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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Membranproteine mit strukturellen Ähnlichkeiten zu Anion:Cation-Symportern, insbesondere zu den Transportern der NaPi1- Familie aus Tieren untersucht. Neben den bereits bekannten Anion-Transporter (ANTR) aus Arabidopsis thaliana (ROTH et al., 2004) wurde in dieser Arbeit eine homologe Proteinfamilie aus Oryza sativa identifiziert. Dabei konnte die funktionelle Verwandtschaft der Proteine AtANTR5 aus A. thaliana und OsANTR5.1 aus O. sativa mittels Komplementation der antr5-Mutante nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung der physiologischen Bedeutung des AtANTR5-Proteins in der Phosphathomöostase, im Stickstoffstoffwechsel oder bei Pathogenbefall. Mittels GFP-Fusionsexperimenten konnte für AtANTR5 eine subzelluläre Lokalisierung im Golgi-Apparat festgestellt werden. Durch AtANTR5-Promotor-GUS-Pflanzen wurde die gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des Membranproteins untersucht. AtANTR5 weist in den meisten Geweben eine sehr geringe Transkriptmenge auf und ist mittels GUS-Färbung nur in Pollen detektierbar. Dennoch ist das AtANTR5-Protein für die ganze Pflanze von essentieller Bedeutung, da eine Inaktivierung des Gen zu gravierenden phänotypischen Veränderungen, gekennzeichnet durch zwergenhaften Wuchs, eingerollten Blättern und Blattläsionen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu tierischen Phosphattransportern, wurde zunächst der Einfluss von AtANTR5 auf die Phosphathomöostase in entsprechenden „knock out“-Mutanten untersucht. Es konnte jedoch keine Veränderungen im Phosphathaushalt festgestellt werden. Vielmehr weist die antr5-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Aminosäuren, Ammonium und Salz auf. Offensichtlich ist die durch AtANTR5 Transportaktivität innerhalb des Golgi-Apparates von außerordentlichen Wichtigkeit für den pflanzlichen Stoffwechsel. Des weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen AtANTR5 und Pathogenabwehr festgestellt werden. „Northern-Blot“-Analysen zeigten eine Induktion der AtANTR5-Expression als Antwort auf Pathogenbefall durch P. syringae. Zytologische sowie histochemische Analysen haben bei antr5-Pflanzen die Ausprägung zahlreicher Abwehrmechanismen, wie Ablagerungen von Callose in den Zellwänden, Akkumulation von phenolischen Metaboliten, Salizylsäure, PR Proteinen und Wasserstoffperoxid oder Absterben der Zellen, gezeigt. Weiterhin konnte eine erhöhte Resistenz der antr5-Pflanzen gegenüber dem Befall von P. syringae ermittelt werden. Durch die Expression des NahG-Gens in antr5-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Expression der PR-Gene Salizylsäure abhängig, das spontane Absterben der Zellen jedoch Salizylsäure unabhängig war. Dieses Befund lässt den Schluss zu, dass erhöhte SA-Akkumulation und die dadurch aktivierte Abwehr, sekundäre Effekte der AtANTR5-Inaktivierung darstellen.
Bei dem in dieser Arbeit untersuchten Antibiotikum Vancoresmycin handelt es sich um ein neuartiges Tetramsäurederivat, das aus der Fermentationsbrühe des Aktinomyceten Amycolatopsis vancoresmycina gewonnen wurde. Da der Wirkungsmechanismus und mögliche Resistenzmechanismen unbekannt sind, soll diese Arbeit zu deren Aufklärung beitragen. Dazu wurden verschiedene Determinanten für die Resistenz gegen Vancoresmycin in Streptococcus pneumoniae R6 analysiert. Zuerst wurden acht vancoresmycinresistente Labormutanten von Streptococcus pneumoniae R6 bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml Vancoresmycin isoliert und phänotypisch charakterisiert. Es konnte eine bakteriolytische Wirkung von Vancoresmycin auf S. pneumoniae gezeigt werden. Zur Identifizierung genetischer Resistenzdeterminanten wurden verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden Genbanken von der Mutante aR6 erstellt und nach der resistenzvermittelnden DNA-Sequenz durch Transformation des sensitiven Rezipienten S. pneumoniae R6 gesucht. Zum anderen wurden die Transkriptome der Mutanten aR6, eR6, fR6 und gR6 mit dem des Referenzstammes R6 durch mikroarraybasierte Studien verglichen, um Transkriptmengenunterschiede zu detektieren. Durch das Screening der Genbanken konnten zwei Determinanten identifiziert werden, deren Funktionen durch Insertion des IS10-R-Elementes eingeschränkt waren. Dabei handelte es sich um das Gen rpsI, das für das kleine ribosomale Protein S9 codiert, und um das Gen dexS, das für eine Dextranglucosidase codiert. Der Stamm R6-rpsI::IS10-R zeichnete sich durch ein verlangsamtes Wachstum aus, was zu der beobachteten erhöhten Vancoresmycinresistenz beitragen könnte. Für das Gen dexS konnte eine direkte Beteiligung an der Resistenz gegenüber Vancoresmycin nicht nachgewiesen werden. Durch einen Transkriptomvergleich der Mutanten aR6, eR6 und fR6 mit dem Referenzstamm R6 wurde festgestellt, dass die Transkriptmengen des Genes copY, das für einen Transkriptionsrepressor codiert, und der Gene eines Cyl-Operons, deren Genprodukte vermutlich an der Bildung, Modifikation und Sezernierung eines Cytolysins beteiligt sind, in den Mutanten aR6, eR6 und fR6 erhöht waren. Mit Hilfe ausführlicher Analysen wurde nachgewiesen, dass sowohl das Gen copY als auch die Gene des Cyl-Operons nicht direkt an einer Resistenz gegenüber Vancoresmycin beteiligt sind. Im Transkriptom der Mutante gR6 fielen zwei Gene (spr0812 = abcA und spr0813 = abcB), die für einen ABC-Transporter codieren, durch erhöhte Transkriptmengen im Vergleich zu den entsprechenden Transkriptmengen des Referenzstammes R6 auf. Die Funktion dieses ABC-Transporters bei der Resistenz gegenüber Vancoresmycin wurde detailliert analysiert, da ein Aminosäureaustausch im C-terminalen Ende der Permeaseuntereinheit AbcB in der Mutante gR6 identifiziert wurde (Gln581 ® Stop). Durch Transformation des Rezipienten R6 mit der entsprechenden DNA-Sequenz konnte für die Transformanten (gTR) eine erhöhte Vancoresmycinresistenz gezeigt werden. Außerdem konnte durch Deletion des ABC-Transporter-Operons in der Mutante gR6 eine MHK-Erniedrigung auf das Ausgangsniveau des Referenzstammes R6 herbeigeführt werden. Die im Transkriptom der Mutante gR6 detektierten erhöhten Transkriptmengen der Gene abcA und abcB wurden durch quantitative Real-Time-PCR verifiziert. In der Transformante gTR wurden ebenfalls erhöhte Transkriptmengen der Gene abcA und abcB nachgewiesen. Sowohl in der Mutante gR6 als auch in der Transformante gTR waren die Transkriptmengen der Gene abcA und abcB etwa um das Sechsfache im Vergleich zu den jeweiligen Transkriptmengen des Referenzstammes R6 erhöht. Um die Ursache der erhöhten Transkriptmengen aufzuklären, wurde die Promotoraktivität des ABC-Transporter-Operons in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR mit Hilfe von lacZ- Reporterfusionskonstrukten analysiert. Die Promotoraktivitäten in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR unterschieden sich nicht von der des Referenzstammes R6. Dieses Resultat lässt vermuten, dass die erhöhten Transkriptmengen der Gene abcA und abcB nicht auf eine gesteigerte Promotoraktivität zurückgeführt werden können, sondern dass die Stabilität der Transkripte durch die Nonsensemutation in der Mutante gR6 und in der Transformante gTR erhöht war. In der Literatur werden homologe ABC-Transporter aus Bacillus subtilis bzw. S. mutans beschrieben, die in eine Resistenz gegenüber Bacitracin involviert sind (Ohki et al., 2003; Tsuda et al., 2002). Aufgrund dessen wurde eine Beteiligung des hier untersuchten ABC-Transporters an einer Bacitracinresistenz überprüft. Mit Hilfe einer MHK-Bestimmung für Bacitracin wurde ein fünffach erniedrigter MHK-Wert für die Mutante gR6 und für die Transformante gTR im Vergleich zum Referenzstamm R6 festgestellt. Das bedeutet, dass der mutierte ABC-Transporter der Mutante gR6 sowohl in eine erhöhte Resistenz gegenüber Vancoresmycin als auch in eine erhöhte Sensitivität gegenüber Bacitracin involviert ist.
Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.