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Polychlorierte Biphenyle (PCBs) gehören zu den persistenten organischen Kontaminanten (eng. Persistent Organic Pollutants, POPs). Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften wurden die PCBs vielseitig in der Industrie eingesetzt. Jedoch reicherten sich die persistenten Stoffe in der Umwelt an und gelangten so in die Nahrungskette. Daher ist die Hauptexpositionsquelle für den Menschen die Nahrung, insbesondere fetthaltige Nahrung wie Fisch- und Fleischprodukte. Die 209 PCB-Kongenere können in zwei Gruppen unterteilt werden. Die dioxin-artigen PCBs (DL-PCBs) bilden eine kleine Gruppe von 12 PCBs, die strukturelle und toxikologische Gemeinsamkeiten mit Dioxinen, wie z.B. dem 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin haben. Die nicht dioxin-artigen PCBs (NDL-PCBs) stellen den Rest der 209 Kongenere dar. Sie sind toxikologisch noch wenig charakterisiert, obwohl sie 90% der PCBs repräsentieren, die als Kontaminanten in Lebensmitteln vorkommen. Das Ziel der Arbeit war es die Effekte von ausgewählte NDL-PCBs auf fremdstoffmetabolisierender Leberenzyme, wie die Cytochrome P450 Monooxygenasen (CYP) und die UDP-Glucuronocyltransferasen (UGT), zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hochreine NDL-PCBs verwendet, die geringe dioxin-artige Verunreinigungen aufwiesen. In einer subakuten Studie wurden adulte Sprague-Dawley Ratten mit in Maiskeimöl gelöstem NDL-PCB 52 oder NDL-PCB 180 wiederholt per Schlundsonde behandelt. Die Gesamtdosen betrugen 0 bis 3000 mg/kg KG bei NDL-PCB 52 und 0 bis 1700 mg/kg KG bei NDL-PCB 180. Die Behandlungsdauer betrug 28 Tage. Auf Gen- und Proteinebene wurde keine Induktion von CYP1A1, CYP1A2 und CYP1B1 in der Leber festgestellt. Die CYP2B1-Expression hingegen wurde von beiden PCBs auf Gen- und Proteinebene induziert, wobei NDL-PCB 180 potenter schien. CYP3A1, UGT1A1 und UGT 1A6 wurde nur durch NDL-PCB 180 auf Gen- und Proteinebene induziert. Außerdem induzierten beide Kongenere die katalytische CYP2B1-Aktivität (PROD-Aktivität), wobei wiederum NDL-PCB 180 eine höhere Induktion verursachte. Es konnte auch nur für dieses PCB ein EC50-Wert der PROD-Aktivität von 34,5 ± 4,2 mg/kg KG für männliche und 120 ± 46,7 mg/kg KG für weibliche Tiere ermittelt werden. Die katalytische CYP1-Aktivität (EROD-Aktivität) wurde auch durch beide PCBs induziert, wobei bei NDL-PCB 52 nur bei den Männchen die Aktivität anstieg. In einer perinatal Studie wurden trächtige Spraque-Dawley Ratten mit NDL-PCBs 52 und 180 behandelt. Die Gesamtdosen betrugen 0 bis 3000 mg/kg KG bei NDL-PCB 52 bei NDL-PCB 180 0 bis 1000 mg/kg KG. Die Jungtiere wurden jeweils 7, 35 und 84 Tage nach der Geburt (PND) getötet. NDL-PCB 52 induzierte in keiner Gruppe die EROD-Aktivität. Die PROD-Aktivität wurde nur in der PND7-Gruppe in beiden Geschlechtern induziert. NDL-PCB 180 induzierte die EROD-Aktivität bei der PND7-Gruppe nur in der höchsten Gesamtdosis. Die PROD-Aktivität wurde jedoch konzentrations- und zeitabhängig induziert. In einer Maus-Studie wurden sechs NDL-PCBs (28, 52, 101, 138, 153, 180) und das DL-PCB 126 gestestet. Mit niedrigen Dosen (20 mg/kg KG bei NDL-PCBs, 200 µg/kg KG bei DL-PCB) sollten kurzfristige (1 Tag), mittelfristige (5 Tage) und subakute (28 Tage) Effekte auf Leberenzyme bestimmt werden. Das relative Lebergewicht wurde durch die Behandlung mit NDL-PCB 28 und DL-PCB 126 nach 5 und 28 Tagen erhöht und durch NDL-PCB 153 nach 28 Tagen. Die CYP1A1-Genexpression wurde nur durch DL-PCB 126 induziert. Die CYP2B10-Genexpression wurde in jeder Behandlungsgruppe durch die NDL-PCBs erhöht, mit der Ausnahme von NDL-PCB 28 und DL-PCB 126. Die PROD-Aktivität wurde nach 28 Tagen durch alle PCBs erhöht, nach 5 Tagen verursachte nur NDL-PCB 28 keine Induktion. Bei der 1 Tag-Studie wurde die Aktivität nur durch hochchlorierte PCBs 126, 153 und 180 induziert. Die EROD-Aktivität wurde durch DL-PCB 126 sehr hoch induziert. Erst nach 28 Tagen verursachten die andere PCBs ein Erhöhung der Aktivität. Bei in vitro-Versuchen mit transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2) wurden 20 PCBs getestet. Nach einer 48 stündigen Inkubationszeit vermochte nur DL-PCB 126 das transient transfizierte XRE (Xenobiotic Responsive Element) zu induizieren. Außerdem wurden auch die humanen PBREM/CAR (Phenobarbital Responsive Enhancer Module/Constitutive Androstane Receptor) und XREM (Xenobiotic Responsive Enhancer Module) transient resp. stabil transfiziert. Es zeigte sich, dass die Induktion vom Chlorierungsgrad abhing. Die fünf- und siebenfach chlorierten PCBs induzierten beide, wogegen vier und sechsfach chlorierte eher PBREM/CAR induzierten. Es konnte gezeigt werden, dass die große Gruppe der NDL-PCBs bezüglich ihrer Wirkung keine homogene Gruppe bilden. Bei den Tierversuchen scheinen die hochchlorierten PCBs Mixtyp-Induktoren zu sein, wogegen die niedrigchlorierten eher CYP2B induzierten oder kein Effekt bewirkten. In vitro bestätigte sich, dass der Chlorierungsgrad bei der Induktion der Gene eine wichtige Rolle spielt.
Die RNAi–Methode spielt eine grosse Rolle in der Wirkstoffentwicklung bei der Validierung eines pharmakologischen Ziels. Die Anwendbarkeit in der Toxikologie wurde noch nicht systematisch untersucht. Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluierung der RNAi-Methode für mechanistisch-toxikologische Studien und den Einfluss von posttranskriptioneller Genunterdrückung auf biochemisch-zelluläre Endpunkte zu zeigen. Die siRNAs wurden mit Hilfe eines computerunterstützten Algorithmus ausgewählt. Effiziente und reproduzierbare Einschleusung der siRNA in vitro wurde durch Elektroporation erreicht. Die molekulare Reduktion der Expression des Zielgens wurde auf mRNA- und Proteinexpressionslevel oder auf Proteinaktivitätsebene zwischen 24 und 144 Stunden nach Behandlung überwacht. Die siRNAs wurden in vitro getestet bevor sie in vivo angewandt wurden. Als Methode zum Erreichen der Leber in vivo wurde die intraperitoneale Gabe von siRNAs gegenüber hydrodynamischer Injektion in die Schwanzvene evaluiert. Auf folgenden Enzyme wurde mit RNAi in der Zellkultur abgezielt: ATP-Synthase in HepG2, Farnesylpyrophosphat-Synthase (FPPS) in humanen Nierenzellen (HK-2) und Caspase-3 in Primärhepatozyten der Ratte. In allen Experimenten war RNAi in der Lage, das mRNA- und Proteinexpressions- oder Proteinaktivitäts-Niveau zu reduzieren, wodurch die erfolgreiche Genunterdrückung gezeigt werden konnte. Die Unterdrückung der mitochondrialen ATP- Synthase β-Untereinheit hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Überlebensrate und den Energiestoffwechsel von HepG2-Zellen. Obwohl Oligomycin B-Behandlung zu ATP- Depletion und Verlust des mitochondiralen Membranpotentials führte, war keine Sensitivierung der Zellen gegenüber Oligomycin B- oder Diclofenac-induzierten Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials oder Zytotoxizität zu beobachten. Die Genunterdrückung der ATP-Synthase in HepG2-Zellen führte zu einer ähnlichen transkriptionellen Signatur wie Diclofenac-Behandlung in vivo, so dass eine mögliche Verbindung zwischen ATP-Synthase und Hepcidin, BiP und ALAS-1 durch Koregulation nahegelegt wird. Die Genunterdrückung von FPPS führte zu tendenziell erhöhter Zytotoxizität von Zoledronsäure, hatte aber keinen Einfluss auf den Prenylierungsstatus der kleinen GTPasen. Der Caspase-3/7-Inhibitor Ac-DEVD-CHO verhinderte SDZ IMM125-vermittelte Apoptose. Spezifische Genunterdrückung von Caspase-3 führte zur Reduktion der SDZ IMM125-induzierten Caspaseaktivität, während die Unterdrückung von Caspase-7 in dieser Hinsicht keinen Einfluss hatte. Die Effektschwelle des Genunterdrückung wurde durch Vergleich zwischen Caspase-3-silencing und Behandlung mit dem chemischen Caspase-Inhibitor Ac-DEVD-CHO auf Ebene der Caspase-3-Aktivität und der zytoprotektiven Wirksamkeit bestimmt. Der Effekt von Caspase-3-Unterdrückung war equivalent zur Wirkung von 1 μM Inhibitor. Die inhibitorvermittelte Schutzwirkung im Hinblick auf die Zytotoxizität wurde ausschliesslich bei höheren Inhibitorkonzentrationen erreicht, wodurch gezeigt wurde, dass die erreichte Genunterdrückung für zytoprotektive Wirkungen nicht ausreichend war. SiRNAs haben verglichen mit Enzyminhibitoren generell eine höhere Spezifität. Chemische Inhibitoren sind weniger spezifisch und können enzymatische Aktivitäten vollständig, in manchen Fällen irreversibel und schnell beeinflussen, so dass sie direkten Einfluss auf die zu untersuchenden Signalwege haben. SiRNAs unterscheiden sich in dieser Hinsicht, da die Abnahme des Proteins nicht vollständig, nur transient und langsam über eine Periode hinweg erfolgt, innerhalb welcher sich die Zellen durch kompensatorische Mechanismen anpassen und Primäreffekte maskiert werden können. Hydrodynamische Einschleusung von nicht-komplexierter siRNA in die Leber von CD-1-Mäusen war möglich und reduzierte die CYP2E1-Proteinexpression signifikant. Ein- oder mehrfache hochdosierte intraperitoneale Gabe von siRNA führte weder auf mRNA- noch auf Proteinebene zu signifikanten Effekten. Weitere Untersuchungen im Hinblick auf Stabilität und effiziente Einschleusung von siRNAs ist unvermeidlich, bevor siRNAs in vivo in der mechanistischen Toxikologie angewandt werden können. Zusammenfassend kann ausgesagt werden, dass die Anwendung von siRNAs in vitro eine universelle und spezifische Methode darstellt, welche in vielen mechanistisch-toxikologischen Studien als Werkzeug zur Signalweganalyse und zur Validierung von Zielproteinen eingesetzt werden kann. Die Stärke der enzymatischen Inhibition, die mit Hilfe eines chemischen Inhibitors erreicht werden kann, ist durch siRNA-vermittelte Genunterdrückung nicht zu erreichen. Genunterdrückung in vivo kann erreicht werden, doch die invasive hydrodynamische Methode ist nicht geeignet für Toxizitätsprüfungen im Tier. Die Einschleusung von siRNA in spezifische Zielorgane benötigt signifikante Verbesserung.
Ochratoxin A (OTA) ist ein nierentoxisches und -kanzerogenes Mykotoxin, das von verschiedenen Aspergillus- und Penicillium-Stämmen gebildet wird. Kontaminationen mit OTA sind vor allem in pflanzlichen Produkten wie Getreide und Getreideprodukte, Kaffee, Traubensaft und Wein, Bier, Nüsse, Gewürze aber auch in Fleisch nachweisbar. Verbraucher nehmen in Deutschland wöchentlich ca. 5 ng/kg KG OTA auf. In subakuten und subchronischen Studien wurde ausgeprägte Nierentoxizität gezeigt, zudem ist OTA als immunsuppressiv, teratogen, neurotoxisch und hepatokanzerogen beschrieben. Eine Beteiligung von OTA an der beim Menschen auftretenden endemischen Balkannephropathie (BEN) wird diskutiert. Der Mechanismus der kanzerogenen Wirkung von OTA ist noch immer unklar. Die in Studien zur Genotoxizität erhaltenen, widersprüchliche Resultate könnten möglicherweise auf sekundäre Mechanismen wie oxidativem Stress zurückzuführen sein. Die Generierung reaktiver Sauerstoffspezies und die Induktion von Lipidperoxidation wurde beobachtet, eine Reihe toxischer Effekte in vitro und in vivo war durch Gabe von Antioxidantien abgeschwächt. Mit verschiedenen Endpunkten (Nekrose, Wachstumshemmung, Apoptose) wurde in Zelllinien (V79, CV-1) und in primären proximalen Tubuluszellen der Ratte (PNZ) die Induktion von Zytotoxizität durch OTA untersucht. OTA zeigte in Kurzzeitinkubations-Experimenten (1 h) kein Potenzial, die Viabilität von Zelllinien und PNZ zu verringern. Nach 24stündiger Inkubation war nur in V79-Zellen die Membranintegrität (Trypanblauausschluss) beeinträchtigt. Eine starke Wachstumshemmung mit IC50-Werten um 2 µmol/L wurde in beiden verwendeten Zelllinien gemessen. Mittels eines immunchemischen Tests und der Durchflusszytometrie wurde bei Konzentrationen über 1 µmol/L OTA (24 h) die Induktion von Apoptose beobachtet. Die in CV-1-Zellen beobachteten Parameter für Zytotoxizität, insbesondere die durchflusszytometrischen Untersuchungen, zeigten, dass die Effekte in einem relativ eng begrenzten, µmolaren Konzentrationsbereich zu beobachten sind, also möglicherweise nicht spezifisch Nekrose oder Apoptose induziert wird. Zu den Mechanismen, über die unspezifisch Nekrose und Apoptose in Zellen induziert werden kann, gehören z.B. oxidativer Stress und DNA-Schädigung. Mit Hilfe des Comet-Assays wurde in den Zelllinien und PNZ die Induktion von (oxidativen) DNA-Schäden durch OTA untersucht. Die DNA-Basisschädigung war nur nach Kurzzeitinkubation (1h) mit sehr hohen OTA-Konzentrationen (> 500 µmol/L) in den Zelllinien bzw. nach 24 h in V79-Zellen erhöht. FPG-sensitive Stellen in der DNA wurden in allen verwendeten in vitro-Testsystemen nachgewiesen. Nach einstündiger Inkubation waren PNZ deutlich sensitiver gegenüber der Induktion von oxidativen DNA-Schäden (ca. Faktor 20) als die Zelllinien. Dies deutet darauf hin, dass die PNZ im Vergleich zu den Zelllinien stoffwechselbedingte Besonderheiten aufweisen, die die erhöhte Sensitivität bedingen. Nach 24stündiger Inkubation mit OTA lagen die Konzentrationen, die in den Zelllinien und den PNZ oxidative DNA-Schäden induzierten in einem vergleichbaren µmolaren Bereich. Der Verlust der erhöhten Sensitivität der PNZ könnte auf eine Umstellung des Stoffwechsels nach der insgesamt 48stündigen Kultivierung zurückzuführen sein. Das gemeinsame Auftreten von oxidativem Stress, Nierentoxizität und Zellproliferation könnten evtl. einen alternativen Mechanismus der Nierenkanzerogenität von OTA bilden. In Kooperation mit Dr. Turesky (NCTR, Jefferson, USA) wurde ein Tierversuch durchgeführt, in dem das DNA-schädigende Potenzial von OTA in Leber und Niere von Ratten, die über vier Wochen mit OTA behandelt worden waren, untersucht wurde. Die mit dem Comet-Assay in den Organen dieser Tiere gefundenen oxidativen DNA-Schäden, die grundsätzlich als prämutagenes Ereignis angesehen werden können, geben also möglicherweise einen ersten mechanistischen Hinweis auf die nierenkanzerogene Wirkung von OTA. Untermauert wird dies durch die beobachtete Abnahme des GSH-Gehaltes, die evtl. auf eine Depletion durch LPO-Produkte zurückzuführen ist. Nach 24stündiger Inkubation wurde eine Erhöhung des GSH-Gehaltes in den inkubierten CV-1-Zellen gemessen, die mit einer GSH-Neusynthese als Gegenreaktion zum oxidativen Stress begründet werden kann. Die in vitro Untersuchungen zeigen, dass die Konzentrationen, die in den Zellen oxidative DNA-Schäden verursachen, etwas niedriger sind (Faktor 5), als die Konzentrationen, die zytotoxische Effekte induzieren. Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass OTA über die Bildung oxidativer DNA-Schäden auch initiierendes Potenzial besitzt. In diesem Zusammenhang wäre zu klären, ob die in der Literatur beschriebene Proteinbiosynthesehemmung sich auf die antioxidative Abwehr in Zellen und Organismen auswirkt, so dass induzierte oxidative DNA-Schäden möglicherweise nicht mehr ausreichend repariert werden können und es so zur Tumorentstehung in vivo kommt.