Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is a highly toxic and persistent organic pollutant, which is ubiquitously found in the environment. The prototype dioxin compound was classified as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. TCDD acts as a potent liver tumor promoter in rats, which is one of the major concerns related to TCDD exposure. There is extensive evidence, that TCDD exerts anti-estrogenic effects via arylhydrocarbon receptor (AhR)-mediated induction of cytochromes P450 and interferes with the estrogen receptor alpha (ERalpha)-mediated signaling pathway. The present work was conducted to shed light on the hypothesis that enhanced activation of estradiol metabolism by TCDD-induced enzymes, mainly CYP1A1 and CYP1B1, leads to oxidative DNA damage in liver cells. Furthermore, the possible modulation by 17beta-estradiol (E2) was investigated. The effects were examined using four different AhR-responsive species- and sex-specific liver cell models, rat H4II2 and human HepG2 hepatoma cell lines as well as rat primary hepatocytes from male and female Wistar rats. The effective induction of CYP1A1 and CYP1B1 by TCDD was demonstrated in all liver cell models. Basal and TCDD-induced expression of CYP1B1, which is a key enzyme in stimulating E2 metabolism via the more reactive formation of the genotoxic 4-hydroxyestradiol, was most pronounced in rat primary hepatocytes. CYP-dependent induction of reactive oxygen species (ROS) was only observed in rodent cells. E2 induced ROS only in primary rat hepatocytes, which was associated with a weak CYP1B1 mRNA induction. Thus, E2 itself was suggested to induce its own metabolism in primary rat hepatocytes, resulting in the redox cycling of catechol estradiol metabolites leading to ROS formation. In this study the role of TCDD and E2 on oxidative DNA damage was investigated for the first time in vitro in the comet assay using liver cells. Both TCDD and E2 were shown to induce oxidative DNA base modifications only in rat hepatocytes. Additionally, direct oxidative DNA-damaging effects of the two main E2 metabolites, 4-hydroxyestradiol and 2-hydroxyestradiol, were only observed in rat hepatocytes and revealed that E2 damaged the DNA to the same extent. However, the induction of oxidative DNA damage by E2 could not completely be explained by the metabolic conversion of E2 via CYP1A1 and CYP1B1 and has to be further investigated. The expression of low levels of endogenous ERalpha mRNA in primary rat hepatocytes and the lack of ERalpha in hepatoma cell lines were identified as crucial. Therefore, the effects of interference of ERalpha with AhR were examined in HepG2 cells, which were transiently transfected with ERalpha. The over-expression of ERalpha led to enhanced AhR-mediated transcriptional activity by E2, suggesting a possible regulation of E2 levels. In turn, TCDD reduced E2-mediated ERalpha signaling, confirming the anti-estrogenic action of TCDD. Such a modulation of the combined effects of TCDD with E2 was not observed in any of the other experiments. Thus, the role of low endogenous ERalpha levels has to be further investigated in transfection experiments using rat primary hepatocytes. Overall, rat primary hepatocyte culture turned out to be the more adaptive cell model to investigate metabolism in the liver, reflecting a more realistic situation of the liver tissue. Nevertheless, during this work a crosstalk between ERalpha and AhR was shown for the first time using human hepatoma cell line HepG2 by transiently transfecting ERalpha.
Motivation dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von Katalysatoren zur selektiven Dimerisierung von 1-Hexen zu n-Dodecen und zu möglichst wenig verzweigten Produkten. Untersucht wurden die Zeolithe Y, L und ZSM-12 sowie die Silicoalumophosphate SAPO-5, SAPO-11, SAPO-31 und SAPO-41. Für die BrØnsted-aciden Katalysatoren ist festzuhalten: Alle hergestellten Zeolithe, das heißt H-Y, H-L und H-ZSM-12, verfügten über starke acide Zentren. Zeolith H-L erwies sich ebenfalls als sehr aktives Material. Die Selektivitäten zu den Zielprodukten waren bei vergleichbaren Umsätzen etwas höher als bei Verwendung von H-Y, was für einen schwachen formselektiven Effekt spricht. An Zeolith H-ZSM-12 wurden nur geringe Umsätze erzielt. Für die Silicoalumophosphate wurde gefunden: Alle verfügen über acide Zentren, welche jedoch etwas schwächer waren als die der BrØnsted-aciden Zeolithe. Um vergleichbare Umsätze wie an den Zeolithen zu erzielen, waren daher höhere Reaktionstemperaturen oder längere Reaktionszeiten erforderlich. H-SAPO-5 zeigte dabei eine gegenüber H-L erhöhte Selektivität zu den Zielprodukten, vermutlich aufgrund der etwas engeren Poren. H-SAPO-11, H-SAPO-31 und H-SAPO-41 zeigten trotz vorhandener und zugänglicher acider Zentren nur vernachlässigbare Umsätze. Analog zu Zeolith H-ZSM-12 wird dies auch hier auf die zu engen Poren zurückgeführt, welche die Bildung des Übergangszustandes offensichtlich nicht zulassen. Wurde Nickel in die Katalysatoren eingebracht, zeigten sich Unterschiede, die vor allem von der Präparationsmethode abhängen. Durch verschiedene Methoden gelang es, Katalysatoren herzustellen, die eine hohe Selektivität entweder zu n-Dodecen oder zu einfach verzweigten Dodecenen aufwiesen. Durch Ionenaustausch mit Nickelacetat in wässriger Lösung wurden Ni-Y, Ni-L und NiH-SAPO-5 hergestellt. Diese Materialien verfügten wahrscheinlich über Nickel auf Kationenpositionen. Sie zeigten eine gegenüber der sauren Form deutlich erhöhte Selektivität zu den Zielprodukten, der Effekt nahm in der Reihe Ni-Y < Ni-L < NiH-SAPO-5 zu. Analog zu den Resultaten an H-Y, H-L und H-SAPO-5 lässt sich dies mit einer zunehmenden Formselektivität durch das Porensystem der Katalysatoren begründen. Bei Ni-Y und NiH-SAPO-5 ließen sich mittels Temperaturprogrammierter Reduktion zwei verschiedene Nickelspezies nachweisen, die sich vermutlich durch die ihre Position in Gitter unterscheiden und dadurch eine unterschiedliche Stabilisierung gegenüber einer Reduktion erfahren. Wurde bei Ni-Y und NiH-SAPO-5 die jeweils leichter zu reduzierende Nickelspezies mit Wasserstoff reduziert, zeigten die so behandelten Katalysatoren eine stark verringerte Aktivität in der Katalyse. Dies ist in Einklang mit dem vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus, der von Ni(I) als aktiver Spezies ausgeht (welche durch eine Autoreduktion von Ni(II) während der Aktivierung des Katalysators erzeugt werden): Wird Nickel durch den Träger sehr stark stabilisiert, ist keine Autoreduktion mehr möglich und somit die Aktivität des Katalysators sehr gering. NiH-SAPO-5 wurde mit verschiedenen Siliciumanteilen hergestellt, was das Einbringen verschiedener Mengen an Nickel durch Ionenaustausch erlaubte. Hierbei zeigte sich, dass die Selektivität zu den Zielprodukten mit dem Nickelgehalt zunimmt und durch Verwendung eines H-SAPO-5 mit xSi = 0,20 (und damit hoher Ionenaustauschkapazität) bis zu 89 % Selektivität zu C12-Isomeren erreicht werden können, wobei diese je etwa zur Hälfte aus n-Dodecen und zur Hälfte einfach verzweigte Dimeren bestanden. Sollten bevorzugt einfach verzweigte Dodecene hergestellt werden, so war es durch Festkörperreaktion des BrØnsted-aciden Trägers mit Nickelacetat möglich, einen Katalysator zu präparieren, der keine linearen Produkte lieferte und bei geeignetem Nickelgehalt eine hohe Selektivität zu einfach verzweigten Dimeren aufwies. Dieser Effekt ist nur wenig vom Porensystem des Trägers, jedoch stark von dessen Ionenaustauschkapazität abhängig. Je höher diese ist, umso höher ist auch die Selektivität des resultierenden Katalysators. Wie TPD-Messungen mit 1-Aminopentan und Ammoniak als Sondenmoleküle zeigten, besaßen die so präparierten Materialien keine sauren Zentren mehr. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass es durch geeignete Wahl der Präparationsmethode und der Porengeometrie möglich ist, Katalysatoren zu erhalten, die entweder zur Herstellung von n-Dodecen oder zu überwiegend wenig verzweigten C12-Isomeren geeignet sind. Überraschenderweise, gelang es außerdem, mit dem gleichem Trägermaterial Katalysatoren herzustellen, welche kein n-Dodecen liefern, aber eine sehr hohe Selektivität zu einfach verzweigten C12-Isomeren besitzen. Vor allem anhand von NiH-SAPO-5 konnte weiterhin belegt werden, dass die Kombination aus geeigneter Porengeometrie und Nickel eine geeignete Methode zur Herstellung von Katalysatoren für die selektive Dimerisierung von 1-Hexen zu n-Dodecen ist.
Der Kernrezeptor PXR spielt eine bedeutende Rolle im Fremdstoffmetabolismus als auch im Stoffwechsel endogener Substrate. Er reguliert die Expression zahlreicher Proteine des Fremdstoffwechsels. Deshalb hat die Aktivierung oder Hemmung des PXR einen großen Einfluss auf den Stoffwechselstatus dieser Proteine. Zum derzeitigen Stand der Forschung nimmt der PXR eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der CYP3A-Enzyme ein. Es besteht deshalb Interesse Substanzen, die in Verdacht stehen PXR abhängig CYP3A zu induzieren, zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden bromierte Flammschutzmittel und der Arzneimittelkandidat EMD untersucht. Aus den Vorversuchen wurde ersichtlich, dass die Rattenhepatomzelllinie H4IIE und die humane Hepatomzelllinie HepG2 geeignete in vitro Systeme zur Untersuchung der PXR-abhängigen CYP3A-Aktivierung darstellen. Untersuchungen zum Genexpressionsverhalten zahlreicher Gene des Fremdstoffmetabolismus mittels TLDA-Karten zeigten, dass die beiden Zelllinien viele dieser Gene exprimieren, die nach Inkubation mit den Prototypinduktoren Rifampicin und Dexamethason spezies-spezifisch reguliert wurden. Die beiden Zelllinien wurden schließlich mit einem Reportergenvektor, der die PXR responsiven Elemente des CYP3A4-Gens enthält, stabil transfiziert. An den stabil transfizierten HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen wurden bekannte CYP-Induktoren sowie der Arzneimittelkandidat EMD und die Flammschutzmittel HBCD and der pentaBDE Mix getestet. Die Flammschutzmittel HBCD und der pentaBDE-Mix, werden in Textilwaren, Kunststoffen, Möbeln, Teppichen, Elektrogeräten und Baumaterialen eingesetzt. Falls sie tatsächlich den PXR spezies-spezifisch aktivieren sollten, könnten sie eine Gefahr für Mensch und Umwelt darstellen. Deshalb wurde in dieser Arbeit die CYP3A-mRNA-Expression, die Protein- sowie die Reportergenaktivität überprüft. Als gemeinsamer Aktivator des hPXR und rPXR stellte sich Clotrimazol, aber auch das Flammschutzmittel HBCD heraus, während pentaBDE ein besserer Ligand des hPXR ist. Omeprazol und Phenobarbital induzierten die rPXR-vermittelte CYP3A-Induktion in H4IIE-XREM3-Zellen nicht; in den humanen HepG2-XREM3-Zellen konnte jedoch eine moderate Reportergenaktivität gemessen werden. Weiteres Interesse besteht an dem Arzneimittelkandidaten EMD zur Behandlung des metabolischen Syndroms und Typ II-Diabetes. In vivo (Affen, Ratten) und in vitro (Hepatozyten) wurden bereits spezies-spezifische Effekte auf die CYP3A-Induktion durch EMD beobachtet. Deshalb wurde in dieser Arbeit der über aktivierten PXR vermittelte Mechanismus an Zelllinien überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass EMD ein hPXR-Aktivator und CYP3A-Induktor in HepG2-Zellen, jedoch kein Aktivator von rPXR in H4IIE-Zellen ist. Um schwerwiegende Nebenwirkungen und unvorhersehbare Arzneimittelwechselwirkungen durch die Aufnahme von Fremdstoffen zu verhindern, ist es bei der Neuentwicklung von Wirkstoffen aller Art notwendig, die Stoffe auf eine mögliche Induktion der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme zu untersuchen. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Etablierung von zell-basierten in vitro Assays zur Ermittlung der spezies-spezifischen PXR-abhängigen Induktion von CYP3A durch Chemikalien und Arzneimittelkandidaten, um mögliche Arzneimittel- und Fremdstoffwechselwirkungen und damit verbundene Sicherheitsrisiken vorhersagen zu können. Das etablierte PXR- Screeningsystem repräsentiert zwei in vitro Modelle, die erlauben spezies-spezifische Wirkungen auf die CYP3A-Induktion von Chemikalien, Umweltkontaminanten, Lebensmittelinhaltsstoffe und Arzneimittel schnell, einfach und kostengünstig abschätzen zu können. Eine frühe Erkennung der PXR-Aktivierung und CYP-Induktion von Arzneimitteln in der Entwicklung kann einen Weiterentwicklungsstopp dieser zur Folge haben. Dies hilft zusätzliche Tierversuche und Kosten einzusparen. Dem 3R-Prinzip (Reduce, Refine, Replace) vom Reduzieren der Anzahl der Tierversuche, der Verbesserung der existierenden Experimente und dem Ersetzen von Tierversuchen durch alternative Methoden (Russel & Burch, 1959) wird durch die stabil transfizierten Zelllinien in zweierlei Hinsicht Rechnung getragen: unnötige Tierversuche können vermieden reduction und die Aussagekraft von durchgeführten Tierstudien (z.B. vom Gesetzgeber geforderte Studien zur Arzneimittelentwicklung) verbessert werden (dies trägt auch zu einem refinement bei). Damit stellen die HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen eine wichtige innovative Verbesserung bei der Entwicklung von Arzneistoffen sowie bei der regulatorischen Testung von Chemikalien dar.
Es ist bekannt, dass die Genese von Darmerkrankungen von der aufgenommenen Nahrung beeinflusst wird. Der Genuss von Apfelprodukten mit hoher antioxidativer Wirksamkeit könnte daher zur Prävention ROS-assoziierter Erkrankungen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von polyphenolreichen Extrakte aus Apfelsaft (AE01–AE07), Tresterextraktionssaft (AE03B, AE06B) und Apfelschalen (GS, PE) sowie von Polyphenolen auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Caco-2 Zellen. Zur Annäherung an die in vivo-Situation wurden mit Darmbakterien fermentierte Apfelsaftextrakte/Trub in die Untersuchungen einbezogen, dabei entstehende Abbauprodukte wurden charakterisiert und ebenfalls geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level, GSH-Spiegel und SOD1-Expression. Zusätzlich wurde die zellfreie antioxidative Kapazität (ORAC/TEAC) erfasst. Die antioxidative Kapazität aller Extrakte war hoch und korrelierte mit dem Gehalt an Polyphenolen bzw. Procyanidinen. Der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch AE07 und GS reduziert, während AE05, AE06B und GS den besten Schutz vor oxidativen DNA-Schäden boten. Eine Erhöhung des tGSH-Spiegels konnte durch Inkubation mit AE06, AE07, GS und PE erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass vor allem Flavonol/Procyanidin-reiche Extrakte eine gute protektive Wirksamkeit aufweisen. Die fermentierten Extrakte zeigten eine deutliche antioxidative Wirksamkeit, was vor allem den identifizierten phenolischen Abbauprodukten zugeschrieben werden konnte, die fast alle eine ausgeprägte Wirksamkeit im zellfreien und zellulären System zeigten. Es ist nicht auszuschließen, dass auch andere Komponenten (wie z.B. SCFA) zur protektiven Wirksamkeit fermentierter Extrakte beitragen könnten. Der fermentierte Trub erwies sich in den Untersuchungen als unwirksam, da in ihm keine Polyphenole identifiziert werden konnten. Weiterhin wurden auch Polyphenol-vermittelte prooxidative Effekte untersucht, für die sich neben einer starken Strukturabhängigkeit die Wahl des verwendeten Mediums als entscheidender Faktor für die beobachtete H2O2-Bildung erwies. Es wurden keine adversen Effekte auf zelluläre Marker beobachtet, vielmehr könnte die Wirksamkeit der Polyphenole durch geringe Mengen an ROS unterstützt werden, da diese die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren. Insgesamt erwiesen sich phenolische Extrakte aus Apfelbestandteilen als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzellen. In begleitenden Untersuchungen mit Einzelstoffen wurden Polyphenole identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Extrakte beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass die protektive Wirksamkeit von Extrakten und Inhaltsstoffen trotz intestinalen Abbaus persistiert und dass eine moderate prooxidative Wirksamkeit der Polyphenole in Zellen einen günstigen Einfluss auf deren antioxidative Abwehr ausüben kann.
In dieser Arbeit wurden für die Moleküle B3, B3- und C3+ mit dem MR-CI-Verfahren hochgenaue Potentialfächen für ein oder mehrere elektronische Zustände berechnet. Alle drei Moleküle besitzen elektronisch entartete Jahn-Teller-Zustände. Im Gegesatz zu den früher untersuchten Alkalitrimeren liegt hier die konische Durchschneidung so tief, dass sie bei der Schwingungsanalyse berücksichtigt werden muss und daher eine diabatische Behandlung erfordlich ist. Für den X<-1E'-Übergang im B3 konnte die Übereinstimmung des berechneten Spektrum mit dem gemessenen durch den Einsatz des größeren Basissatzes VQZ, im Vergleich zu den bereits veröffentlichten Ergebnissen, nochmals deutlich verbessert werden. Für den berechneten 00-Übergang ist im gemessen Spektrum kein Übergang zu beobachten. Neben der guten Übereinstimmung der anderen Peaks wird diese These auch die T00 Energie gestützt. Die einfache Progression des experimentellen X<-2E'-Übergangs im B3 konnte ebenfalls in gute Übereinstimmung berechnet werden. Die einfache und kurze Progression ergibt sich aus der Tatsache, dass praktisch keine Jahn-Teller-Verzerrung vorhanden ist, und beide Teilflächen fast deckungsgleich sind. Für den X<-1E'-Übergang des B3- wurde ebenfalls ein Spektrum simuliert, allerdings findet sich keine Übereinstimmung zu den gemessenen Übergängen. Da die beobachtete Elektronenablöseenergie nur unwesentlich oberhalb der Elektronenanregungsenergie liegt und im Hinblick auf die starken X<-2E'-Absorptionen des B3 in der gleichen Messung bleibt offen, welche Strukturn im Experiment zu sehen sind. Zum C3+ wurde eine Schwingungsanalyse für den E'-Grundzustand durchgeführt. Experimentelle Vergleichswerte fehlen in diesem Fall. Allerdings konnte die bereits seit mehr als einem Jahrzehnt diskutierte Höhe der Isomerisierungsenergie zwischen gewinkelter und linearer Geometrie sehr genau, auf nun 6.8 +- 0.5 kcal/mol festgelegt werden. Bei vibronischer Betrachtung unter Einbeziehung der Nullpunktsenergien reduziert sich diese auf bzw. 4.8 kcal/mol. Ausserdem wurde die Existenz eines linearen Minimums bestätigt. C3+ liefert auch ein sehr schönes Beispiel für die Verschränkung verschiedener lokaler und globaler Schwingungszustände, was zu einer irregulären Abfolge von Zuständen führt. Für die Reaktivität des C3+ wurde beobachtet, dass es unterhalb von 50 K die höchste Reaktivität besitzt und darüber deutlich abnimmt. Auf dieses Verhalten liefert die Schwingungsanalyse keine Antwort, da bis selbst zur Raumtemperatur keine thermische Schwingungsanregung statt finden kann.
Doppelbindungen verminderter Konjugation auftreten, ähnlich der 9,10-Doppelbindung in Phenanthren. Die Eignung von Dbf-1 als η5-Metallocenligand konnte durch die Darstellung einer Reihe von Übergangsmetallkomplexen gezeigt werden: Neben dem symmetrischen Ferrocen Dbf2Fe, dessen analoge Fluorenylverbindung nicht bekannt ist, konnten auch die unsymmetrisch substituierten Ferrocene (η5-Dbf)Fe(η5-4Cp) (4Cp: 1,2,3,4- Tetraisopropylcyclopentadienyl) und (η5-Dbf)Fe(η5-Cp’’’) (Cp’’’: 1,2,4-Tri-tert-butylcyclopentadienyl) erhalten werden. Weiterhin wurden Metallocen- und Arenkomplexe mit Gruppe VI-Metallen ((η3-Allyl)(η5-Dbf)M(CO)2, M = Mo, W und (η6-DbfH)Cr(CO)3 isoliert, sowie Metallocene der Metalle Mangan ((η5-Dbf)Mn(CO)3), Cobalt ([(η5-Dbf)Co(η5-Cp*)]PF6, Cp*: 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadienyl), Ruthenium ((η5-Dbf)Ru(PPh3)2Cl, [(η5-Dbf)Ru(PPh3)2(NCMe)]SbF6) und Titan (η5-Dbf)(η1-Dbf)Ti(OiPr)2. Für die lokalisierten Doppelbindungen in 3,4- und 3’,4’-Position wird – wie im Fall des Phenanthren – partielle olefinische Reaktivität erwartet. Dies konnte durch die selektive Anwendung olefintypischer Reaktionen an diesen Positionen bestätigt werden. Reaktion von Dbf-Ferrocenen mit molekularem Wasserstoff in Gegenwart von Pd/C erlaubt selektive Hydrierung der Komplexe an Position 3,4 und 3’,4’ und liefert die entsprechenden 3,3’,4,4’-Tetrahydrodibenzo[c,g]fluorenylkomplexe (H4-Dbf)2Fe und (H4-Dbf)Fe(4Cp). Die Umsetzung mit ZnEt2 und ClCH2I erlaubt die selektive Cyclopropanierung der Ferrocens (Dbf)Fe(Cp’’’).
The enamide moiety is an important substructure often encountered in biologically active compounds and synthetic drugs. Furthermore, enamides and their derivatives are versatile synthetic intermediates for polymerization, [4+2] cycloaddition, crosscoupling, Heck-olefinination, Halogenation, enantioselective addition or asymmetric hydrogenation. Traditional syntheses of this important substrate class involve rather harsh reaction conditions such as high temperatures and/or the use of strong bases. In continuation of our work on the addition of secondary amides to alkynes, we have developed a broadly applicable protocol for the catalytic addition of N-nucleophiles such as primary amides, imides and thioamides to terminal alkynes. The choice of ligands and additives determines the regiochemical outcome so that with two complementary catalyst systems, both the E-anti-Markovnikov products and the Z-anti-Markovnikov products can be synthesized highly regio- and stereoselectively.
It was recently reported that imatinib causes cell death in neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVCM) by triggering endoplasmic reticulum (ER) stress and collapsed mitochondrial membrane potential. Retroviral gene transfer of an imatinib-resistant mutant c-Abl into NRVCM appeared to alleviate imatinib-induced cell death and it was concluded that the observed imatinib-induced cytotoxicity is mediated through direct interactions of imatinib with c-Abl. The imatinib effects were described as being specific for cardiomyocytes only, which are relevant also for the in vivo situation in man. [Kerkelä et al. 2006] The goal of the present study was to reproduce the published experiments and to further explore the dose-response relationship of imatinib-induced cell death in cardiomyocytes. Additional markers of toxicity were investigated. The following biochemical assays were applied: LDH release (membrane leakage marker), MTS-reduction (marker of mitochondrial integrity), ATP cellular contents (energy homoeostasis) and caspase 3/7 activity (apoptosis). The endoplasmatic reticulum (ER) stress markers eIF2α (elongation initiation factor 2α), XBP1 (X Box binding Protein 1), and CHOP (cAMP response element-binding transcription factor (C/EBP) homologous protein) were determined at the transcriptional and protein level. Online monitoring of cell attachment of, oxygen consumption and acidification of the medium by rat heart cells (H9c2) seated on chips (Bionas) allowed the determination of the onset and reversibility of cellular functions. Image analysis measured the spontaneous beating rates after imatinib treatment. The role of imatinib-induced reactive oxygen species was evaluated directly by 2’,7’-Dichlorofluorescein fluorescence and indirectly by means of interference experiments with antioxidants. The specificity of imatinib-induced effects were specific to cardiomyocytes was evaluated in fibroblasts derived from rat heart, lung and skin. The specific role of c-Abl in the imatinib-induced cellular toxicity was investigated by specific gene silencing of c-Abl in NRVCM. The results demonstrated that imatinib caused concentration-dependent cytotoxicity, apoptosis, and ER stress in heart, skin and lung fibroblasts, similar or stronger to those observed in cardiomyocytes. Similar to the results from cardiomyocytes, ER stress markers in fibroblasts were only increased at cytotoxic concentrations of imatinib. This effect was not reversible; also, reactive oxygen species did not participate in the mechanism of the imatinib-induced cytotoxicity in NRVCM. Small interfering RNA (siRNA)-mediated reduction of c-Abl mRNA levels by 51 % and c-Abl protein levels by 70 % had neither an effect on the spontaneous beating frequency of cardiomyocytes nor did it induce cytotoxicity, apoptosis, mitochondrial dysfunction or ER stress in NRVCM. Incubation of imatinib with c-Abl siRNA-transfected NRVCM suggested that reduced c-Abl protein levels did not rescue cardiomyocytes from imatinib-induced cytotoxicity. In conclusion, results from this study do not support a specific c-Abl-mediated mechanism of cytotoxicity in NRVCM.
Das zelluläre Uhrwerk der circadianen Rhythmik enthält eine autoregulatorische negative Feedbackschleife. Dabei induzieren am Beginn des circadianen Rhythmus die heterodimeren Komplexe aus CLOCK- und BMAL1-Proteinen die Transkription ihrer Zielgene, darunter auch die der Period- (PER) und Cryptochrom- (CRY)-Gene. Am Ende des circadianen Rhythmus inhibieren die CRY- und PER-Proteine die CLOCK/BMAL1-gesteuerte Transkription. Die durch Sauerstoffmangel gesteuerte Regulation der Transkription wird durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) reguliert, von denen HIF-1α eine besondere Rolle bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen spielt. Im Schlaf, d.h. in der circadianen Nachtphase ändert sich die funktionelle Organisation der Atmung grundlegend und es kommt zu einer leichten Reduktion des Sauerstoffpartialdruckes und das Auftreten hypoxischer Perioden wird begünstigt, was auf einen Zusammenhang zwischen circadianer Rhythmik und Hypoxie-gesteuerter Transkription hindeutet. Daher wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welchen Einfluss die circadianen Proteine CRY1 und PER1 auf HIF-1α und die HIF-1 regulierte Transkription haben. Es konnte die Interaktion zwischen den circadianen Proteinen CRY1 und PER1 mit HIF-1α erstmalig in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Die HIF-1α-Proteinregion in der sich die basic-Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Domäne befindet und die C-terminale tail-Region des CRY1-Proteins konnten als verantwortliche Proteindomänen für die Interaktion zwischen CRY1 und HIF-1α identifiziert werden. Die Interaktion von HIF-1α mit PER1 erfolgte ebenso über die bHLH Domäne des HIF-1α-Proteins. Die CRY1-HIF-1α-Interaktion beeinflusste die transkriptionelle Aktivität von HIF-1α negativ und verringerte die Expression von HIF-1-Targetgenen, wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1). Darüberhinaus konnte mit CRY- und PER-defizienten Zellen gezeigt werden, dass CRY1 und PER1 unabhängig von der Interaktion mit HIF-1α auch eine Repression der HIF-1α-mRNA-Expression und der HIF-1α-Promotoraktivität verursachen. Diese Daten zeigen, dass die Regulation der Transkription durch Hypoxie durch die negativen Regulatoren der circadianen Rhythmik beeinflusst werden kann. Diese Befunde könnten somit zum besseren Verständnis bestimmter Krankheiten, wie der Tumorigenese oder dem Schlaf-Apnoe-Syndrom beitragen. Da HIF-1α ein wichtiger Faktor in der Tumorigenese ist, der durch Veränderungen im Redoxzustand der Zellen beeinflusst wird und dabei möglicherweise mitochondriale ROS, die einem circadianen Rhythmus unterliegen, eine wichtige Rolle spielen, wurde untersucht, inwiefern eine Erhöhung der mitochondrialen ROS-Spiegel durch Defizienz der MnSOD tumorprogressiv ist. Die MnSOD wird als eines der wichtigsten intrazellulären antioxidativen Enzyme angesehen und soll eine Rolle als Tumorsuppressor spielen. Mittels Microarraytechnologie wurde die differentielle Genexpression in den Lebern der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Mäuse untersucht. Es konnte die Repression von vielen Genen gefunden werden, deren Produkte eine wichtige Rolle in der Abwehr gegen oxidativen Stress, der Krebsabwehr und der Hemmung der Apoptose spielen. Auf der anderen Seite konnte die Überexpression vieler Indikatoren für oxidativen Stress festgestellt werden. Desweiteren konnte die Induktion von nur zwei Genen, die eine Rolle in der Abwehr gegen den oxidativen Stress spielen gemessen werden, so dass insgesamt nur ein geringer kompensatorischer Effekt auf die MnSOD-Defizienz erreicht wird. Ein Vergleich der differentiell exprimierten Gene in der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Maus mit differentiell exprimierten Genen aus unter Hypoxie inkubierten bzw. HIF-1α-dominant-aktiven arteriellen Endothelzellen brachte keine Überschneidungen und zeigt, dass die höheren ROS-Level in den MnSOD-defizienten Hepatozyten die Hypoxie nicht imitieren bzw. nicht zu einer Expression von HIF-1-Targetgenen führen. Die MnSOD-defizienten Lebern waren auch anfälliger für die Entwicklung von hepatozellulären präneoplastischen Läsionen nach Induktion durch eine Einzeldosis Diethylnitrosamin (DEN). Die Anzahl der präneoplastischen Herde und die Bildung von Adenomen war im Vergleich zu den Wildtyptieren bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Tieren signifikant erhöht. Diese Daten zeigten, dass die Entstehung von präneoplastischen Läsionen und Tumoren unter Einwirkung von karzinogenen Substanzen bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD(-/-)-Mäusen mit einer stark erhöhten Rate im Vergleich zu den Wildtyptieren auftritt. Damit konnte die Rolle der MnSOD als Tumorsuppressor zumindest für die Leber bestätigt bzw. direkt aufgezeigt werden.
Der Entkopplermechanismus von UCP-2 sollte weitergehend untersucht sowie eine Methode zur Messung des Einfluss von UCP-2 auf die ROS-Homöostase gefunden werden. Durch Kompetitionsmessungen mit spinmarkierten Fettsäuren an rekonstituiertem UCP-2 sollte das Flip Flop Modell als Entkopplungsmechanismus weiter unterstützt und Bindungskonstanten abgeschätzt werden. Dies sollte in Titrationsmessungen mit kompetitierenden Fettsäuren und Purinnucleotiden gezeigt und mit Messungen in Gegenwart eines Kontrollproteins ohne Fettsäurebindungsstelle verglichen werden. Es konnte allerdings kein substöchiometrischer Verdrängungseffekt mit den Fettsäuren oder ATP gezeigt werden. Deswegen wurde der Einfluss des Detergens sowie der Ionenstärke auf das ESR-Signal untersucht und das Vorhandensein hochimmobilisierter spektraler Komponenten, typisch für die Einlagerung in eine Bindungsstelle, auch in Abwesenheit von UCP-2 gefunden. Um einen potenziellen Einfluss von UCP-2 auf die Homöostase von ROS zeigen zu können, sollte ein ESR-basierter Assay etabliert werden. Dazu wurden Spin Trapping Experimente mit ex vivo Detektion (Extraktion der generierten ROS in Ethylacetat) und in situ Detektion (direktes Messen bei der Entstehung) mit biologischen Proben (Mitochondrien, Mitoplasten und Zellen aus Zellkulturen) durchgeführt. Der in situ Assay schien geeigneter, allerdings waren die Radikalkonzentrationen nahe der Nachweisgrenze. Um dennoch eine zeitaufgelöste Auswertung der Daten zu ermöglichen und das Signal-Rauschen-Verhältnis zu verbessern, wurde zur Datenanalyse das Rauschen mit einer auf Singulärwertzerlegung basierten Methode gefiltert und zum Teil die zeitlichen Spuren der verschiedenen Radikaladdukte bestimmt. Eine weitere Methode zum Nachweis von UCP-2 auf die ROS-Homöostase ist die Verwendung fluoreszierender Double Spin Traps. Hier erlischt die zuächst vorhandene Fluoreszenz durch ROS-Einwirkung. Die Double Trap p-Nitrostilbentert.butylnitron sollte durch veränderte Substitution so modifiziert werden, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften verbessern. Beide Spin Traps wurden hinsichtlich optischer und ESR-spektroskopischer Eigenschaften sowie dem Verhalten in der Zelle verglichen. Da die Einführung eines Coumarinrestes als Fluorophor nicht zur erhofften Rotverschiebung der Anregungswellenlänge führt, aber die Cytotoxizität ausgeprägter ist, ist NSN geeigneter, zumal dessen Fluoreszenz deckungsgleich mit dem mitochondrialem Marker TMRE ist. Das spricht für Akkumulation an diesem wichtigen Entstehungsort von ROS. In Gegenwart von ROS zeigen beide Spin Traps ein ESR-Signal und auch das Löschen der Fluoreszenz aufgrund des nahe gelegenen stabilen Radikals. Bei NSN war der Effekt ausgeprägter: Die Halbwertszeiten des Fluoreszenzrückgangs wurden zu typischerweise 25 s in Anwesenheit von ROS-induzierenden Atmungsketteninhibitoren und 180 s in deren Abwesenheit bestimmt. Zusammenfassend kann mit den vorgestellten Spin Trapping Methoden der Einfluss von UCP-2 auf die ROS-Homöostase direkt gemessen werden, indem Zellen mit deletierter Expression von UCP-2 mit adäquaten Wildtypzellen verglichen werden. Mit NSN lässt sich ROS mittels Fluoreszenzmikroskopie mit subzellulärer Auflösung in Mitochondrien detektieren.