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Epidemiologische Studien geben Hinweise, dass eine obst- und gemüsereiche Kost präventiv gegen verschiedene ROS-assoziierte Krankheiten wirksam ist. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung von Nahrungsmitteln ist schwer zu erfassen, welche Inhaltsstoffe für die Wirksamkeit maßgeblich sind. Phenolische Apfelsaftextrakte (AEs) aus Säften unterschiedlicher Apfelsorten und ein Tresterextrakt (APE03) wurden auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Darmzellen untersucht. Ein zweistufiges Inkubationsprotokoll kam in humanen Kolonzelllinien (Caco-2, HT29) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Die Apfelsaftextrakte wurden im Vergleich zu als Antioxidanzien beschriebenen Saftinhaltsstoffen (Rutin, Phloridzin, Epicatechin, Kaffeesäure, Chlorogensäure) und zu entsprechenden rekonstituierten Mischungen (rAEs) geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level und Glutathionspiegel. Zusätzlich wurden antioxidative Kapazität und die Stabilität der Einzelstoffe unter Inkubationsbedingungen erfasst. Die Apfelsaftextrakte zeigten eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (3.6-4.2 mM Trolox), der Tresterextrakt APE03 war dabei wirksamer als die drei Saftextrakte. Die höheren TEAC-Werte der entsprechenden rAEs (4.7-7.3 mM Trolox) deuten auf eine zentrale Rolle der Einzelstoffe in der Mischung hin. Der zelluläre ROS-Level wurde durch die Extrakte AE01, AE02 und APE03 (1-100 µg/mL) und rAEs (0.5-50 µg/mL) in beiden Zelllinien signifikant verringert. AE04 war nur in HT29 Zellen wirksam. Oxidative DNA-Schäden in Caco-2 Zellen wurden durch die Extrakte (50-100 µg/mL) und deutlicher durch die rekonstituierten Mischungen (1 µg/mL) von AE01 und APE03 verringert. Von den Saftinhaltsstoffen zeigten Kaffeesäure und Rutin das höchste Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden; der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch Kaffeesäure und Chlorogensäure verringert. Der Glutathionspiegel von Caco-2 Zellen wurde durch AE02 und APE03 sowie durch Kaffeesäure, nicht jedoch durch andere Einzelstoffe oder Mischungen erhöht. Die Aglyka Quercetin und Phloretin, die aus Glykosiden im Intestinaltrakt freigesetzt werden können, wiesen in allen Endpunkten die höchste Wirksamkeit auf. Humane primäre Kolonzellen erwiesen sich in den Untersuchungen als ein weniger geeignetes Modellsystem, möglicherweise aufgrund der Art der gewählten Inkubation. Insgesamt erwiesen sich die phenolischen Apfelsaftextrakte als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzelllinien. Mit den begleitenden Untersuchungen von Mischungen und Einzelstoffen wurden Polyphenole (Kaffeesäure, Rutin, Chlorogensäure) identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Saftextrakte beitragen. Der gewählte in vitro-Prüfansatz erwies sich dabei als geeignet zur Charakterisierung der antioxidativen Wirksamkeit von Apfelsaftinhaltsstoffen in Darmzellen. Die antioxidative Wirksamkeit kann nicht alleine auf die untersuchten Hauptkomponenten zurückgeführt werden. Es liegt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/ Substanzgruppen ebenfalls einen Beitrag an der antioxidativen Wirksamkeit leisten. Eine möglichst umfassende Charaktersisierung von Apfelsaftinhaltsstoffen ist notwendig, gerade im Hinblick auf eine mögliche Prävention von Darmerkrankungen durch die Aufnahme von Apfelsaft.
Flavonoide des Apfels: Transport in Caco-2-Kolonzellen und Einfluss auf den Fremdstoffmetabolismus
(2005)
In Tierexperimenten wurde eine antikanzerogene Wirkung von Flavonoiden gegenüber Brust-, Dickdarm-, Magen, sowie Lungenkrebs festgestellt. [Boyer, 2004] Da der Krebsentstehung multifaktorielle Prozesse zu Grunde liegen, werden verschiedene Mechanismen diskutiert wie Flavonoide protektiv eingreifen können. Die genaue biologische Wirkung der Nahrungskomponenten und der humantherapeutische Nutzen ist aber weitgehend ungeklärt. Deshalb wurden in dieser Arbeit Flavonoide des Apfels auf die Wirkung des Fremdstoffmetabolismus im Kolon untersucht. Ziel dieser Arbeit war es Apfelsaftextrakt, der aus Äpfeln 2002 gewonnen wurde und ausgewählte Flavonoide, die in diesem Apfelsaft vorkommen auf ihre Wirkung auf den Fremdstoffmetabolismus und ihre Aufnahme in die Enterozyten zu untersuchen. In den Zytotxizitätsassays MTT-Test und Alamar-BlueTM-Test zeigten sowohl der Apfelsaftextrakt als auch die einzelnen Substanzen einen signifikanten, konzentrationsabhängigen Effekt. Vor allem das Disaccharid Rutin zeigt schon in geringen Konzentrationen starke zytotoxische Effekte. Diese könnte daran liegen, dass Rutin wie in den Transportassays gesehen sehr schlecht in die Zellen gelangt und deshalb im Medium stärker oxidiert werden kann, als die anderen Stoffe. Das Enzym CYP1A1 wurde durch den Apfelsaftextrakt und die Flavonoide Quercetin und Phloridzin leicht induziert. Dieser Effekt konnte auf mRNA, Proteinebene und bei der Aktivitätsmessung beobachtet werden. Diese Effekte sind im Vergleich zum potenten Induktor TCDD sehr gering, so dass diese für die in vivo-Situation nicht von belang sind. Sehr viel größer als die agonistische ist die antagonistische Wirkung von den Aglyka Quercetin, Phloretin und auch vom Apfelsaftextrakt. Diese Effekte konnten auch auf mRNA, Proteinebene und bei der Aktivitätsmessung des Enzyms gemessen werden. Quercetin zeigte sich als so starker Inhibitor, es konnte die TCDD-induzierte CYP1A1-Aktivität sogar um 99% bei einer Konzentration von 50µM im EROD-Assay zurückdrängen, wodurch die Flavonoide protektiv in die Krebsentstehung eingreifen können. Quercetin, Phloretin und der Apfelsaftextrakt AS02 erweisen sich als starke Antagonisten. Damit können Flavonoide des Apfels die metabolische Aktivierung chemischer Kanzerogene wie z. B. Benzo[a]pyren oder herterocyclischer, aromatischer Amine hemmen und eventuell auf diese Weise zur Verminderung des Darmkrebsrisikos beitragen.Interaktionen zwischen Flavonoiden und Fremdstofftransportern werden als möglicher Mechanismus diskutiert, der von großer Relevanz für den Einsatz von Flavonoiden als krebspräventative Stoffe. Mehrere Flavonoide wurden in den letzten Jahren gefunden, die den MRP-vermittelten Stofftransport in Tumorzellen modulieren können [Hooijberg, 1997]. MRP2 ist ein weiteres Enzym, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden. Es kann durch Quercetin und den Apfelsaftextrakt signifikant und konzentrations-abhängig in der Real Time PCR und auch im Western Blot induziert werden. Diese Induktion könnte an der Aktivierung des sogenannten Antioxidant Response Element liegen. ARE kann durch redox-aktive Substanzen aktiviert werden und kann die Induktion von Enzymen wie die NADPH Chinonoxidoreduktase, GSH, UGT1A6 und auch MRP2 bewirken. Die Induktion von MRP2 beruht wahrscheinlich auf der Redox-Aktivität der 3‘,4‘-Catechol-Struktur des Quercetins. Die Wirkung des Apfelsaftextraktes könnte an dem im Extrakt enthaltenen Quercetin und seinen Glykosiden, die durch die LPH und Glukosidasen in der Zelle in Quercetin gespalten werden können, liegen. Die Induktion des MRP2-Transporters hat einen Einfluß auf die intestinale Entgiftung und die Verteilung von Xenobiotika in den Darmkrebszellen. Zellschädigende Stoffe können so schneller aus der Zelle herausgeschleust werden und können nicht mehr toxisch wirken, ein chemopräventativer Effekt tritt ein. In Transportassays sollte die Aufnahme der Polyphenole in die Zellen untersucht werden. Bei den Substanzen war eine erleichterte Diffusion oder ein aktiver Transport nicht zu erwarten, was durch die Papp-Werte bestätigt wird. Quercetin gelangt wohl durch passive Diffusion in die Zellen, genau wie Phloretin, wobei Quercetin besser in die Zellen gelangt. Phloridzin gelangt schlechter in die Zellen hinein, allerdings kann man im UV-Spektrum eindeutig sehen, dass der Zucker des Phloridzins abgespalten wird, es entsteht aber kein Phloretin als Aglykon, sondern ein Phloretin-ähnlicher Stoff. Es könnte sich um ein Glucoronid handeln oder es könnte eine Methoxygruppe eingeführt sein, was allerdings mit dieser Methode nicht näher bestimmt werden konnte, sondern mit einer HPLC-MS. Rutin hat wegen des Disaccharides keine Affinität zur LPH oder zu dem Glucosetransporter SGLT1 und gelangt deshalb nur sehr schlecht bis gar nicht in die Zelle. Die Aglyka gelangen am besten in die Zelle, wo sie unter anderem ihre starken antagonistischen Effekte in Bezug auf CYP1A1 bewirken können.