridisierung von komplementären DNA-Strängen zu katalysieren. Dies legt nahe, dass akzessorische Proteine aus DGR-Elementen eine Rolle als Nucleinsäurechaperone übernehmen.

Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst mit der β-Lactamresistenz, Kompetenz, Autolyse, Bakteriocinproduktion und Virulenz eine Vielzahl an Phänotypen in Streptococcus pneumoniae und ist daher von großer physiologischer Bedeutung. Es setzt sich aus der membrangebundenen Sensorkinase CiaH und dem cytoplasmatisch lokalisierten Response Regulator CiaR zusammen. Das CiaRH System ist unter sehr vielen Wachstumsbedingungen aktiv. CiaH ist allerdings für die Aktivierung von CiaR unter bestimmten Bedingungen verzichtbar. CiaR ist jedoch in seiner phosphorylierten Form aktiv, was die Frage nach einer alternativen Phosphatquelle für CiaR aufwirft. Der sog. Crosstalk durch eine fremde Sensorkinase oder niedermolekulare Phosphodonoren wie Acetylphosphat stellen mögliche Wege zur alternativen Phosphorylierung von CiaR dar. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Gene des Acetylphosphat-Stoffwechsels inaktiviert, was zu einer Änderung der Produktion von Acetylphosphat führen sollte. Anschließende Messungen der zellulären Acetylphosphatmenge und der CiaR-abhängigen Promotoraktivitäten in Abwesenheit der Sensorkinase CiaH zeigten klar, dass mit sinkendem Acetylphosphat auch die CiaR-vermittelte Genexpression reduziert wurde. Diese Korrelation legt den Schluss nahe, dass Acetylphosphat tatsächlich den wesentlichen alternativen Phosphodonor für CiaR darstellt. Allerdings wurden auch Hinweise für geringfügigen Crosstalk durch eine andere Sensorkinase erhalten. Im Zuge dieser Experimente ergab sich weiterhin, dass ein Enzym des Acetylphosphat-Stoffwechsels, die Acetatkinase, eine besondere Rolle bei der alternativen Phosphorylierung von CiaR spielt. Eine Reihe von Befunden legt den Schluss nahe, dass Acetatkinase und CiaR möglicherweise interagieren. Eine solche regulatorische Rolle der Acetatkinase ist bisher nicht beschrieben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CiaR-Aktivität durch die Bifunktionalität von CiaH auf nahezu konstantem Niveau gehalten wird. Dabei kann wahrscheinlich Acetat, ein exkretiertes Endprodukt des Acetylphosphat-Stoffwechsels, zur Stimulierung der Phosphataseaktivität von CiaH dienen. Dies könnte von physiologischer Bedeutung sein, um eine von Acetylphosphat ausgehende Phosphorylierung von CiaR durch Acetat im Medium durch Dephosphorylierung zu begrenzen. Somit könnten Acetylphosphat und Acetat Gegenspieler zur Regulation der CiaR-Aktivität darstellen. Ein einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde auf die Auswirkungen von Mutationen in CiaH auf die CiaR-Aktivität eingegangen. Das CiaRH-System wurde als erste Nicht-PBP-Resistenzdeteminante in β-lactamresistenten Labormutanten von S. pneumoniae R6 entdeckt, wobei eine Mutation im Sensorkinasegen ciaH (ciaH306, T230P) eine Erhöhung der CiaR-abhängigen Genexpression vermittelte. Weitere ciaH-Mutationen wurden in anderen spontanresistenten Labormutanten beschrieben. Die Laborallele vermitteln eine Steigerung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität zwischen vier- und 26-fach. Phänotypische Folgen sind die Verringerung der β-Lactamsuszeptibilität, der Verlust der Kompetenz und verändertes Wachstum von S. pneumoniae R6. Im Zuge dieser Arbeit wurden zum ersten Mal veränderte ciaH-Allele in klinischen Pneumokokken-Isolaten identifiziert und charakterisiert. Es zeigte sich eine Verbreitung in Isolaten der Serotypen 6, 7, 9, 19 und 23. Im Gegensatz zu den Laborallelen vermitteln die klinischen Allele eine bis zu dreifache Erhöhung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität. Lediglich das Allel ciaHTpVT beeinflusst die Phänotypen β-Lactamresistenz und Kompetenz. Weiterhin erfolgte die Charakterisierung der Kinase- und Phosphataseaktivitäten der klinischen ciaH-Allele. Hierbei zeigten sich Abweichungen der Stärken beider Funktionen, wobei für ciaH306 ein Phosphatasedefekt festgestellt wurde.

Die weltweite Verbreitung Penicillin-resistenter Bakterienstämme, darunter auch S. pneumoniae, stellt ein erhebliches medizinisches Problem dar. Resistenzen gegen Antibiotika können mittels horizontalem Gentransfer zwischen verschiedenen Streptokokken-Spezies ausgetauscht und somit verbreitet werden. In diesem Zusammenhang ist es wichtig die Vorgänge bei der Entstehung und Ausbreitung der β-Lactamresistenz zu verstehen. Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse des horizontalen Gentransfers zwischen den beiden Spezies Streptococcus mitis und Streptococcus pneumoniae und die daraus resultierende Entwicklung der β-Lactamresistenz. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die CCCB-Transformantenfamilie, welche durch die sukzessive Transformation von S. pneumoniae R6 mit chromosomaler DNA von S. mitis B6 und Selektion mit β-Lactamantibiotika generiert wurde. Dabei konnten bisher ungeklärte Faktoren der Resistenzentwicklung dieser Stämme identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eindeutig bewiesen, dass PBP2a in Kombination mit PBP2x aus S. mitis B6 einen entscheidenden Beitrag zur β-Lactamresistenz leistet. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in der Charakterisierung der Ursache des Resistenzunterschieds zwischen CCCB und CCCO. Diese zwei hochresistenten Stämme der vierten Transformationsstufe weisen scheinbar das gleiche Profil nieder-affiner Varianten aller fünf hochmolekularen PBP auf. Es konnte im Zuge dieser Arbeit gezeigt werden, dass das murM Gen aus S. mitis B6 lediglich in CCCB ausgetauscht wurde. Weiterführende Experimente bestätigten, dass sowohl MurMB6 als auch MurMHu17 aus einem resistenten S. pneumoniae Isolat, das über einen nahezu identischen Mosaikblock wie MurMB6 verfügt, erhöhte β-Lactamresistenz vermitteln. Das Mosaik-MurMB6 trägt somit entscheidend zur höheren Resistenz von CCCB bei. Zudem wurde nachgewiesen, dass der Resistenzunterschied zwischen CCCB und CCCO zusätzlich durch die Anwesenheit des kompletten PBP2bB6 in CCCB verursacht wird. Dabei konnte herausgestellt werden, dass die Aminosäuresubstitutionen des C-Terminus von PBP2bB6, die in CCCO nicht vorhanden sind, eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von β-Lactamresistenz spielen. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Identifizierung möglicher neuer Resistenzdeterminanten, welche von S. mitis B6 auf den bereits hochresistenten Stamm CCCB übertragen werden könnten. Durch die Transformation chromosomaler S. mitis B6 DNA in CCCB und Selektion mit diversen β-Lactamantibiotika konnten Stämme mit erhöhter β-Lactamresistenz isoliert werden. DNA-Microarray-Analysen dieser CCCB-Derivate dienten der Detektion möglicher übertragener Gene. Anstelle ausgetauschter, intakter Genloci zeigten diese Mutanten jedoch die Inaktivierung der Gene spr0683 bzw. spr1851. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der beobachtete Resistenzanstieg aus der Deletion dieser beiden Gene resultiert. Beide Gene kodieren für hypothetische Proteine mit potentiellen Nukleinsäure-bindenden R3H- bzw. KH-Domänen. Die genaue Funktion beider Domänen ist nicht bekannt. Transkriptionsanalysen der Deletionsderivate von spr0683 und spr1851 dienten als Screening-Methode für einen möglichen durch das Fehlen der Gene beeinflussten Effekt auf transkriptioneller Ebene. Die veränderte Genexpression einer möglichen Resistenzdeterminante (ClpL) deutete zunächst auf einen möglichen Zusammenhang mit den Resistenzphänotypen der Deletions-derivate hin. Weiterführende Versuche widerlegten dies jedoch. Zukünftige Untersuchungen müssten noch offene Fragen hinsichtlich der potentiellen Funktion der beiden hypothetischen Proteine klären.

TRP-Proteine sind integrale Membranproteine, die Untereinheiten von Kationenkanälen bilden, die z.B. an der Schmerz und Temperaturwahrnehmung, der Absorption von Mg2+ und Ca2+ im Darm und in der Niere oder für die Freisetzung von Entzündungsmediatoren in Immunzellen verantwortlich sind. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte TRPV6-Protein stellt einen hochselektiven Ca2+¬-Kanal dar, der für den tranzellulären Ca2+-Transport in Endothelzellen des Dünndarms und der Plazenta verantwortlich ist und für den bisher noch kein hochaffiner Agonist bekannt ist. Das niedrig exprimierte, integrale Membranprotein konnte ich erstmal im Rahmen meiner Diplomarbeit aus humaner Plazenta zusammen mit Annexin A2 und Cyclophilin B (CyPB) anreichern. Diese putative Interaktion zwischen dem Ionenkanal und CyPB wird im Rahmen meiner Doktorarbeit mit Coimmunpräzipitation, Saccharosedichtegradientenzentrifugation, Peptidblotanalyse und GST-Pulldown-Analysen untersucht. Hierbei kann die TRPV6-CyPB-Interaktion in Immunpräzipitationen mit unabhängigen Antikörpern bestätigt werden. Die Ergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation belegen die Existenz von TRPV6-Multimeren bzw. von TRPV6 enthaltenden Multiproteinkomplexen. Unter diesen Bedingungen ist allerdings keine CyPB-Assoziation mit dem TRPV6-Protein festzustellen. Das Einengen der Bindestelle von CyPB im TRPV6-Protein mittels Peptidblot- und GST-Pulldown-Analyse führt zur der potentiellen Bindungsstelle mit der minimalen Aminosäuresequenz Y66EDCKV71. Meine Ergebnisse waren Ausgangspunkt für die funktionelle Charakterisierung der TRPV6-CyPB-Interaktion in Xenopus laevis Oozyten, die zeigt, dass CyPB den Ionenkanal aktiviert. Die Bindung zwischen beiden Proteinen ist offenbar wenig affin und scheint nur unter den gegebenen Solubilisierungsbedingungen nachweisbar. Zur Erhaltung möglicher kalziumabhängiger Proteinbindungen wird die zuvor benutzte mehrstufige TRPV6-Affinitätschromatographie, bestehend aus einer CaM- und einer TRPV6-Antikörpersäule, durch eine einstufige Affinitätsreinigung ersetzt. Zur Solubilisierung und Isolierung des TRPV6-enthaltenden Proteinkomplexes eignen sich hierbei insbesondere die nichtionischen Detergenzien Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und Digitonin. Zur Auftrennung und Untersuchung der isolierten TRPV6-Proteinkomplexe kann weiterhin eine zweidimensionale Blue Native-Gelelektrophorese (BN-PAGE) etabliert und die daraus isolierten Proteine massenspektrometrisch analysiert werden. Für die Auftrennung der TRPV6-Proteinkomplexe in der BN-PAGE eigenen sich ebenfalls am besten die nichtionischen Detergenzien DDM und Digitonin. Das TRPV6-Protein wird nach der nativen BN-PAGE als Bestandteil eines oder mehrerer Proteinkomplexe mit einem Molekulargewicht von 440 - 670 kDa detektiert. Abschließend wird die Übertragbarkeit der für TRPV6 etablierten Vorgehensweise zur Isolierung von Membranproteinkomplexen auf andere TRP-Kanalproteine in verschiedenen Geweben gezeigt. So kann TRPV6 aus Mausplazenta und das TRPC6-Membranprotein aus murinen Mastzellen und Mauslungengewebe mittels Coimmunpräzipitation und Affinitätschromatographie isoliert und spezifisch detektiert werden.

Oxa1 ist ein integrales Protein der mitochondrialen Innenmembran und eine zentrale Komponente der Proteininsertionsmaschinerie in Mitochondrien. Oxa1 ist an der Insertion zweier unterschiedlicher Klassen von Proteinen in die Innenmembran beteiligt: Durch eine C-terminale, matrixständige Domäne interagiert Oxa1 mit mitochondrialen Ribosomen und vermittelt so die ko-translationale Membraninsertion mitochondrial kodierter Proteine. Darüber hinaus wurde auch eine Beteiligung von Oxa1 an der Insertion einiger kernkodierter Proteine beschrieben. Bei allen bisher identifizierten kernkodierten Substraten von Oxa1 handelt es sich um sogenannte konservativ sortierte Proteine, die nach ihrer Synthese im Zytosol zunächst klassisch über die Translokasen der mitochondrialen Außen- und Innenmembran in die mitochondriale Matrix importiert werden. In einem Oxa1-vermittelten Schritt werden sie schließlich von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert. Vergleiche mit dem bakteriellen Oxa1-Homolog YidC lassen weiterhin vermuten, dass Oxa1 auch an der Faltung von Membranproteinen beteiligt sein könnte, bisher ist eine solche Oxa1-Funktion jedoch nur in Einzelfällen beschrieben worden. Der genaue molekulare Mechanismus der Proteininsertion durch Oxa1 sowie eine eventuelle Be- teiligung von Oxa1 an der Insertion anderer mitochondrialer Innenmembranproteine ist bisher unklar. Es war daher uberraschend festzustellen, dass die Level des ADP/ATP-Carriers in Abwesenheit von Oxa1 stark reduziert waren. Der Import und die Membraninsertion mitochondrialer Carrier wurden in den vergangenen Jahren im Detail beschrieben, bisherige Studien deuteten jedoch nie auf eine Beteiligung von Oxa1 bei der Carrier-Biogenese hin. Carrier-Proteine werden, im Gegensatz zu konservativ sortierten Proteinen, aus dem Intermembranraum in die Innenmembran inseriert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Importversuche gezeigt werden, dass Oxa1 eine wichtige, wenn auch nicht essentielle Funktion bei der Biogenese verschiedener Vertreter der mitochondrialen Carrier-Familie einnimmt. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass Oxa1 nicht an der Membraninsertion der Carrier-Proteine per se beteiligt ist, sondern ahnlich einem Chaperon die TIM22-abh¨ ngig inserierten Carrier stabilisiert und ihre Faltung oder Assemblierung in der Membran begünstigt. Diese Arbeit zeigt somit, dass Oxa1 nicht nur an der Membraninsertion verschiedener mitochondrial und kernkodierter Proteine beteiligt ist, sondern eine weitere wichtige Funktion als Chaperon einnimmt. Bedeutend ist hierbei vor allem, dass diese Rolle bei der Stabilisierung und Faltung mitochondrialer Innenmembranproteine sich nicht auf klassische Oxa1-Substrate beschränkt, die von Seiten der Matrix in die Membran inseriert werden, sondern entscheidend die Biogenese von Proteinen beeinflusst, deren eigentliche Membraninsertion Oxa1- unabhängig verläuft. Die Bedeutung von Oxa1 bei der Insertion mitochondrial kodierter Proteine ist gut dokumentiert, genaue mechanistische Details des Prozesses der Membraninsertion durch Oxa1 fehlen jedoch bisher. Um den molekularen Mechanismus der Oxa1-vermittelten Proteininsertion besser zu verstehen, wurde die native Aufreinigung von rekombinant exprimiertem S. cerevisiae Oxa1 etabliert und gezeigt, dass dieses einen dimeren oder höher oligomeren Komplex ausbildet. Oxa1 wurde weiterhin erfolgreich in Proteoliposomen rekonstituiert und stimuliert in vitro die Insertion des mitochodrial kodierten Proteins Atp8. In dieser Arbeit wurden vorläufige Daten über die Oxa1-vermittelte Proteininsertion gesammelt. Das hier etablierte Rekonstitutionssystem wird eine wichtige Basis für zukünftige Arbeiten bilden, die zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Oxa1-abhängigen Proteininsertion beitragen werden.

Der Katabolismus von Pyrimidin-Nukleobasen erfolgt in Arabidopsis thaliana über einen dreistufigen Stoffwechselweg. In diesem wird Uracil zu beta-Alanin, Kohlenstoffdioxid und Stickstoff in Form von Ammonium abgebaut. Die erste Reaktion, die Reduktion von Uracil zu Dihydrouracil wird von dem plastidären Enzym Dihydrouracil-Dehydrogenase (Pyd1) katalysiert. „Knockout“-Mutanten zeigten verglichen mit Wildtyp-Pflanzen bis zu 50-fach erhöhte Uracilgehalte in allen untersuchten Geweben. Diese Mutanten waren nicht in der Lage, die radioaktiv markierten Pyrimidine Uridin und Uracil zu degradieren und deshalb hochsensitiv gegenüber den toxischen Derivaten 5-Fluorouridin und 5-Fluorouracil. Im Gegensatz dazu wiesen Mutanten, die Pyd1 überexprimieren eine erhöhte Resistenz gegenüber diesen toxischen Derivaten auf. Expressionsanalysen deckten auf, dass Pyd1 hauptsächlich im trockenen Samen exprimiert wird. Die transgenen Pyd1-Pflanzen wiesen einen drastischen Keimungsphänotyp auf. Während „knockout“-Mutanten 2 Tage später als Arabidopsis thaliana-Wildtyp-Pflanzen keimten, waren die Pyd1-Überexpressions-pflanzen in der Lage etwas früher zu keimen. Dies indiziert, dass die Aktivität der Pyd1 in der frühen pflanzlichen Entwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Auch der Abscisinsäure-Stoffwechsel scheint in diesen Keimungsphänotyp involviert zu sein. Weiterhin entwickelten die Pyd1-Überexpressionspflanzen mehr Schoten und Samen als Wildtyp-Pflanzen, die „knockout“-Pflanzen weniger. War während der pflanzlichen Entwicklung Stickstoff limitierend, erhöhten sich Pyd1-Expression und Pyd1-Aktivität. Pyd1 scheint ein Schlüsselregulator des Pyrimidin-Katabolismus zu sein, der zwischen den Bedürfnissen an Stickstoff von Nukleotiden und anderen Metaboliten wie beispielsweise Aminosäuren vermittelt. Weiterhin erwies sich Pyd1 als wichtige Komponente in der Remobilisierung des Stickstoffs aus seneszenten Geweben. Es wurde untersucht, ob eventuell ein weiteres Enzym mit Dihydrouracil-Dehydrogenase-Aktivität existiert. Das Arabidopsis thaliana-Protein mit der höchsten Homologie zur Aminosäuresequenz von Pyd1 ist das Enzym Dihydroorotat-Dehydrogenase (DHODH), welches den vierten Schritt der Pyrimidin-de novo-Synthese katalysiert, die Oxidation von Dihydroorotat zu Orotat. Der Pyrimidinkatabolismus stellt die Umkehrung der Pyrimidin-de novo-Synthese dar und die von Pyd1 und DHODH katalysierten Reaktionen sind chemisch ähnlich. Transgene Pflanzen mit einer gesteigerten DHODH-Expression waren zu einer erhöhten Dihydroorotat-Oxidation in der Lage, zeigten aber keinerlei Pyd1-Aktivität. Während eine geringfügige Reduktion in der DHODH-Expression keinen Einfluss auf die pflanzliche Entwicklung hatte, wiesen Dosismutanten mit einer starken Reduktion des DHODH-Transkriptgehaltes einen drastischen Phänotyp auf. Die entsprechenden Pflanzen waren zwergwüchsig, bildeten rötlich-braune Keimblätter aus und ihr Wurzelwachstum war im Vergleich zu Arabidopsis thaliana-Wildtyp-Pflanzen stark vermindert. Zudem hatten diese Pflanzen weniger RNA, was auf eine geringere Pyrimidinverfügbarkeit hindeutet. Gewebespezifische Expressionsanalysen unterstrichen die Bedeutung der DHODH und damit der Pyrimidin-de novo-Synthese in wachsenden Geweben, in denen die Bereitstellung neuer Pyrimidin-Grundgerüste von essentieller Bedeutung ist. Weiterhin konnten erste Hinweise darauf erbracht werden, dass die pflanzliche DHODH, so wie auch das Homolog in Tieren an der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmemban verankert und dort als Flavoprotein an die Atmungskette gekoppelt ist.

Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte die physiologische Funktion des AtENT1 weitestgehend aufgeklärt werden. Durch Untersuchungen an RNAi- und Überexpressionslinien konnte gezeigt werden, dass dieser Nukleosidtransporter in unterschiedlichen Geweben verschiedene Aufgaben erfüllt. Die verringerte Expression des AtENT1 in den RNAi-Pflanzen hat hauptsächlich Auswirkungen auf den Nukleotidhaushalt in Pollen. Diese zeigen eine geringere Keimungsrate, eine niedrigere Nukleosidaufnahme sowie verringerte Mengen an intra- und extrazellulärem ATP. Daraus kann man schließen, dass der AtENT1 eine wichtige Funktion in der Versorgung von Pollen mit Nukleosiden während der Entwicklung und zu Beginn der Keimung hat. Die veränderte Menge an eATP in den RNAi-Pollen führt möglicherweise zu einer veränderten Signaltransduktion, was ebenfalls ein Grund für die schlechtere Keimungsrate im Vergleich mit WT-Pollen sein könnte. Weiterhin deutet die verminderte Aufnahme von Adenosin in RNAi-Pollen darauf hin, dass AtENT1 in diesen Zellen in der Plasmamembran lokalisiert ist. Sowohl in Blatt-Rohextrakten als auch in isolierten Vakuolen der AtENT1-RNAi-Pflanzen konnte ein erhöhter Adenosingehalt festgestellt werden, während dieser in Blättern und Vakuolen der AtENT1-35S-Pflanzen deutlich verringert war. Weiterhin konnte an Liposomen mit rekostituiertem Tonoplastenprotein aus Überexpressionspflanzen ein höherer Adenosinexport verglichen mit Liposomen mit WT-Tonoplastenprotein beobachtet werden. Als wahrscheinlichste Quelle der Nukleoside konnte der in der Vakuole stattfindende RNA-Abbau mit Nukleosiden als End- und 2‘3‘-cAMP als Zwischenprodukt nachgewiesen werden. Ein gesteigerter Nukleosidtransport aus der Vakuole durch Überexpression des AtENT1 führt zu einem Anstieg der zytosolischen Nukleosidkonzentration. Als Reaktion darauf sind die Aktivitäten der Enzyme des „salvage pathway“ in den entsprechenden Mutanten erhöht. Ein Anstieg der zytosolischen Adenosinkonzentration führt durch Feedback-Inhibierung zu einer Verringerung der Transmethylierungsreaktionen. In der stärksten Überexpressionspflanze konnte, als Folge dieser Inhibierung, eine verringerte Zellwandmethylierung beobachtet werden. Betrachtet man alle Ergebnisse der Untersuchungen in vegetativem Gewebe ist eine Lokalisierung des AtENT1 im Tonoplasten sehr wahrscheinlich. Der letzte Teil der Arbeit befasste sich mit der biochemischen Charakterisierung der putativen Nukleosidtransporter StENT1 und StENT3 aus Solanum tuberosum. Dabei konnte gezeigt werden dass es sich beim StENT1 um einen hoch affinen Transporter für Purin- und Pyrimidinnukleoside handelt. Aufgrund der Ähnlichkeit der Transporteigenschaften zum AtENT1 und der ebenfalls vorhandenen möglichen Signalsequenz für eine tonoplastidäre Lokalisierung könnte StENT1 auch ein physiologisches Homolog zum AtENT1 sein. StENT3 vermittelt einen hoch affinen, pyrimidinspezifischen Nukleosidtransport. Dieser Transporter könnte vor allem in Knollen für die Aufnahme von Pyrimidinen aus der Erde oder dem Phloem zuständig sein.

Der TRPV5 Ionenkanal ist ein hoch selektiver Kalziumkanal, der in der Niere exprimiert wird und dort für den transzellulären Kalziumtransport im distalen Konvolut verantwortlich ist. TRPV5 Transkripte sind auch in anderen Geweben, wie z.B. der Plazenta, identifiziert worden. In dieser Arbeit wurde versucht, das TRPV5 Protein in verschiedenen Geweben nachzuweisen und den Kanal sowie eventuell daran assoziierte Proteine aus der Plazenta zu isolieren. Hierzu wurden verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden vier polyklonale Peptidantikörper generiert, einer gegen einen N- und drei gegen C-terminale Bereiche des humanen TRPV5 Proteins. Diese wurden eingehend mittels ELISA, Peptidblot-Analysen, Western Blot Analysen und immunhistochemischen Färbungen bezüglich ihrer Spezifität und Affinität charakterisiert. Alle generierten Antikörper erkennen spezifisch nur die antigenen Bindungsregionen in Glutathion-S-Transferase (GST)-TRPV5-Fusionsproteinen und detektieren das endogen in humaner Plazenta exprimierte Protein. Der Antikörper, der gegen den absoluten C-Terminus des TRPV5 Ionenkanals gerichtet ist (982/3), erwies sich zum Nachweis des TRPV5 Proteins im distalen Konvolut in Mausnieren als geeignet, allerdings zum Nachweis des TRPV5 Proteins im Synzytiotrophoblasten der humanen Plazenta, ist einer der anderen C-terminalen TRPV5 Antikörper besser geeignet. Der Antikörper 982/3 wurde auch in Immunpräzipitationen und Antikörper-Affinitäts-chromatographien eingesetzt. Mit diesen beiden Methoden konnte das TRPV5 zwar in kleinen Mengen aus humanem Plazentagewebe bzw. Mausnieregewebe angereichert und im anschließenden Western Blot detekiert werden, allerdings war die Menge des isolierten Proteins so gering, dass eine massenspektrometrische Identifikation nicht möglich war. Parallel wurden GST-Pulldown Versuche mit Fusionsproteinen, die den N- und C-Terminus des TRPV5 Proteins enthalten, mit Proteinextrakten der humanen Plazenta durchgeführt. Hierbei wurden insgesamt 38 Proteine als putative Interaktionspartner von TRPV5 identifiziert. Darunter befinden sich bereits in der Literatur beschriebene Interaktionspartner, wie NHERF2 und Galectin-1, und zahlreiche potentielle TRPV5 bindende Proteine. Zu den häufigsten identifizierten Proteinen zählen die Proteine 11ß-HSD2, Ku70 und Calpain-6. Ihre Bindung an N- und C-terminale Bereiche des Ionenkanals, nicht aber an GST konnte in weiteren GST-Pulldown-Experimenten und anschließender Identifikation im Western Blot bestätigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das TRPV5 Protein in der humanen Plazenta an der Blut-Plazenta Schranke exprimiert wird. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist dort das Protein mit anderen Proteinen assembliert. Inwiefern diese Interaktionen die Kanalaktivität beeinflussen müsste in weiteren Experimenten untersucht werden.

Proteins of the intermembrane space of mitochondria are generally encoded by nuclear genes that are synthesized in the cytosol. A group of small intermembrane space proteins lack classical mitochondrial targeting sequences, but these proteins are imported in an oxidation-driven reaction that relies on the activity of two components, Mia40 and Erv1. Both proteins constitute the mitochondrial disulfide relay system. Mia40 functions as an import receptor that interacts with incoming polypeptides via transient, intermolecular disulfide bonds. Erv1 is an FAD-binding sulfhydryl oxidase that activates Mia40 by re-oxidation, but the process how Erv1 itself is re-oxidized has been poorly understood. Here, I show that Erv1 interacts with cytochrome c which provides a functional link between the mitochondrial disulfide relay system and the respiratory chain. This mechanism not only increases the efficiency of mitochondrial inport by the re-oxidation of Erv1 and Mia40 but also prevents the formation of deleterious hydrogen peroxide within the intermembrane space. Thus, the miochondrial disulfide relay system is, analogous to that of the bacterial periplasm, connected to the electron transport chain of the inner membrane, which possibly allows an oxygen-dependend regulation of mitochondrial import rates. In addition, I modeled the structure of Erv1 on the basis of the Saccharomyces cerevisiae Erv2 crystal structure in order to gain insight into the molecular mechanism of Erv1. According to the high degree of sequence homologies, various characteristics found for Erv2 are also valid for Erv1. Finally, I propose a regulatory function of the disulfide relay system on the respiratory chain. The disulfide relay system senses the molecular oxygen levels in mitochondria and, thus, is able to adapt respiratory chain activity in order to prevent wastage of NADH and production of ROS.

Prostate cancer preferentially metastasizes to the skeleton and abundant evidence exists that osteoblasts specifically support the metastatic process, including cancer stem cell niche formation. At early stages of bone metastasis, crosstalk of prostate cancer cells and osteoblasts through soluble molecules results in a decrease of cancer cell proliferation, accompanied by altered adhesive properties and increased expression of bone-specific genes, or osteomimicry. Osteoblasts synthesize a plethora of biologically active factors, which comprise the unique bone microenvironment. By means of quantitative real-time RT-PCR it was determined that exposure to the osteoblast secretome induced gene expression changes in prostate cancer cells, including the upregulation of osteomimetic genes such as BMP2, AP, COL1A1, OPG and RANKL. IL6 and TGFbeta1 signaling pathway components also became upregulated at early time points. Moreover, osteoblast-released IL6 and TGFbeta1 contributed to the upregulation of OPG mRNA in LNCaP. Thus, the earliest response of prostate cancer cells to osteoblast-released factors, which ultimately cause metastatic cells to assume an osteomimetic phenotype, involved activation of paracrine and autocrine IL6 and TGFbeta signaling. On the other hand, a microarray analysis showed that osteoblasts exposed to the secretome of prostate cancer cells exhibited gene expression alterations suggestive of repressed proliferation, decreased matrix synthesis and inhibited immune response, which together indicate enhanced preosteocytic differentiation. TGFbeta signaling, known to inhibit osteoblast maturation, was strongly suppressed, as shown by elevated expression of negative regulators, downregulation of pathway components and of numerous target genes. Transcriptional downregulation of osteoblast inhibitory molecules such as DKK1 and FST also occurred, with concomitant upregulation of the osteoinductive molecules ADM, STC1 and BMP2, and of the transcription factors CBFA1 and HES1, which promote osteoblast differentiation. Finally, the mRNA encoding NPPB, the precursor of a molecule implicated in the inhibition of TGFbetaeffects, in bone formation and in stem cell maintenance, became upregulated after coculture both in osteoblasts and in prostate cancer cells. These results provide an insight into potential mechanisms of dysregulated bone formation in metastatic prostate cancer, as well as mechanisms by which osteoblasts might enhance the invasive, osteomimetic and stem cell-like properties of the tumor cells. In particular, the differential modulation of TGFbetasignaling in prostate cancer cells and osteoblasts appears to merit further research.

I) Die Untersuchungen zum vakuolären Malat-Carrier AtTDT unterstützen die Annahme, dass seine Aktivität in den Schließzellen zum Öffnen und Schließen der Stomata beiträgt. Zudem erhöht wahrscheinlich die Aktivität von TDT in den Mesophyllzellen die Stomata-Dichte und den Stomata-Index. Im Rahmen einer osmotischen Anpassung vermittelt der Transporter eine Malat-Akkumulation, die in den TDT-Knockout-Mutanten beeinträchtigt ist und durch erhöhte Citrat-Gehalte kompensiert wird. Darüber hinaus beschleunigt TDT unter Kurztag-Bedingungen den Eintritt in die generative Phase. Eine Funktion von TDT in der Salztoleranz kann nach metabolischen und phänotypischen Analysen ausgeschlossen werden. II) Die tonoplastidären Monosaccharid-Transporter regulieren bei Kälte in Blättern nicht nur die Monosaccharid-Gehalte, sondern wirken auch positiv auf Photosynthese und Stärkegehalte. Das Ausschalten der TMT-Gene führt unter den gewählten Kältebedingungen zu einer erhöhten Synthese von Saccharose und zu einer gesteigerten Respirationsrate. Insbesondere unter Wassermangel wirkt sich die Aktivität der tonoplastidären Monosaccharid-Transporter positiv auf die Keimungsrate aus. III) Die Bestimmung von Zuckergehalten in Blättern indiziert, dass die tonoplastidären Transportproteine AtERD6.7 und BvIMP Glukose aus der Vakuole transportieren, während AtERD6.5 womöglich Fruktose aus der Vakuole transportiert. Als Transportmechanismus wird aufgrund der Homologie zu den GLUT-Proteinen eine erleichterte Diffusion angenommen. Die Aktivität der Carrier scheint insbesondere nach Kältephasen von Bedeutung zu sein, wenn vakuolär gespeicherte Zucker mobilisiert werden. ERD6.7 fördert gemäß den durchgeführten Keimungstests die Samen-Dormanz.

In my doctoral thesis, I present new information about the developmental expression pattern of the potassium chloride cotransporter KCC2 in the rat auditory brain stem and the morphometrical effects caused by KCC2 gene silencing in mice. The thesis is divided into 3 Chapters. Chapter 1 is a general introduction which gives a brief outline of the primary ascending auditory pathway in mammals. Also, it provides information about the presence of a large number of inhibitory inputs in the auditory system and how these inputs develop; the involvement of inhibition in the acoustic processing is mentioned. In addition, the role of the KCC2 cotransporter in the shift of GABA/glycine transmission, and thus, in maintaining the normal level of inhibition in the mature brain, is described. The focus of Chapter 2 was to investigate the KCC2 immunofluorescent signal from postnatal day (P) 0 to P60 in four major nuclei of the rats superior olivary complex (SOC), namely the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB), the medial superior olive (MSO), the lateral superior olive (LSO), and the superior paraolivary nucleus (SPN). The lack of a correlation between the continuous presence of KCC2 mRNA/protein in the postnatal rat brain stem on one side, and the shift in GABA/glycinergic polarity (i.e. KCC2 functionality) on the other side, prompted me to search for a specific cellular expression pattern of the KCC2 protein that might correlate with the switch in GABA/glycine signalling. To do so, the KCC2 immunoreactivity was analysed using high-resolution confocal microscopy in three cellular regions of interest: the soma surface, the soma interior, and the neuropil. In the soma surface, I observed an increase of the KCC2 immunofluorescent signal intensity, yet with a moderate magnitude (1.1 to 1.6-fold). Therefore, I conclude that the change in the soma surface signal is only of minor importance and does not explain the change in KCC2 functionality. The KCC2 signal intensity in the soma interior decreased in all nuclei (1.4 to 2-fold) with the exception of the MNTB where no statistically significant change was found. The decrease in the soma interior was probably related to the increase in the soma surface immunoreactivity and the proposed (weak) intracellular trafficking process of the KCC2 protein. The main developmental reorganization (in qualitative as well as in quantitative aspects) of the KCC2 immunofluorescence in the SOC nuclei was observed in the neuropil. The signal changed its pattern from a diffusely stained neuropil early in development (P0-P4) to a crisp and membrane-confined signal later on (P8-P60), with single dendrites becoming apparent. The exception was found in the MNTB, where the neuropil became almost unlabeled. Quantification revealed a statistically significant decrease (2.2 to 3.8-fold) in the neuropil immunoreactivity in all four nuclei, although the remaining KCC2-stained dendrites became thicker and the signal became stronger. I suppose that, at least in part, the neuropil reorganization can be explained by an age-related reduction of dendritic branches via a pruning mechanism and with the absence of an abnormal Cl- load via extrasynaptic GABAA receptors. This is consistent with the proposed additional role of KCC2, namely to maintain the cellular ionic homeostasis and to prevent dendritic swelling (Gulyás et al., 2001). In conclusion, neither the increase in the KCC2 soma surface signal intensity, nor the reorganization in the neuropil can be strictly related to the developmental switch in the GABA/glycine polarity and the onset of KCC2 function, although some correlation (the appearance of a specific membrane-confined dendritic pattern) between structure and function was found. Further implication of different molecular methods, regarding the proposed posttranslational modification of KCC2, will shed light upon the question of what leads to the functional activation of the cotransporter. In Chapter 3, the advantage of loss-of-function KCC2 mice made it possible, via manipulating the duration of the depolarizing phase of GABA/glycine transmission, to analyse the effect of disturbed Cl- regulation and, thus, the effect of disrupted GABA/glycine neurotransmission (lack of inhibition). I asked the following question: how important is the Cl- homeostasis to maintain general aspects (brain weight) and specific aspects (nucleus volume, neuron number, and soma cross-sectional area) of brain development? Brain stem slices from KCC2 knock-out animals (-/-), with a trace amount of transporter (~5%), as well as from wild type animals (+/+) at P3 and P12 were stained for Nissl substance and the analyses were performed with the help of basic morphometrical and stereological methods. In KCC2 (-/-) animals, body growth impairment was observed, in part related to the seizure activity preventing normal feeding (Woo et al., 2002). However, their brains, in terms of brain weight, were less affected. Therefore, I conclude that Cl- homeostasis is not essential per se to maintain the brain weight. Four auditory nuclei (MNTB, MSO, LSO, and ventral cochlear nucleus (VCN)), were compared with respect to the KCC2 null mutation. The SOC nuclei were not influenced by the lack of KCC2 at P3 considering the morphometric parameters. A difference in the number of neurons occurred in the VCN at P3. I suggest to perform additional immunohistochemical studies of glial presence related to its involvement in the structural and functional support of the neurons and their survival. At P12, the volume of the auditory nuclei in KCC2 (-/-) animals was smaller than in (+/+) animals. However, this is likely to be an epiphenomenon since the brain weight increase was also impaired with the same magnitude. Therefore, I suppose that the Cl- homeostasis is not crucial for the nucleus volume increase in the VCN, the MNTB and the MSO during development. An exception was found for the LSO. Regarding the other morphometric parameters at P12, the four nuclei behaved in a different way: (1) in the VCN, after P3, no parameter underwent a disproportional change due to impaired Cl- homeostasis; (2) the MNTB and the LSO showed less pronounced neuropil in mutants in comparison to age-matched controls and two reasons were proposed: first, the depolarizing GABA/glycine transmission in mutants may contribute to excessive Ca2+ load, excitotoxicity and dendrite damage; second, a decrease of some trophic factors may prevent dendrite development in addition to impaired normal body growth; (3) the MSO neurons in P12 (-/-) animals had smaller soma cross-sectional area than in P12 (+/+) animals. I conclude that the normal Cl- homeostasis is required in the MSO at older ages (P12) to achieve and maintain a proper soma size; (4) the lack of KCC2 did not prevent the process of neuronal differentiation in the VCN and the MNTB during development in both mutant and control animals. In conclusion, the various auditory nuclei have to be discussed independently regarding the influence of Cl- homeostasis on some morphometric parameters. Presumably, this is related to the different time of the shift in the GABA/glycine polarity i.e., the onset of KCC2 function (Srinivasan et al., 2004a). Taken together, my thesis accumulated data about the immunohistological expression pattern of KCC2 in various auditory brain stem nuclei and the influence of impaired Cl- homeostasis on some morphometric features in these nuclei. This information will be helpful for further investigations involved to discover the mechanisms and the events that govern the inhibition and the inhibitory pathway in the central auditory system.

Fragmentation of habitats, especially of tropical rainforests, ranks globally among the most pervasive man-made disturbances of ecosystems. There is growing evidence for long-term effects of forest frag-mentation and the accompanying creation of artificial edges on ecosystem functioning and forest structure, which are altered in a way that generally transforms these forests into early successional systems. Edge-induced disruption of species interactions can be among the driving mechanisms governing this transformation. These species interactions can be direct (trophic interactions, competition, etc.) or indirect (modification of the resource availability for other organisms). Such indirect interactions are called ecosystem engineering. Leaf-cutting ants of the genus Atta are dominant herbivores and keystone-species in the Neotropics and have been called ecosystem engineers. In contrast to other prominent ecosystem engineers that have been substantially decimated by human activities some species of leaf-cutting ants profit from anthropogenic landscape alterations. Thus, leaf-cutting ants are a highly suitable model to investigate the potentially cascading effects caused by herbivores and ecosystem engineers in modern anthropogenic landscapes following fragmentation. The present thesis aims to describe this interplay between consequences of forest fragmentation for leaf-cutting ants and resulting impacts of leaf-cutting ants in fragmented forests. The cumulative thesis starts out with a review of 55 published articles demonstrating that herbivores, especially generalists, profoundly benefit from forest edges, often due to (1) favourable microenviron-mental conditions, (2) an edge-induced increase in food quantity/quality, and (3; less well documented) disrupted top-down regulation of herbivores (Wirth, Meyer et al. 2008; Progress in Botany 69:423-448). Field investigations in the heavily fragmented Atlantic Forest of Northeast Brazil (Coimbra forest) were subsequently carried out to evaluate patterns and hypotheses emerging from this review using leaf-cutting ants of the genus Atta as a model system. Colony densities of both Atta species occuring in the area changed similarly with distance to the edge but the magnitude of the effect was species-specific. Colony density of A. cephalotes was low in the forest interior (0.33 ± 1.11 /ha, pooling all zones >50 m into the forest) and sharply increased by a factor of about 8.5 towards the first 50 m (2.79 ± 3.3 /ha), while A. sexdens was more uniformly distributed (Wirth, Meyer et al. 2007; Journal of Tropical Ecology 23:501-505). The accumulation of Atta colonies persisted at physically stable forest edges over a four-year interval with no significant difference in densities between years despite high rates of colony turn-over (little less than 50% in 4 years). Stable hyper-abundant populations of leaf-cutting ants accord with the constantly high availability of pioneer plants (their preferred food source) as previously demonstrated at old stabilised forest edges in the region (Meyer et al. submitted; Biotropica). In addition, plants at the forest edge might be more attractive to leaf-cutting ants because of their physiological responses to the edge environment. In bioassays with laboratory colonies I demonstrated that drought-stressed plants are more attractive to leaf-cutting ants because of an increase in leaf nutrient content induced by osmoregulation (Meyer et al. 2006; Functional Ecology 20:973-981). Since plants along forest edges are more prone to experience drought stress, this mechanism might contribute to the high resource availabil-ity for leaf-cutting ants at forest edges. In light of the hyper-abundance of leaf-cutting ants within the forest edge zone (first 50 m), their po-tentially far-reaching ecological importance in anthropogenic landscapes is apparent. Based on previous colony-level estimates, we extrapolated that herbivory by A. cephalotes removes 36% of the available foliage at forest edges (compared to 6% in the forest interior). In addition, A. cephalotes acted as ecosys-tem engineers constructing large nests (on average 55 m2: 95%-CI: 22-136) that drastically altered forest structure. The ants opened gaps in the canopy and forest understory at nest sites, which allowed three times as much light to reach the nest surface as compared to the forest understory. This was accompa-nied by an increase in soil temperatures and a reduction in water availability. Modifications of microcli-mate and forest structure greatly surpassed previously published estimates. Since higher light levels were detectable up to about 4 m away from the nest edge, an area roughly four times as big as the actual nest (about 200 and 50 m2, respectively) was impacted by every colony, amounting to roughly 6% of the total area at the forest edge (Meyer et al. in preparation; Ecology). The hypothesized impacts of high cutting pressure and microclimatic alterations at nest sites on forest regeneration were directly tested using transplanted seedlings of six species of forest trees. Nests of A. cephalotes differentially impacted survival and growth of seedlings. Survival differed highly significantly between habitats and species and was generally high in the forest, yet low on nests where it correlated strongly with seed size of the species. These results indicate that the disturbance regime created by leaf-cutting ants differs from other distur-bances, since nest conditions select for plant species that profit from additional light, yet are large-seeded and have resprouting abilities, which are best suited to tolerate repeated defoliation on a nest (Meyer et al. in preparation; Journal of Tropical Ecology). On an ecosystem scale leaf-cutting ants might amplify edge-driven microclimatic alterations by very high rates of herbivory and the maintenance of canopy gaps above frequent nests. By allowing for an increased light penetration Atta may, ultimately, contribute to a dominating, self-replacing pioneer communities at forest edges, possibly creating a positive feed-back loop. Based on the persisting hyper-abundance of leaf-cutting ants at old edges of Coimbra forest and the multifarious impacts documented, we conclude that the ecological importance of leaf-cutting ants in pristine forests, where they are commonly believed to be keystone species despite very low colony densities, is greatly surpassed in anthropogenic landscapes In fragmented forests, Atta has been identified as an essential component of a disturbance regime that causes a post-fragmentation retrogressive succession. Apparently, these forests have reached a new self-replacing secondary state. I suggest additional human interference in form of thoughtful management in order to break this cycle of self-enhancing disturbance and to enable forest regeneration along the edges of threatened forest remnants. Thereby the situation of the forest as a whole can be ameliorated and the chances for a long-term retention of biodiversity in these landscapes increased.

Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse genetischer Veränderungen in der Familie P006 von Piperacillin-resistenten Mutanten von S. pneumoniae R6. Jede der fünf Mutanten P106 bis P506 dieser Familie wurde aus dem jeweiligen Parentalstamm auf ansteigender Konzentration des lytischen ß-Lactams Piperacillin isoliert und zeichnete sich durch eine jeweils höhere minimale Hemmkonzentration (MHK) für Piperacillin aus (Laible et al., 1987). In Mutante P106 konnte mit CpoA bereits eine Resistenzdeterminante für Piperacillin identifiziert werden, welche nicht zu den klassischen Targets der ß-Lactamantibiotika, den Penicillin-Bindeproteinen (Pbp), zählt (Grebe et al., 1997). Die Mutanten P206 und P306 zeigten aufgrund von Mutationen in Pbp2b und Pbp2x eine höhere Resistenz gegen Piperacillin (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). In dieser Arbeit standen die Identifizierung und Charakterisierung der bisher unbekannten Resistenzdeterminante für Piperacillin in Mutante P406 und die Charakterisierung der bisher nur unzulänglich untersuchten Nicht-Pbp-Resistenzdeterminante CpoA in Mutante P106 im Mittelpunkt der Analysen. Im Fall der bereits identifizierten Resistenzdeterminante in Mutante P106 handelt es sich um das für eine Glykosyltransferase kodierende Gen cpoA. Die Herstellung einer cpoA-Deletionsmutante, sowie deren Charakterisierung, sollten zur Aufklärung des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus in P106 und der Funktion von CpoA beitragen. Durch die Herstellung der cpoA-Deletionsmutante und die Bestimmung der MHK für Piperacillin konnte gezeigt werden, daß ein Ausfall der durch CpoA katalysierten Reaktion einen Anstieg der MHK für Piperacillin in S. pneumoniae R6 bewirkt. Die eingehende phänotypische Charakterisierung zeigte, daß die cpoA-Deletionsmutante zudem eine reduzierte genetische Kompetenz, eine reduzierte Säuretoleranz, einen höheren Bedarf an zweiwertigen Mg-Ionen, eine längere Generationszeit und eine verlangsamte Autolyse im Vergleich zu S. pneumoniae R6 besitzt. Diese Beobachtungen, sowie die Ergebnisse einer Microarray-basierten, globalen Transkriptomanalyse lassen es unter Berücksichtigung der biochemischen Charakterisierung von CpoA (Edman et al., 2003) als wahrscheinlich erscheinen, daß CpoA an der Synthese von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, einem der Hauptglycolipide der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae beteiligt ist. Die Deletion von cpoA könnte demzufolge auch einen Effekt auf die Menge der Lipoteichonsäuren in der Zellwand von S. pneumoniae besitzen, da der Precursor von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, das α-Monoglucosyl-Diacylglycerin vermutlich den Lipidanker der Lipoteichonsäuren darstellt. Basierend auf dieser Annahme konnte ein Modell zur Funktion von CpoA erstellt werden, welches eine Erklärung des Resistenzmechanismus für Piperacillin in Mutante P106, bzw. in der cpoA-Deletionsmutante ermöglichen würde. In Mutante P406 konnten weitere Veränderungen der Pbps bereits ausgeschlossen werden (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse aller fünf Mutanten der Familie P006 konnten Gene identifiziert werden, deren Transkripte im Vergleich zu S. pneumoniae R6 nur in P406 signifikant veränderte Mengen aufwiesen: Unter diesen Genen befanden sich sechs Gene, welche aufgrund ihrer geclusterten Anordnung im Genom von S. pneumoniae als putative funktionelle Einheit (TCS11-Cluster) angesehen wurden. Diese Gene zeigten eine bis zu 22-fach erhöhte Transkriptmenge in Mutante P406. Zudem konnten nur in Mutante P406 von Genen des an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten lic1-Operons eine bis zu 7,9-fach höhere Transkriptmenge beobachtet werden. Keines der Genprodukte des TCS11-Clusters wurde bisher charakterisiert. Aufgrund von Blast- und Domänen-Analysen konnten den Genprodukten putative Funktionen zugeschrieben werden. Die Gene smp11A und smp11B kodieren für zwei putative Membranproteine von 63 und 64 Aminosäuren. Die Gene nbp11 und msp11 kodieren für die ATPase- und die Permease-Komponente eines putativen ABC-Transporters. kin11 und reg11 kodieren für die Histidin-Kinase und den Response-Regulator des bisher uncharakterisierten Zweikomponentensystems 11 (TCS11) in S. pneumoniae. Die Gene sind in der Reihenfolge smp11A, smp11B, nbp11, msp11, kin11 und reg11 auf dem Minus-Strang im Genom von S. pneumoniae lokalisiert. Die Deletion der Gene kin11 und reg11 des TCS11 in P406 führte zum Abfall der MHK für Piperacillin auf die MHK des Parentalstamms P306. Somit konnte die Beteiligung des TCS11 in S. pneumoniae an einem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin nachgewiesen werden. Die Deletion von nbp11 in P406 führte ebenfalls zum Abfall der MHK für Piperacillin, womit einerseits auch für Nbp11 eine Beteiligung an dem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin gezeigt werden konnte und andererseits eine transkriptionelle Regulation der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 durch das TCS11 vermutet werden konnte. Durch eine konstitutive, gemeinsame Überexpression der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 in S. pneumoniae R6 wurde gezeigt, daß die Überexpression dieser Gene hinreichend für eine Erhöhung der Resistenz gegen Piperacillin ist. Durch 5´-RACE-Analysen konnten die beiden Transkriptionsstartpunkte P11.1 und P11.2 im Bereich des TCS11-Clusters kartiert werden. P11.1 befindet sich 20bp upstream von smp11A und P11.2 befindet sich 441bp upstream von kin11 innerhalb von msp11. Eine Northern-Analyse und die Durchführung von PCR auf cDNA zeigte, daß die Gene des TCS11-Clusters in zwei überlappenden Transkriptionseinheiten transkribiert werden. Die Gene kin11 und reg11 sind zusammen mit einer downstream von reg11 liegenden Kopie des repetetiven Elements rupA im 11-2-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.2 inklusive des ungewöhnlich langen Leaders von 441bp transkribiert. smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 sind im 11-1-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.1 transkribiert. Die Zugehörigkeit von kin11 und reg11 zum 11-1-Operon konnte hingegegen bei den verwendeten Wachstumsbedingungen nicht gezeigt werden. Es konnte bereits gezeigt werden, daß phosphoryliertes Reg11 (Reg11-P) an die Promotor-Region von P11.1 bindet (Marciszewski, Diplomarbeit 2007). Die Bestimmung der Aktivität von P11.1 in S. pneumoniae R6, sowie in kin11-, reg11- und kin11reg11-Deletionsmutanten zeigte, daß P11.1 einer direkten, positiven Regulation durch das TCS11 unterliegt. Durch Sequenzvergleiche der Promotor-Region von P11.1 mit den DNA-Regionen putativer Promotoren von zum TCS11-Cluster ähnlich organisierten Clustern homologer Proteine in Genomen anderer Gram-positiver Bakterien konnten drei hoch konservierte Sequenzabschnitte identifiziert werden, von welchen gezeigt werden konnte, daß sie für die Bindung von Reg11-P in S. pneumoniae essentiell sind. Vermutlich stellt die Konsensus-Sequenz ATGACA(2)TGTCAT(8-9)GTGACA die DNA-Bindestelle von Reg11-P dar. Es konnten keine weiteren, zu 100 % konservierten Sequenzen dieser Art im Genom von S. pneumoniae gefunden werden. In EMSA-Assays mit weniger konservierten Sequenzen dieser Art konnte keine Bindung von Reg11-P beobachtet werden. Somit handelt es sich bei der Bindestelle an P11.1 vermutlich um die einzige Bindestelle von Reg11-P im Genom von S. pneumoniae. Von P11.2 konnte durch die Bestimmung der Promotor-Aktivität in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters gezeigt werden, daß auch dieser Promotor einer Regulation unterliegt, welche jedoch nicht durch die Bindung von Reg11-P, oder von unphosphoryliertem Reg11 vermittelt wird. Die Aktivität von P11.2 ist hierbei jedoch einerseits Abhängig von der Anwesenheit von Kin11 und andererseits entweder von der Funktion der Membranproteine Smp11A und Smp11B, oder von der durch Nbp11/Msp11 transportierten unbekannten Substanz. Die Bestimmung der Promotor-Aktivität von P11.2 in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters und die unterschiedlichen phänotypischen Effekte einer kin11-, reg11- und einer kin11reg11-Deletionsmutante zeigten, daß unphosphoryliertes Reg11 ebenfalls in der Lage sein muß, die Transkription von noch unbekannten Zielgenen durch Bindung an eine weitere, unbekannte DNA-Bindestelle zu regulieren. Sowohl durch die Deletion eines Großteils des 441nt langen Leaders des Transkripts des 11-2-Operons, als auch durch die Deletion zweier verschiedener Abschnitte des 3´-untranslatierten Bereichs dieses Transkripts konnte gezeigt werden, daß der 5´- und der 3´-untranslatierte Bereich an noch unbekannten regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die Deletion einzelner Gene des TCS11-Clusters, sowie die gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 bewirkten die gleichen phänotypischen Effekte wie die charakterisierte cpoA-Deletionsmutante. So konnte in Wachstumsexperimenten der gleiche Einfluß auf die Generationszeit, die maximale Zelldichte und die Autolyse, wie in der cpoA-Deletionsmutante, gezeigt werden. Die Microarray-basierte Transkriptomanalyse zweier Deletionsmutanten von Genen des TCS11-Clusters zeigte zudem, daß sich infolge dieser Deletionen größtenteils die Transkriptmengen solcher Gene ändern, welche auch auf eine Deletion von cpoA reagieren. Hierzu zählen neben zahlreichen Genen für Proteine unbekannter Funktion die Gene des Kompetenzregulons, des blp-Clusters, sowie des Cholinbindeproteins PcpA und der Subtilisin-artigen Proteinase PrtA. Die in Mutante P406 beobachteten höheren Transkriptmengen von an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten Genen des lic1-Operons konnten durch die Deletion von kin11reg11 revidiert werden. Die konstitutive gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11, sowie die Bestimmung der Aktivität des Promotors P1spr1149 des lic1-Operons zeigte, daß die Transkription der Gene des lic1-Operons indirekt von der Menge an Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 abhängt. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß das TCS11-Cluster und die Glykosyltransferase CpoA an den gleichen, oder zumindest an sich beeinflussenden, Membran-assoziierten Vorgängen beteiligt sind. Folglich konnte durch die molekulargenetische Charakterisierung des in ähnlicher genetischer Organisation in Gram-positiven Bakterien weit verbreiteten TCS11-Clusters erstmals ein Hinweis auf die putative physiologische Funktion des TCS11-Clusters in S. pneumoniae erhalten werden.

Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst die genetische Kompetenz, das Lyseverhalten, die Virulenz und die Resistenz gegen Cefotaxim von S. pneumoniae. Der entscheidende Einfluss von CiaRH für S. pneumoniae zeigt sich auch darin, dass in mehreren Transkriptomstudien eine große Zahl von Genen identifiziert wurde, die in Abhängigkeit des Zwei-Komponenten Systems transkribiert werden. In dieser Arbeit konnten nun die Gene, deren Transkription direkt durch Bindung des Response Regulators CiaR in ihrem Promotorbereich reguliert wird, eindeutig definiert werden. Durch die Kombination von transkriptionellen Reportergenfusionen in dem neu konstruierten Promoter Probe Plasmid pPP2, Bandshiftassays und Mutageneseexperimenten wurde als Bindestelle von CiaR ein Direct Repeat mit der Sequenz TTTAAG-N5-TTTAAG identifiziert. Für 16 Promotoren mit dieser Bindestelle wurden eine Bindung von CiaR und eine CiaRH abhängige Expression nachgewiesen. Von den 16 Promotoren sind 15 positiv und nur einer negativ reguliert. Insgesamt besteht das CiaRH Regulon aus 30 Genen, wobei 19 Gene in 6 Operons organisiert sind. Zum CiaRH Regulon gehören ciaRH selbst, eine Vielzahl von Genen, die am Zellwandmetabolismus beteiligt sind (lic1 Operon, dlt Operon), die Gene von fünf kleinen nicht-kodierenden RNAs (ccnA-E), die Stressprotease HtrA, das Chromosomensegregationsprotein ParB, die Peptidyl-Prolyl Isomerase PpmA, die Maltoseverwertungsgene malMP, das Phosphotransferasesystem ManLMN und mehrere Gene mit unbekannter Funktion. Die eindeutige Identifizierung der Gene des Regulons des Zwei-Komponenten Systems CiaRH ermöglicht eine detaillierte Analyse der Zusammenhänge mit den cia-vermittelten Phänotypen. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde darauf eingegangen, welche Rolle die Histidinkinase CiaH spielt und woher das Phosphat für die Phosphorylierung des Response Regulators CiaR stammt. Es wurde durch Einbringen der Mutation D51A in CiaR gezeigt, dass das Aspartat an dieser Stelle des Proteins entscheidend für die Aktivität von CiaR als transkriptionellen Regulator ist. CiaH ist hingegen während des exponentiellen Wachstums in C-Medium für die Aktivität von CiaR verzichtbar. Die Promotoren des CiaRH Regulons zeigten in Abwesenheit der Kinase während dieser Wachstumsphase keine veränderte Aktivität. Die Phosphorylierung von CiaR muss daher auch über einen anderen Weg, beispielsweise über Acetylphosphat, erfolgen können. Deshalb wurde auch der Einfluss der Inaktivierung von spxB, dem Gen für eine Pyruvatoxidase, welche die Synthese eines Großteils des zellulären Acetylphosphats in S. pneumoniae katalysiert, untersucht. Eine entscheidende Rolle wurde für CiaH bei Eintritt in die stationäre Wachstumsphase beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass zu diesem Zeitpunkt nur bei vorhandenem CiaH ein Anstieg der Aktivität der Promotoren des CiaRH Regulons stattfindet. Dies deutet darauf hin, dass die Histidinkinase beim Übergang in die stationäre Phase ein Signal erhält, das die Aktivierung des CiaRH Regulons stimuliert. Möglicherweise können daraus Ansätze zur Identifizierung des bisher unbekannten Signals von CiaH entwickelt werden.

Zwölf Testpflanzen des Weinbauinstituts Freiburg wurden auf deren Resistenzeigenschaften gegenüber dem Virusvektor Xiphinema index und dem GFLV getestet. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Entwicklung eines in-vitro-Testsystems für Reben, das detaillierte Einblicke in das Wurzel-Nematoden-System erlaubt. Anhand dieses in-vitro-Testsystems konnten zwei unterschiedliche Reaktionen der Wurzeln dieser Testreben auf die Saugtätigkeit der Nematoden festgestellt werden. Es konnte sowohl eine Gallenbildung als auch eine Nekrosenbildung bei den unterschiedlichen Kreuzungen der Testpflanzen beobachtet werden. Alle Testpflanzen aus verschiedenen Kreuzungen zeigten eine Abwehrreaktion gegenüber den Nematoden. Dies resultierte in Auftreten von Transkripten der Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL) und der Bildung von Superoxid-Radikalen. Bei zwei V. rotundifolia-Hybriden war zusätzlich die Callose-Synthase aktiv und es kam außerdem zu einer Callose-Deposition an den betroffenen Stellen im Wurzelgewebe. Bis auf Testpflanze 46, einem V. rotundifolia-Hybrid waren alle getesteten Reben nach vier Wochen Versuchsdauer sensitiv für eine Transmission des GFLV. Dieser Hybrid war an den Wurzeln durch die Saugtätigkeit der Nematoden nekrosenbildend und zeigte eine Callose-Synthase-Aktivität. X. index findet seine Wirtspflanzen durch Chemotaxis. Er orientiert sich anhand von Wurzelexudaten, die von Wurzeln ins Medium abgeben werden. Totes Wurzelgewebe kann der Nematode nicht lokalisieren und stellt keinen Stimulus dar. Bei knappem Nahrungsangebot nutzt der Nematode vorhandene Nahrungsressourcen aller Rebsorten mit verschiedenster Beschaffenheit. Mit dem Pflanzenhormon Methyljasmonat behandelte Wurzeln wurden gezielt gemieden. Zwei mit dem GFLV infizierte Rebflächen an verschiedenen Standorten zeigten innerhalb dreijähriger Beobachtung eine Zunahme von virustragenden Rebstöcken. Ein Hinweis auf die Verbreitung durch virusübertragende Nematoden konnte durch Bodenproben bisher nicht bestätigt werden.

Haustoria of the rust fungus pathogen Uromyces fabae deliver RTP1 (Rust Transferred Protein1) into host plant cells. In this work, different heterologous expression systems were used to study RTP1 biological function as well as RTP1 transfer mechanism. The first part of this thesis focused on the identification of the subcellular target compartment of RTP1 in plant cells. In this respect we could identify a functional bipartite nuclear localization signal within RTP1. However, stable and transient expression studies of RTP1 in different plant species, including the host plant Vicia faba, interfered with plant cell vitality but did not result in detection of RTP1 protein. These findings led us to propose that RTP1 interferes with plant gene expression. However, the molecular basis of this interference remains unclear. By deletion studies, we could localize the active region of RTP1 within a 45 amino acid central domain. In the second part of this study, two different lines of approaches were taken to study RTP1 transfer mechanism. First, transient expression of secreted RTP1 (sRTP1) also interfered with plant cell vitality. Addition of an endoplasmic reticulum retention signal abolished sRTP1 interference with plant cell vitality, suggesting that RTP1 can reenter the plant cell from the apoplast after secretion in the absence of the pathogen. We have identified a PEST-like region within RTP1, however, contribution of this region to the stability of RTP1 is not clear. Site directed mutagenesis analysis showed that the PEST-like region is likely to play a role during the transfer of RTP1 through plant plasma membrane. In the second line of approach, we established a recombinant delivery model, using Ustilago maydis/Zea mays pathosystem, to pursue RTP1 translocation into the plant cell. Our results indicate that U. maydis is capable of secreting high amounts of recombinant RTP1, showing similar glycosylation pattern as RTP1 secreted from rust haustoria. Our data propose the use of this model system to study RTP1 domains mediating its entry into the plant cell. Haustoria of the rust fungus pathogen Uromyces fabae deliver RTP1 (Rust Transferred Protein1) into host plant cells. In this work, different heterologous expression systems were used to study RTP1 biological function as well as RTP1 transfer mechanism. The first part of this thesis focused on the identification of the subcellular target compartment of RTP1 in plant cells. In this respect we could identify a functional bipartite nuclear localization signal within RTP1. However, stable and transient expression studies of RTP1 in different plant species, including the host plant Vicia faba, interfered with plant cell vitality but did not result in detection of RTP1 protein. These findings led us to propose that RTP1 interferes with plant gene expression. However, the molecular basis of this interference remains unclear. By deletion studies, we could localize the active region of RTP1 within a 45 amino acid central domain. In the second part of this study, two different lines of approaches were taken to study RTP1 transfer mechanism. First, transient expression of secreted RTP1 (sRTP1) also interfered with plant cell vitality. Addition of an endoplasmic reticulum retention signal abolished sRTP1 interference with plant cell vitality, suggesting that RTP1 can reenter the plant cell from the apoplast after secretion in the absence of the pathogen. We have identified a PEST-like region within RTP1, however, contribution of this region to the stability of RTP1 is not clear. Site directed mutagenesis analysis showed that the PEST-like region is likely to play a role during the transfer of RTP1 through plant plasma membrane. In the second line of approach, we established a recombinant delivery model, using Ustilago maydis/Zea mays pathosystem, to pursue RTP1 translocation into the plant cell. Our results indicate that U. maydis is capable of secreting high amounts of recombinant RTP1, showing similar glycosylation pattern as RTP1 secreted from rust haustoria. Our data propose the use of this model system to study RTP1 domains mediating its entry into the plant cell.

Durch vorangegangene Arbeiten wurden transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die eine verringerte Aktivität des plastidären ATP/ADP Transporters aufweisen (NTT-antisense). Die Knollen dieser Pflanzen zeigen nicht nur veränderte Gehalte an Primärmetaboliten sondern auch eine erhöhte Pathogen-Resistenz, zum Beispiel gegen den bakteriellen Krankheitserreger Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). In diesem Zusammenhang deuten neuere Veröffentlichungen auf eine Bedeutung von Transportproteinen für Wirt-Pathogen Wechselwirkungen hin. Im Zuge dieser Arbeit konnte durch die Herstellung eines Systems zur gezielten Erzeugung von Eca „K.O.“-Mutanten die Bedeutung von ausgewählten Sequenzen, welche für Transportproteine kodieren, analysiert werden. Hierbei zeigte sich, dass im Bezug auf die Virulenz von Eca, sowohl der Prolin- als auch der d-Galaktonattransport nur von untergeordneter Bedeutung ist. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings der Karbonsäuremetabolismus und -transport von Eca als zentrales Element in der Entfaltung maximaler bakterieller Virulenz erkannt. Hierbei wurde das Cit1-Protein als hoch-affiner Citrattransporter, welcher über die bakterielle pmf energetisiert wird, identifiziert. Dieses Protein ist für ein Wachstum von Eca auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle notwendig und essentiell zur Etablierung einer vollständigen Pathogenese auf Kartoffelknollenscheibchen. So weisen Eca cit1 „K.O.“-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp Zellen nicht nur eine geringere pektolytische Aktivität und Gewebemazeration, sondern auch ein reduziertes in planta Wachstum, auf. Des Weiteren wurde ermittelt, dass sich NTT-antisense Gewebe nicht nur durch eine erhöhte Pathogen-Resistenz auszeichnet, sondern auch erniedrigte Citratgehalte aufweist. Analog führte eine artifizielle Erhöhung des Citratgehaltes durch Infiltration von Knollengewebe zu einer deutlich erhöhten Gewebemazeration durch Eca sowie einer verringerten Akkumulation von Abwehrrelevanten pflanzlichen Gentranskripten (PR-Gene). Weitere untersuchte Eca-Mutanten belegten, dass im gemeinsamen Wirken mit anderen enzymatischen Komponenten, Citrat ein ambivalentes Molekül für pflanzliche Resistenz und bakterielle Virulenz ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Transportproteine nicht nur für die Virulenz von Eca, sondern auch für phytopathogene Pilze wie Magnaporthe grisea, von Bedeutung sind. So konnte durch die Kooperation mit der AG Thines (IBWF) das Genprodukt eines bei Pathogenese induzierten Genes (rig2), biochemisch charakterisiert werden. Hierbei wurde mittels Komplementation einer Hefemutante (22∆8AA) nachgewiesen, dass es sich bei diesem Protein um einen Prolin-Transporter handelt. Diese Arbeit zeigt, dass Transportproteine als ein wichtiges Element in Wirt-Pathogen Beziehungen wirken können und eine Charakterisierung solcher Proteine zum Verständnis dieser Wechselwirkungen unerlässlich ist.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Membranproteine mit strukturellen Ähnlichkeiten zu Anion:Cation-Symportern, insbesondere zu den Transportern der NaPi1- Familie aus Tieren untersucht. Neben den bereits bekannten Anion-Transporter (ANTR) aus Arabidopsis thaliana (ROTH et al., 2004) wurde in dieser Arbeit eine homologe Proteinfamilie aus Oryza sativa identifiziert. Dabei konnte die funktionelle Verwandtschaft der Proteine AtANTR5 aus A. thaliana und OsANTR5.1 aus O. sativa mittels Komplementation der antr5-Mutante nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung der physiologischen Bedeutung des AtANTR5-Proteins in der Phosphathomöostase, im Stickstoffstoffwechsel oder bei Pathogenbefall. Mittels GFP-Fusionsexperimenten konnte für AtANTR5 eine subzelluläre Lokalisierung im Golgi-Apparat festgestellt werden. Durch AtANTR5-Promotor-GUS-Pflanzen wurde die gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des Membranproteins untersucht. AtANTR5 weist in den meisten Geweben eine sehr geringe Transkriptmenge auf und ist mittels GUS-Färbung nur in Pollen detektierbar. Dennoch ist das AtANTR5-Protein für die ganze Pflanze von essentieller Bedeutung, da eine Inaktivierung des Gen zu gravierenden phänotypischen Veränderungen, gekennzeichnet durch zwergenhaften Wuchs, eingerollten Blättern und Blattläsionen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu tierischen Phosphattransportern, wurde zunächst der Einfluss von AtANTR5 auf die Phosphathomöostase in entsprechenden „knock out“-Mutanten untersucht. Es konnte jedoch keine Veränderungen im Phosphathaushalt festgestellt werden. Vielmehr weist die antr5-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Aminosäuren, Ammonium und Salz auf. Offensichtlich ist die durch AtANTR5 Transportaktivität innerhalb des Golgi-Apparates von außerordentlichen Wichtigkeit für den pflanzlichen Stoffwechsel. Des weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen AtANTR5 und Pathogenabwehr festgestellt werden. „Northern-Blot“-Analysen zeigten eine Induktion der AtANTR5-Expression als Antwort auf Pathogenbefall durch P. syringae. Zytologische sowie histochemische Analysen haben bei antr5-Pflanzen die Ausprägung zahlreicher Abwehrmechanismen, wie Ablagerungen von Callose in den Zellwänden, Akkumulation von phenolischen Metaboliten, Salizylsäure, PR Proteinen und Wasserstoffperoxid oder Absterben der Zellen, gezeigt. Weiterhin konnte eine erhöhte Resistenz der antr5-Pflanzen gegenüber dem Befall von P. syringae ermittelt werden. Durch die Expression des NahG-Gens in antr5-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Expression der PR-Gene Salizylsäure abhängig, das spontane Absterben der Zellen jedoch Salizylsäure unabhängig war. Dieses Befund lässt den Schluss zu, dass erhöhte SA-Akkumulation und die dadurch aktivierte Abwehr, sekundäre Effekte der AtANTR5-Inaktivierung darstellen.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde Knochenmarksmaterial von 110 Leukämiepatienten auf das Vorliegen von p53-Gen-Deletionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Interphasezellkerne als auch Metaphasen der Leukämiezellen mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) mit der p53-Gen-Sonde untersucht. Dabei konnte in keinem der 55 untersuchten Patienten mit lymphatischer Leukämie eine Alleldeletion des p53-Gens nachgewiesen werden. Da die p53-Gen-Deletion nach den Literaturangaben bei etwa 7% der Patienten mit lymphatischer Leukämie vorkommt, widersprechen die eigenen Ergebnisse diesen Angaben. Als Grund kann die zu geringe Anzahl der untersuchten Fälle genannt werden. Bei den 55 hier untersuchten Patienten, die an myeloischer Leukämie erkrankt waren, konnte in 7 Fällen (13%) eine Deletion im p53-Gen mittels FISH nachgewiesen werden. Der Anteil der gefundenen p53-Gen-Deletionen war deutlich höher als aufgrund der Literaturangaben erwartet. Die sieben Patienten, bei denen eine p53-Gen-Deletion nachgewiesen wurde, waren alle an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt. Alle Patienten, die eine p53-Gen-Deletion aufwiesen, zeigten auch einen numerisch und strukturell aberranten Karyotyp. Im zweiten Arbeitsabschnitt wurden Knochenmarkszellen von 21 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen mittels spektraler Karyotypisierung (SKY) untersucht und mit dem zytogenetischen Routinebefund verglichen. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen, die durch die konventionelle zytogenetische Untersuchung nicht identifiziert werden konnten. Bei 17 (81%) der Fälle wurden durch SKY zusätzliche Chromosomenaberrationen festgestellt. Nur bei 4 (19%) der Fälle wurde der zytogenetische Befund bestätigt. Im dritten Arbeitsabschnitt wurden Meningeome untersucht. Bei 22 Meningeomen (17 benigne und 5 atypische Meningeomen) wurde mittels Interphase-FISH nach einer Alleldeletion des p53-Gens gesucht. Es konnte jedoch in keinem Fall eine solche Deletion nachgewiesen werden. Weiterhin wurden bei 24 Meningeomen 96 frische Biopsieproben von verschiedenen Tumorarealen mit G-Bänderungstechnik zytogenetisch analysiert. Zur besseren Aufklärung komplex aberranter Karyotypen wurden zwei Fälle (Nr. 1 und Nr. 7) auch mittels SKY-Analyse untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob zytogenetische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors vorliegen. Es gab bei 13 von 24 Meningeomen (54%) zytogenetische Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen innerhalb eines Tumors. 24 (83%) von 29 Meningeomen wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft und 5 (17%) von 29 Meningeomen in den Tumorgrad II. Die Tumorgradverteilung in dieser Arbeit entspricht den Literaturangaben. 13 von 24 Tumoren wiesen entweder einen normalen Karyotyp oder nur eine Monosomie 22 auf. Alle 13 Tumoren wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft. Vier Meningeome wiesen stark aberrante Karyotypen auf, was vermutlich ein Zeichen für die Tumorprogression darstellt. Es wurde auch untersucht, ob eine Korrelation zwischen dem zytogenetischen und histologischen Befunden vorliegt. In der vorliegenden Arbeit hat bei sechs Fällen der histologische Befund nicht mit dem zytogenetischen Befund übereingestimmt, da die Tumore in den Tumorgrad I eingestuft wurden, der zytogenetische Befund aber einen aberranten Chromosomensatz aufwies, der normalerweise nicht bei niedriggradigen Meningeomen, sondern bei atypischen und anaplastischen Meningeomen vorkommt. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination verschiedener zytogenetischer und molekularzytogenetischer Methoden zur Charakterisierung Chromosomaler Aberrationen bei Meningeomen sinnvoll ist.

Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der molekularen Biogeografie und der Populationsgenetik von Meum athamanticum (Apiaceae). Die Untersuchung stellt dabei die erste arealweite Phylogeografie einer europäischen temperat-montanen Pflanzenart dar. Neben der biogeografischen Struktur lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der M. athamanticum-Populationen des mitteleuropäischen Periglazialgebietes. Dadurch sollte ein Beitrag zur aktuell geführten Debatte und Theoriebildung der postglazialen Arealentwicklung temperater Arten geleistet und die Rolle des mitteleuropäischen Mittelgebirgsraums für die historische Entwicklung der Art beleuchtet werden. Auf der Basis populationsgenetischer Analysen sollten außerdem Aussagen zum Schutz der gefährdeten Art M. athamanticum getroffen werden. Für die Arbeit wurden AFLP-Untersuchungen an 173 Individuen aus 23 Populationen aus dem gesamten Verbreitungsgebiet von M. athamanticum durchgeführt. Außerdem wurden von 24 Individuen ITS- und ETS-Sequenzen erzeugt und analysiert, um Hinweise auf die ursprünglichen Evolutionsvorgänge innerhalb der Art zu erhalten. Für die feinere Auflösung des mitteleuropäischen Teilareals wurde in einem zweiten AFLP-Datensatz 210 Individuen aus 14 Populationen untersucht. Innerhalb der Art ist eine deutliche Nord-Süd-Differenzierung nachweisbar, die durch eine intermediäre Populationsgruppe in den Südwest-Alpen, die vermutlich eine sekundäre Kontaktzone repräsentiert, getrennt wird. Die starke genetische Separierung südlicher Populationen und die Existenz distinkter ITS/ETS-Haplotypen liefern Hinweise darauf, dass die Auftrennung innerhalb M. athamanticum relativ alt ist. Das wird gestützt durch die Tatsache, dass in allen drei großen geografischen Regionen Populationen mit hoher genetischer Diversität und genetisch alte Reliktpopulationen, die durch eine hohe Zahl eigener Fragmente gekennzeichnet sind, existieren. Die Ergebnisse der individuellen und populationsbezogenen Diversitätsanalysen zeigen, dass M. athamanticum sich nicht an den großräumigen Rekolonisationsvorgängen der europäischen Flora beteiligte, sondern zumindest das letzte glaziale Maximum im periglazialen Mitteleuropa überdauerte. Ein Refugialgebiet bestand wahrscheinlich im Umfeld des französischen Zentralmassivs, ein weiteres vermutlich im Randbereich von Ardennen/Eifel. Weiter gibt es Hinweise darauf, dass rund um den Gebirgsbogen des Erzgebirges und im Umfeld des Schwarzwaldes Refugien der Art gelegen haben. Und schließlich wird eine glaziale Persistenz im Bereich der Britischen Inseln postuliert. Eine Gruppe mit Populationen aus dem Thüringer Wald und dem Bayerischen Alpenvorland sind als Übergangsgruppe und sekundäre Kontaktzone zwischen den mitteleuropäischen Refugien zu deuten. Die Ergebnisse weisen auf unterschiedliche Migrationsmuster von M. athamanticum hin, die durch die topografischen Gegebenheiten in den geografischen Teilräumen geprägt sind. Im nördlichen Teilareal von M. athamanticum kam es bei einem vergleichbar wenig ausgeprägten Relief (heutige Vorkommen zwischen 200 und 1020 m ü. NN) zu geografisch weiträumigen longitudinalen und latitudinalen Migrationen, was die Bildung intramontaner Populationen und den genetischen Austausch mit benachbarten Populationen ermöglichte. Demgegenüber kam es in Südeuropa während kalter Perioden im Zuge der klimabedingten Absenkung der Vegetationszonen zu geografisch eng begrenzten, altitudinalen Wanderungsbewegungen (heutige Vorkommen zwischen 1400 und 2900 m ü. NN), womit ein genetischer Austausch zwischen benachbarten Populationen auch in den Kaltphasen eingeschränkt war. Die genetischen Merkmale (AMOVA: Differenzierung zwischen den Populationen; NJ: längere Äste; modellbasiertes Clusterverfahren: höhere Likelihood für Differenzierung; hohe Anzahl privater und fixierter privater Fragmente und isolation-by-distance der Populationen des südlichen Arealrandes (rear edge) reflektieren insgesamt Isolationsereignisse, die vermutlich bis in das Tertiär zurückreichen. Aus den Ergebnissen der arealweiten phylogeografischen Studie als auch der mitteleuropäischen populationsgenetischen Studie können Schlussfolgerungen für den Schutz von M. athamanticum gezogen werden können. Dabei werden die rear-edge-Populationen der südeuropäischen Hochgebirge, genetisch rezent verarmte Kleinpopulationen in Mitteleuropa und die genetisch diversen Populationen in allen Teilarealen als prioritär für den Erhalt der Art eingestuft.