Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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It was recently reported that imatinib causes cell death in neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVCM) by triggering endoplasmic reticulum (ER) stress and collapsed mitochondrial membrane potential. Retroviral gene transfer of an imatinib-resistant mutant c-Abl into NRVCM appeared to alleviate imatinib-induced cell death and it was concluded that the observed imatinib-induced cytotoxicity is mediated through direct interactions of imatinib with c-Abl. The imatinib effects were described as being specific for cardiomyocytes only, which are relevant also for the in vivo situation in man. [Kerkelä et al. 2006] The goal of the present study was to reproduce the published experiments and to further explore the dose-response relationship of imatinib-induced cell death in cardiomyocytes. Additional markers of toxicity were investigated. The following biochemical assays were applied: LDH release (membrane leakage marker), MTS-reduction (marker of mitochondrial integrity), ATP cellular contents (energy homoeostasis) and caspase 3/7 activity (apoptosis). The endoplasmatic reticulum (ER) stress markers eIF2α (elongation initiation factor 2α), XBP1 (X Box binding Protein 1), and CHOP (cAMP response element-binding transcription factor (C/EBP) homologous protein) were determined at the transcriptional and protein level. Online monitoring of cell attachment of, oxygen consumption and acidification of the medium by rat heart cells (H9c2) seated on chips (Bionas) allowed the determination of the onset and reversibility of cellular functions. Image analysis measured the spontaneous beating rates after imatinib treatment. The role of imatinib-induced reactive oxygen species was evaluated directly by 2’,7’-Dichlorofluorescein fluorescence and indirectly by means of interference experiments with antioxidants. The specificity of imatinib-induced effects were specific to cardiomyocytes was evaluated in fibroblasts derived from rat heart, lung and skin. The specific role of c-Abl in the imatinib-induced cellular toxicity was investigated by specific gene silencing of c-Abl in NRVCM. The results demonstrated that imatinib caused concentration-dependent cytotoxicity, apoptosis, and ER stress in heart, skin and lung fibroblasts, similar or stronger to those observed in cardiomyocytes. Similar to the results from cardiomyocytes, ER stress markers in fibroblasts were only increased at cytotoxic concentrations of imatinib. This effect was not reversible; also, reactive oxygen species did not participate in the mechanism of the imatinib-induced cytotoxicity in NRVCM. Small interfering RNA (siRNA)-mediated reduction of c-Abl mRNA levels by 51 % and c-Abl protein levels by 70 % had neither an effect on the spontaneous beating frequency of cardiomyocytes nor did it induce cytotoxicity, apoptosis, mitochondrial dysfunction or ER stress in NRVCM. Incubation of imatinib with c-Abl siRNA-transfected NRVCM suggested that reduced c-Abl protein levels did not rescue cardiomyocytes from imatinib-induced cytotoxicity. In conclusion, results from this study do not support a specific c-Abl-mediated mechanism of cytotoxicity in NRVCM.
Doppelbindungen verminderter Konjugation auftreten, ähnlich der 9,10-Doppelbindung in Phenanthren. Die Eignung von Dbf-1 als η5-Metallocenligand konnte durch die Darstellung einer Reihe von Übergangsmetallkomplexen gezeigt werden: Neben dem symmetrischen Ferrocen Dbf2Fe, dessen analoge Fluorenylverbindung nicht bekannt ist, konnten auch die unsymmetrisch substituierten Ferrocene (η5-Dbf)Fe(η5-4Cp) (4Cp: 1,2,3,4- Tetraisopropylcyclopentadienyl) und (η5-Dbf)Fe(η5-Cp’’’) (Cp’’’: 1,2,4-Tri-tert-butylcyclopentadienyl) erhalten werden. Weiterhin wurden Metallocen- und Arenkomplexe mit Gruppe VI-Metallen ((η3-Allyl)(η5-Dbf)M(CO)2, M = Mo, W und (η6-DbfH)Cr(CO)3 isoliert, sowie Metallocene der Metalle Mangan ((η5-Dbf)Mn(CO)3), Cobalt ([(η5-Dbf)Co(η5-Cp*)]PF6, Cp*: 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadienyl), Ruthenium ((η5-Dbf)Ru(PPh3)2Cl, [(η5-Dbf)Ru(PPh3)2(NCMe)]SbF6) und Titan (η5-Dbf)(η1-Dbf)Ti(OiPr)2. Für die lokalisierten Doppelbindungen in 3,4- und 3’,4’-Position wird – wie im Fall des Phenanthren – partielle olefinische Reaktivität erwartet. Dies konnte durch die selektive Anwendung olefintypischer Reaktionen an diesen Positionen bestätigt werden. Reaktion von Dbf-Ferrocenen mit molekularem Wasserstoff in Gegenwart von Pd/C erlaubt selektive Hydrierung der Komplexe an Position 3,4 und 3’,4’ und liefert die entsprechenden 3,3’,4,4’-Tetrahydrodibenzo[c,g]fluorenylkomplexe (H4-Dbf)2Fe und (H4-Dbf)Fe(4Cp). Die Umsetzung mit ZnEt2 und ClCH2I erlaubt die selektive Cyclopropanierung der Ferrocens (Dbf)Fe(Cp’’’).
In dieser Arbeit wurden für die Moleküle B3, B3- und C3+ mit dem MR-CI-Verfahren hochgenaue Potentialfächen für ein oder mehrere elektronische Zustände berechnet. Alle drei Moleküle besitzen elektronisch entartete Jahn-Teller-Zustände. Im Gegesatz zu den früher untersuchten Alkalitrimeren liegt hier die konische Durchschneidung so tief, dass sie bei der Schwingungsanalyse berücksichtigt werden muss und daher eine diabatische Behandlung erfordlich ist. Für den X<-1E'-Übergang im B3 konnte die Übereinstimmung des berechneten Spektrum mit dem gemessenen durch den Einsatz des größeren Basissatzes VQZ, im Vergleich zu den bereits veröffentlichten Ergebnissen, nochmals deutlich verbessert werden. Für den berechneten 00-Übergang ist im gemessen Spektrum kein Übergang zu beobachten. Neben der guten Übereinstimmung der anderen Peaks wird diese These auch die T00 Energie gestützt. Die einfache Progression des experimentellen X<-2E'-Übergangs im B3 konnte ebenfalls in gute Übereinstimmung berechnet werden. Die einfache und kurze Progression ergibt sich aus der Tatsache, dass praktisch keine Jahn-Teller-Verzerrung vorhanden ist, und beide Teilflächen fast deckungsgleich sind. Für den X<-1E'-Übergang des B3- wurde ebenfalls ein Spektrum simuliert, allerdings findet sich keine Übereinstimmung zu den gemessenen Übergängen. Da die beobachtete Elektronenablöseenergie nur unwesentlich oberhalb der Elektronenanregungsenergie liegt und im Hinblick auf die starken X<-2E'-Absorptionen des B3 in der gleichen Messung bleibt offen, welche Strukturn im Experiment zu sehen sind. Zum C3+ wurde eine Schwingungsanalyse für den E'-Grundzustand durchgeführt. Experimentelle Vergleichswerte fehlen in diesem Fall. Allerdings konnte die bereits seit mehr als einem Jahrzehnt diskutierte Höhe der Isomerisierungsenergie zwischen gewinkelter und linearer Geometrie sehr genau, auf nun 6.8 +- 0.5 kcal/mol festgelegt werden. Bei vibronischer Betrachtung unter Einbeziehung der Nullpunktsenergien reduziert sich diese auf bzw. 4.8 kcal/mol. Ausserdem wurde die Existenz eines linearen Minimums bestätigt. C3+ liefert auch ein sehr schönes Beispiel für die Verschränkung verschiedener lokaler und globaler Schwingungszustände, was zu einer irregulären Abfolge von Zuständen führt. Für die Reaktivität des C3+ wurde beobachtet, dass es unterhalb von 50 K die höchste Reaktivität besitzt und darüber deutlich abnimmt. Auf dieses Verhalten liefert die Schwingungsanalyse keine Antwort, da bis selbst zur Raumtemperatur keine thermische Schwingungsanregung statt finden kann.
A series of (oligo)phenthiazines, thiazolium salts and sulfonic acid functionalized organic/inorganic hybrid materials were synthesized. The organic groups were covalently bound on the inorganic surface through reactions of organosilane precursors with TEOS or with the silanol groups of material surface. These synthetic methods are called the co-condensation process and the post grafting. The structures and the textural parameters of the generated hybrid materials were characterized by XRD, N2 adsorption-desorption measurements, SEM and TEM. The incorporations of the organic groups were verified by elemental analysis, thermogravimetric analysis, FT-IR, UV-Vis, EPR, CV, as well as by 13C CP-MAS NMR and 29Si CP-MAS NMR spectroscopy. Introduction of various organic groups endow different phsysical, chemical properties to these hybrid materials. The (oligo)phenothiazines provide a group of novel redox acitive hybrid materials with special electronic and optic properties. The thiazolium salts modified materials were applied as heterogenized organo catalysts for the benzoin condensation and the cross-coupling of aldehydes with acylimines to yield a-amido ketones. The sulfonic acid containing materials can not only be used as Broensted acid catalysts, but also can serve as ion exchangable supports for further modifications and applications.
Funktionalisierte Binaphthyle erlangen immer größere Bedeutung für die enantioselektive Katalyse. Durch Koordination an entsprechende Metallzentren vermögen sie Reaktionen zu katalysieren und Chiralität zu induzieren. Die Synthese neuer chiraler P,N-Binaphthylliganden mit verschiedenen Heterozyklen wie Pyrazol oder Triazol als N-Donoreinheit war das Ziel dieser Arbeit. Ausgehend von 1,1’-Binaphth-2,2’-diol (BINOL) konnten auf unterschiedlichen Reaktionswegen entsprechende Ligandvorstufen mit Phosphanoyleinheit in 2-Position synthetisiert werden. Anhand von Einkristallen konnte die Festkörperstruktur der zum Teil enantiomerenreinen Binaphthyle mit Cyano-, Acetyl-, Methylester-, Carbonsäure- und Amidgruppe in 2’-Position mittels Röntgenstrukturanalyse nachgewiesen werden. Durch die Kondensation der Acetyl- bzw. Amidvorstufe mit N,N-Dimethylformamiddimethylacetal sowie der anschließenden Zyklisierung mit Hydrazin-Monohydrat gelang es den Pyrazol- bzw. Triazolring in das Binaphthylgerüst einzuführen. Die Reduktion der Phosphanoyleinheit mit Trichlorsilan komplettierte die Ligandsynthesen. Während vom Triazolliganden die Synthese beider Enantiomere durchgeführt wurde, konnte vom Pyrazolliganden im Rahmen dieser Arbeit nur das S-Enantiomer erhalten werden. Die neuen P,N-Liganden wurden im weiteren Verlauf der Arbeit auf ihre Fähigkeit zur Koordination an Übergangsmetallen wie Palladium untersucht. Die Komplexierung mit PdCl2(PhCN)2 konnte bislang jedoch nur mit dem Triazolliganden erfolgreich durchgeführt werden. Spektroskopische und kristallographische Untersuchungen zeigten dabei einen interessanten Aspekt im Koordinationsverhalten dieses neuen P,N-Binaphthyls. Sowohl beim S-Enantiomer als auch beim R-Enantiomer dieses Liganden wurde die Bildung eines dimeren Pd2Cl2-Komplexes beobachtet und durch Röntgenstrukturanalyse des enantiomerenreinen R-Komplexes bestätigt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Adduktbildung von Acrylamid und Glycidamid mit dem N-terminalen Valin des Hämoglobins unter verschiedenen Aspekten untersucht. Die Bestimmung der Biomarker AAVal und GAVal erfolgte unter Anwendung des modifizierten Edman-Abbaus und einer sich anschließenden Analytik mittels LC/MS/MS oder GC/MS. Die zur Quantifizierung von AAVal und GAVal benötigten Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate wurden synthetisiert und charakterisiert. Mit Hilfe der GC/MS-Methodik wurden Hintergrundadduktgehalte gefunden, die bei Nichtrauchern durchschnittlich 37 pmol AAVal/g Hb und 21 pmol GAVal/g Hb betrugen, während Raucher mit durchschnittlich 91 pmol AAVal/g Hb deutlich höhere Werte aufwiesen. Diese Werte liegen im Bereich der üblicherweise gefundenen Hintergrundadduktgehalte für AAVal und GAVal. Ein Raucher wies abweichend davon mit 859 pmol AAVal/g Hb und 211 pmol GAVal/g Hb eine überdurchschnittlich hohe Hintergrundbelastung auf. Es wurde eine Dosimetrie der Adduktbildung von Acrylamid und Glycidamid durch Inkubation von Humanblut durchgeführt. Die LC/MS/MS-Methodik wies dabei keine ausreichende Sensitivität auf. Die Kinetik dieser Reaktion im Konzentrationsbereich der Hintergrundadduktgehalte nach Inkubation mit 0,3, 3 und 10 µM für 1 bzw. 4 Stunden wurde deshalb mittels GC/MS untersucht. Nach vierstündiger Inkubation zeigte der AAVal-Gehalt bei Inkubation mit 0,3 µM Acrylamid einen statistisch signifikanten Anstieg (p<0,01), während der GAVal-Gehalt erst bei Inkubation mit 3 µM Glycidamid statistisch signifikant anwuchs (p<0,01). Im Hinblick auf die unter vergleichbaren Bedingungen mittels Comet Assay detektierten DNA-Strangbrüche ab 10 µM Glycidamid, kann auf Grund des geringen Konzentrationsabstandes ein partieller Schutz der Zellen vor Glycidamid-induzierten DNA-Schäden durch Addukbildung mit dem Hämoglobin angenommen werden. Die um den Faktor 2-4 höher erscheinende Reaktivität von Acrylamid gegenüber dem N-terminalen Valin kann durch weitere Bestandteile im Blut mit nukleophilen Zentren beeinflusst sein. Um die Effektivität der Abspaltung von AAVal und GAVal bei der Derivatisierung zu den PFPTH-Derivaten bei Quantifizierung des Adduktgehaltes berücksichtigen zu sollten Methoden zur Verwendung von Dipeptid-Standardsubstanzen etabliert werden. Auf Grund der Unsicherheiten bei der Charakterisierung wurden diese jedoch nur für orientierende Untersuchungen verwendet. Nach Inkubation des humanen Vollblutes mit 3 und 30 µM [2,3-14C-Acrylamid] für 15 Minuten, 1, 4 oder 6 Stunden zeigte sich eine schnelle Verteilung des Acrylamids über die einzelnen Blutkompartimente und eine schnell erfolgende Reaktion mit nukleophilen Zentren. Die Radioaktivität liegt zu 9-14 % an Plasmaproteine gebunden vor, während auf das Hämoglobin 7 % und auf Erythrozytenfragmente weitere 8 % entfallen. Somit liegen 25-35 % des Acrylamids gebunden vor. Es ist jedoch auf Grund der hohen Konzentration von GSH im Erythrozyten-Zytosol eine insgesamt höhere Bindung des Acrylamids zu erwarten. Im Rahmen einer humanen Acrylamid-Verzehrsstudie wurde die zeitliche Veränderung von AAVal und GAVal bei 3 ausgewählten Probanden nach der in der jeweiligen Studienphase in Form von Kartoffelchips verabreichten Menge von 1 mg untersucht. In der Referenzperiode R zeigte AAVal bei diesen Probanden einen durchschnittlichen Anstieg von 17 %. Eine höhere Zuwachsrate von 39 % zeigte AAVal in der Testperiode T1, in der CYP 2E1 durch Disulfiram gehemmt wurde und somit kein oxidativer Metabolismus zu Glycidamid stattfand. In der Testperiode T2, in der CYP 2E1 durch eine Vorbehandlung mit Ethanol induziert wurde, wies AAVal einen der Referenzphase vergleichbaren Anstieg um 19 % auf. Die höhere statistische Signifikanz des Anstiegs von AAVal in der Testperiode T1 im Vergleich zu den beiden anderen Studienabschnitten konnte mit Hilfe einer geeigneten statistischen Auswertung gezeigt werden. Für GAVal hingegen konnte auf Grund der größeren Messwertschwankungen nur für die gesamte Studiendauer ein Anstieg um 49 % festgestellt werden. Für den Anstieg von GAVal deutet sich ein Zusammenhang mit der individuellen CYP 2E1-Aktivität der drei Probanden, deren Phänotypisierung mittels Chlorzoxazon-Metabolismus bestimmt wurde. Diese Tendenz bestätigt sich jedoch nicht für die Gesamtheit der 16 Probanden. In dieser Arbeit wurde die Effizienz der Adduktbildung von Acrylamid und Glycidamid mit Hämoglobin unter verschiedenen Aspekten aufgezeigt. Ob die protektiven Mechanismen auf zellulärer Ebene ausreichend sind, um elektrophile Xenobiotika wie Acrylamid und Glycidamid bis hin zu einem möglicherweise vorhandenen Schwellenwert biologisch zu inaktivieren, müssen weitere Untersuchungen aufzeigen.