Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is a highly toxic and persistent organic pollutant, which is ubiquitously found in the environment. The prototype dioxin compound was classified as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. TCDD acts as a potent liver tumor promoter in rats, which is one of the major concerns related to TCDD exposure. There is extensive evidence, that TCDD exerts anti-estrogenic effects via arylhydrocarbon receptor (AhR)-mediated induction of cytochromes P450 and interferes with the estrogen receptor alpha (ERalpha)-mediated signaling pathway. The present work was conducted to shed light on the hypothesis that enhanced activation of estradiol metabolism by TCDD-induced enzymes, mainly CYP1A1 and CYP1B1, leads to oxidative DNA damage in liver cells. Furthermore, the possible modulation by 17beta-estradiol (E2) was investigated. The effects were examined using four different AhR-responsive species- and sex-specific liver cell models, rat H4II2 and human HepG2 hepatoma cell lines as well as rat primary hepatocytes from male and female Wistar rats. The effective induction of CYP1A1 and CYP1B1 by TCDD was demonstrated in all liver cell models. Basal and TCDD-induced expression of CYP1B1, which is a key enzyme in stimulating E2 metabolism via the more reactive formation of the genotoxic 4-hydroxyestradiol, was most pronounced in rat primary hepatocytes. CYP-dependent induction of reactive oxygen species (ROS) was only observed in rodent cells. E2 induced ROS only in primary rat hepatocytes, which was associated with a weak CYP1B1 mRNA induction. Thus, E2 itself was suggested to induce its own metabolism in primary rat hepatocytes, resulting in the redox cycling of catechol estradiol metabolites leading to ROS formation. In this study the role of TCDD and E2 on oxidative DNA damage was investigated for the first time in vitro in the comet assay using liver cells. Both TCDD and E2 were shown to induce oxidative DNA base modifications only in rat hepatocytes. Additionally, direct oxidative DNA-damaging effects of the two main E2 metabolites, 4-hydroxyestradiol and 2-hydroxyestradiol, were only observed in rat hepatocytes and revealed that E2 damaged the DNA to the same extent. However, the induction of oxidative DNA damage by E2 could not completely be explained by the metabolic conversion of E2 via CYP1A1 and CYP1B1 and has to be further investigated. The expression of low levels of endogenous ERalpha mRNA in primary rat hepatocytes and the lack of ERalpha in hepatoma cell lines were identified as crucial. Therefore, the effects of interference of ERalpha with AhR were examined in HepG2 cells, which were transiently transfected with ERalpha. The over-expression of ERalpha led to enhanced AhR-mediated transcriptional activity by E2, suggesting a possible regulation of E2 levels. In turn, TCDD reduced E2-mediated ERalpha signaling, confirming the anti-estrogenic action of TCDD. Such a modulation of the combined effects of TCDD with E2 was not observed in any of the other experiments. Thus, the role of low endogenous ERalpha levels has to be further investigated in transfection experiments using rat primary hepatocytes. Overall, rat primary hepatocyte culture turned out to be the more adaptive cell model to investigate metabolism in the liver, reflecting a more realistic situation of the liver tissue. Nevertheless, during this work a crosstalk between ERalpha and AhR was shown for the first time using human hepatoma cell line HepG2 by transiently transfecting ERalpha.
Photochemical reactions are of great interest due to their importance in chemical and biological processes. Highly sensitive IR/UV double and triple resonance spectroscopy in molecular beam experiments in combination with ab initio and DFT calculations yields information on reaction coordinates and Intersystem Crossing (ISC) processes subsequent to photoexcitation. In general, molecular beam experiments enable the investigation of isolated, cold molecules without any influence of the environment. Furthermore, small aggregates can be analyzed in a supersonic jet by gradually adding solvent molecules like water. Conclusions concerning the interactions in solution can be derived by investigating and fully understanding small systems with a defined amount of solvent molecules. In this work the first applications of combined IR/UV spectroscopy on reactive isolated molecules and triplet states in molecular beams without using any messenger molecules are presented. Special focus was on excited state proton transfer reactions, which can also be described as keto enol tautomerisms. Various molecules such as 3-hydroxyflavone, 2-(2-naphthyl)-3-hydroxychromone and 2,5-dihydroxybenzoic acid have been investigated with regard to this question. In the case of 3-hydroxyflavone and 2-(2-naphthyl)-3-hydroxychromone, the IR spectra have been recorded subsequent to an excited state proton transfer. Furthermore the dihydrate of 3-hydroxyflavone has been analyzed concerning a possible proton transfer in the excited state: The proton transfer reaction along the water molecules (proton wire) has to be induced by raising the excitation energy. However, photoinduced reactions involve not only singlet but also triplet states. As an archetype molecule xanthone has been analysed. After excitation to the S2 state, ISC occurs into the triplet manifold leading to a population of the T1 state. The IR spectrum of the T1 state has been recorded for the first time using the UV/IR/UV technique without using any messenger molecules. Altogether it is shown that IR/UV double and triple resonance techniques are suitable tools to analyze reaction coordinates of photochemical processes.
Es ist bekannt, dass die Genese von Darmerkrankungen von der aufgenommenen Nahrung beeinflusst wird. Der Genuss von Apfelprodukten mit hoher antioxidativer Wirksamkeit könnte daher zur Prävention ROS-assoziierter Erkrankungen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von polyphenolreichen Extrakte aus Apfelsaft (AE01–AE07), Tresterextraktionssaft (AE03B, AE06B) und Apfelschalen (GS, PE) sowie von Polyphenolen auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Caco-2 Zellen. Zur Annäherung an die in vivo-Situation wurden mit Darmbakterien fermentierte Apfelsaftextrakte/Trub in die Untersuchungen einbezogen, dabei entstehende Abbauprodukte wurden charakterisiert und ebenfalls geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level, GSH-Spiegel und SOD1-Expression. Zusätzlich wurde die zellfreie antioxidative Kapazität (ORAC/TEAC) erfasst. Die antioxidative Kapazität aller Extrakte war hoch und korrelierte mit dem Gehalt an Polyphenolen bzw. Procyanidinen. Der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch AE07 und GS reduziert, während AE05, AE06B und GS den besten Schutz vor oxidativen DNA-Schäden boten. Eine Erhöhung des tGSH-Spiegels konnte durch Inkubation mit AE06, AE07, GS und PE erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass vor allem Flavonol/Procyanidin-reiche Extrakte eine gute protektive Wirksamkeit aufweisen. Die fermentierten Extrakte zeigten eine deutliche antioxidative Wirksamkeit, was vor allem den identifizierten phenolischen Abbauprodukten zugeschrieben werden konnte, die fast alle eine ausgeprägte Wirksamkeit im zellfreien und zellulären System zeigten. Es ist nicht auszuschließen, dass auch andere Komponenten (wie z.B. SCFA) zur protektiven Wirksamkeit fermentierter Extrakte beitragen könnten. Der fermentierte Trub erwies sich in den Untersuchungen als unwirksam, da in ihm keine Polyphenole identifiziert werden konnten. Weiterhin wurden auch Polyphenol-vermittelte prooxidative Effekte untersucht, für die sich neben einer starken Strukturabhängigkeit die Wahl des verwendeten Mediums als entscheidender Faktor für die beobachtete H2O2-Bildung erwies. Es wurden keine adversen Effekte auf zelluläre Marker beobachtet, vielmehr könnte die Wirksamkeit der Polyphenole durch geringe Mengen an ROS unterstützt werden, da diese die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren. Insgesamt erwiesen sich phenolische Extrakte aus Apfelbestandteilen als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzellen. In begleitenden Untersuchungen mit Einzelstoffen wurden Polyphenole identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Extrakte beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass die protektive Wirksamkeit von Extrakten und Inhaltsstoffen trotz intestinalen Abbaus persistiert und dass eine moderate prooxidative Wirksamkeit der Polyphenole in Zellen einen günstigen Einfluss auf deren antioxidative Abwehr ausüben kann.
Der Kernrezeptor PXR spielt eine bedeutende Rolle im Fremdstoffmetabolismus als auch im Stoffwechsel endogener Substrate. Er reguliert die Expression zahlreicher Proteine des Fremdstoffwechsels. Deshalb hat die Aktivierung oder Hemmung des PXR einen großen Einfluss auf den Stoffwechselstatus dieser Proteine. Zum derzeitigen Stand der Forschung nimmt der PXR eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der CYP3A-Enzyme ein. Es besteht deshalb Interesse Substanzen, die in Verdacht stehen PXR abhängig CYP3A zu induzieren, zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden bromierte Flammschutzmittel und der Arzneimittelkandidat EMD untersucht. Aus den Vorversuchen wurde ersichtlich, dass die Rattenhepatomzelllinie H4IIE und die humane Hepatomzelllinie HepG2 geeignete in vitro Systeme zur Untersuchung der PXR-abhängigen CYP3A-Aktivierung darstellen. Untersuchungen zum Genexpressionsverhalten zahlreicher Gene des Fremdstoffmetabolismus mittels TLDA-Karten zeigten, dass die beiden Zelllinien viele dieser Gene exprimieren, die nach Inkubation mit den Prototypinduktoren Rifampicin und Dexamethason spezies-spezifisch reguliert wurden. Die beiden Zelllinien wurden schließlich mit einem Reportergenvektor, der die PXR responsiven Elemente des CYP3A4-Gens enthält, stabil transfiziert. An den stabil transfizierten HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen wurden bekannte CYP-Induktoren sowie der Arzneimittelkandidat EMD und die Flammschutzmittel HBCD and der pentaBDE Mix getestet. Die Flammschutzmittel HBCD und der pentaBDE-Mix, werden in Textilwaren, Kunststoffen, Möbeln, Teppichen, Elektrogeräten und Baumaterialen eingesetzt. Falls sie tatsächlich den PXR spezies-spezifisch aktivieren sollten, könnten sie eine Gefahr für Mensch und Umwelt darstellen. Deshalb wurde in dieser Arbeit die CYP3A-mRNA-Expression, die Protein- sowie die Reportergenaktivität überprüft. Als gemeinsamer Aktivator des hPXR und rPXR stellte sich Clotrimazol, aber auch das Flammschutzmittel HBCD heraus, während pentaBDE ein besserer Ligand des hPXR ist. Omeprazol und Phenobarbital induzierten die rPXR-vermittelte CYP3A-Induktion in H4IIE-XREM3-Zellen nicht; in den humanen HepG2-XREM3-Zellen konnte jedoch eine moderate Reportergenaktivität gemessen werden. Weiteres Interesse besteht an dem Arzneimittelkandidaten EMD zur Behandlung des metabolischen Syndroms und Typ II-Diabetes. In vivo (Affen, Ratten) und in vitro (Hepatozyten) wurden bereits spezies-spezifische Effekte auf die CYP3A-Induktion durch EMD beobachtet. Deshalb wurde in dieser Arbeit der über aktivierten PXR vermittelte Mechanismus an Zelllinien überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass EMD ein hPXR-Aktivator und CYP3A-Induktor in HepG2-Zellen, jedoch kein Aktivator von rPXR in H4IIE-Zellen ist. Um schwerwiegende Nebenwirkungen und unvorhersehbare Arzneimittelwechselwirkungen durch die Aufnahme von Fremdstoffen zu verhindern, ist es bei der Neuentwicklung von Wirkstoffen aller Art notwendig, die Stoffe auf eine mögliche Induktion der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme zu untersuchen. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Etablierung von zell-basierten in vitro Assays zur Ermittlung der spezies-spezifischen PXR-abhängigen Induktion von CYP3A durch Chemikalien und Arzneimittelkandidaten, um mögliche Arzneimittel- und Fremdstoffwechselwirkungen und damit verbundene Sicherheitsrisiken vorhersagen zu können. Das etablierte PXR- Screeningsystem repräsentiert zwei in vitro Modelle, die erlauben spezies-spezifische Wirkungen auf die CYP3A-Induktion von Chemikalien, Umweltkontaminanten, Lebensmittelinhaltsstoffe und Arzneimittel schnell, einfach und kostengünstig abschätzen zu können. Eine frühe Erkennung der PXR-Aktivierung und CYP-Induktion von Arzneimitteln in der Entwicklung kann einen Weiterentwicklungsstopp dieser zur Folge haben. Dies hilft zusätzliche Tierversuche und Kosten einzusparen. Dem 3R-Prinzip (Reduce, Refine, Replace) vom Reduzieren der Anzahl der Tierversuche, der Verbesserung der existierenden Experimente und dem Ersetzen von Tierversuchen durch alternative Methoden (Russel & Burch, 1959) wird durch die stabil transfizierten Zelllinien in zweierlei Hinsicht Rechnung getragen: unnötige Tierversuche können vermieden reduction und die Aussagekraft von durchgeführten Tierstudien (z.B. vom Gesetzgeber geforderte Studien zur Arzneimittelentwicklung) verbessert werden (dies trägt auch zu einem refinement bei). Damit stellen die HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen eine wichtige innovative Verbesserung bei der Entwicklung von Arzneistoffen sowie bei der regulatorischen Testung von Chemikalien dar.
Das aktuelle Design von Wirkstoffen ist fokussiert auf die Entwicklung von Molekülen, die das Tumorzellwachstum durch Inhibition mehrerer Signalwege unterdrücken können. Indirubin wurde als Hauptwirkstoff von Dangui Longhui Wan, einem Mittel der Traditionellen Chinesischen Medizin identifiziert, welches in China zur Behandlung vieler Krankheiten wie Leukämie benutzt wurde. Indirubine wurden als potente ATP-kompetitive CDK-Inhibitoren identifiziert, die in der ATP-Bindungstasche binden, Apoptose induzieren und das Wachstum von Tumorzellen effizient hemmen. Darüber hinaus zeigten Indirubin-Derivate Hemmwirkungen auf eine ganze Reihe anderer Kinasen wie z. B. GSK-3ß, VEGFR und c-Src, die beim Tumorzellwachstum eine entscheidende Rolle spielen. Ziel war es, Substituenten am Indirubingrundgerüst in die 5-, 5’- und 3’-Position einzuführen, um die Wasserlöslichkeit weiter zu verbessern, die metabolische Stabilität zu erhöhen, ohne jedoch Antitumorwirksamkeit abzuschwächen. Durch Einführung weiterer N-Atome in das Indirubingrundgerüst sollten CYP450-induzierte Hydroxylierungen am Kern vermieden werden, die zur Wirkungsabschwächung führten, wie frühere Arbeiten gezeigt haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 neue Indirubin-Derivate und 3 neue Aza- und Diazaindirubine hergestellt und mittels CHN-Analyse und NMR-spektroskopisch charakterisiert. Für das bei der Kondensation zu 7-Aza- und 7,7’-Diazaindirubin benötigte 7-Azaisatin wurde eine neue Synthesemethode entwickelt. Die Wasserlöslichkeit der neuen Indirubine wurde photometrisch und ihre Zytotoxizität mit Hilfe von SRB-Assays an LXFL529L-Tumorzellen bestimmt. Durch Inkubation mit Rinderlebermikrosomen wurde der Phase-I-Metabolismus von Indirubin-5- carboxamiden und Indirubin-3’-oximethern untersucht. Die Hauptmetaboliten von E748, E857, E857a, E860 und E860a wurden mittels HPLC, HPLC-NMR und LC-MS/MS identifiziert. Weitere Untersuchungen zum Wirkmechanismus ausgewählter neuer Verbindungen, wie z. B. die Hemmung von Topoisomerasen und die Erstellung eines Hemmprofils an 30 verschiedenen Kinasen wurden durch andere Institute durchgeführt. Im Vergleich zu Indirubin-5-carboxamiden zeigen Indirubin-5’-carboxamide mit gleichem Substituenten eine 2 – 15 fache schwächere Wachstumshemmung an LXFL529L-Zellen und trotz basischem Zentrums auch keine signifikant verbesserte Wasserlöslichkeit. 5,5’-Disubstituierte Indirubine mit Carboxyl- oder Carboxamid- Gruppe als Substituent zeigten sogar bis zu einer Konzentration von 100 μM keine Hemmwirkung mehr. Eine Erklärung hierfür könnte der knapp bemessene Raum der ATP-Bindungstasche im Bereich der 5’-Position sein. Die Oximether E857 und E860, sowie die Hydrochloride E857a und E860a zeigten eine sehr potente Proliferationshemmung an LXFL529L-Zellen mit IC50-Werten von ca. 1 μM. Die Hydrochloride wiesen hervorragende Werte für die Wasserlöslichkeit mit über 25000 mg/L auf, so dass in vivo Applikationen ohne weitere Formulierungen durchführbar sind. 7,7’-Diazaindirubin (E864) zeigte eine äußerst potente Wachstumshemmung von humanen Tumorzellen. Die IC50-Werte im SRB-Assay von E864 lagen im unteren nanomolaren Bereich an verschiedenen Tumorzellen. 7-Azaindirubin (E866) zeigte im Vergleich mit Indirubin eine erhöhte Wasserlöslichkeit und verbesserte antiproliferative Wirkung, insbesondere löst es sich in vielen organischen Lösungsmitteln. E865 ist das 7’-Aza-Analoge von E857, einem 3’-Oximether mit basischen Zentrum und zeigt 7-fach verbesserte Wasserlöslichkeit ohne Abschwächung der Hemmwirkung an der Tumorzelllinie LXFL529L. Ergebnisse des Kinaseprofilings ergaben jedoch, dass die ATP-Bindungsstelle von Proteinkinasen vermutlich nicht das Haupttarget dieser Wirkstoffe sind. Beim Testen von 277 Proteinkinasen konnte keine Proteinkinase als Target für E864, dem potentesten Inhibitor der Tumorzellproliferation, identifiziert werden. Bei Inkubationen mit Rinderlebermikrosomen von E748, einem Indirubin-5- carboxamid, fand eine Hydroxylierung an der 7’-Position statt. Weil eine Hydroxylierung an dieser Position eine Bindung des Moleküls in der ATP-Bindungstasche erschwert oder verhindert, ist der Metabolit vermutlich ein schwächerer Tumorzellwachstumsinhibitor. Zur Vermeidung einer derartigen Hydroxylierung erschien es sinnvoll, die Substituenten zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit in 3’-Position anzubringen, was die Ergebnisse der Metabolisierung von E857 und E857a bestätigten. Nach Inkubation mit Lebermikrosomen fanden die Metabolisierungen nicht am Indirubin-Gerundgerüst statt. Als Hauptmetaboliten konnten das N-oxid (E867) und ein Hydroxymethylpiperazin-Derivat identifiziert werden. Das Kinaseprofiling, das Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus ermöglicht, zeigte, dass E857 nicht nur CDKs und GSK-3ß hemmt (IC50 = 1-10 μM), sondern auch andere für eine Tumorentstehung relevante Targets wie z. B. FAK und IGF1-R (IC50 < 1 μM). Damit scheinen E857 und E857a die bisher am besten geeigneten Indirubine für eine Weiterentwicklung zum Antitumortherapeutikum zu sein und weitere Untersuchungen sollen in vivo durchgeführt werden, um die Ergebnisse mit den in vitro-Daten zu vergleichen und abzusichern.
Motivation dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von Katalysatoren zur selektiven Dimerisierung von 1-Hexen zu n-Dodecen und zu möglichst wenig verzweigten Produkten. Untersucht wurden die Zeolithe Y, L und ZSM-12 sowie die Silicoalumophosphate SAPO-5, SAPO-11, SAPO-31 und SAPO-41. Für die BrØnsted-aciden Katalysatoren ist festzuhalten: Alle hergestellten Zeolithe, das heißt H-Y, H-L und H-ZSM-12, verfügten über starke acide Zentren. Zeolith H-L erwies sich ebenfalls als sehr aktives Material. Die Selektivitäten zu den Zielprodukten waren bei vergleichbaren Umsätzen etwas höher als bei Verwendung von H-Y, was für einen schwachen formselektiven Effekt spricht. An Zeolith H-ZSM-12 wurden nur geringe Umsätze erzielt. Für die Silicoalumophosphate wurde gefunden: Alle verfügen über acide Zentren, welche jedoch etwas schwächer waren als die der BrØnsted-aciden Zeolithe. Um vergleichbare Umsätze wie an den Zeolithen zu erzielen, waren daher höhere Reaktionstemperaturen oder längere Reaktionszeiten erforderlich. H-SAPO-5 zeigte dabei eine gegenüber H-L erhöhte Selektivität zu den Zielprodukten, vermutlich aufgrund der etwas engeren Poren. H-SAPO-11, H-SAPO-31 und H-SAPO-41 zeigten trotz vorhandener und zugänglicher acider Zentren nur vernachlässigbare Umsätze. Analog zu Zeolith H-ZSM-12 wird dies auch hier auf die zu engen Poren zurückgeführt, welche die Bildung des Übergangszustandes offensichtlich nicht zulassen. Wurde Nickel in die Katalysatoren eingebracht, zeigten sich Unterschiede, die vor allem von der Präparationsmethode abhängen. Durch verschiedene Methoden gelang es, Katalysatoren herzustellen, die eine hohe Selektivität entweder zu n-Dodecen oder zu einfach verzweigten Dodecenen aufwiesen. Durch Ionenaustausch mit Nickelacetat in wässriger Lösung wurden Ni-Y, Ni-L und NiH-SAPO-5 hergestellt. Diese Materialien verfügten wahrscheinlich über Nickel auf Kationenpositionen. Sie zeigten eine gegenüber der sauren Form deutlich erhöhte Selektivität zu den Zielprodukten, der Effekt nahm in der Reihe Ni-Y < Ni-L < NiH-SAPO-5 zu. Analog zu den Resultaten an H-Y, H-L und H-SAPO-5 lässt sich dies mit einer zunehmenden Formselektivität durch das Porensystem der Katalysatoren begründen. Bei Ni-Y und NiH-SAPO-5 ließen sich mittels Temperaturprogrammierter Reduktion zwei verschiedene Nickelspezies nachweisen, die sich vermutlich durch die ihre Position in Gitter unterscheiden und dadurch eine unterschiedliche Stabilisierung gegenüber einer Reduktion erfahren. Wurde bei Ni-Y und NiH-SAPO-5 die jeweils leichter zu reduzierende Nickelspezies mit Wasserstoff reduziert, zeigten die so behandelten Katalysatoren eine stark verringerte Aktivität in der Katalyse. Dies ist in Einklang mit dem vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus, der von Ni(I) als aktiver Spezies ausgeht (welche durch eine Autoreduktion von Ni(II) während der Aktivierung des Katalysators erzeugt werden): Wird Nickel durch den Träger sehr stark stabilisiert, ist keine Autoreduktion mehr möglich und somit die Aktivität des Katalysators sehr gering. NiH-SAPO-5 wurde mit verschiedenen Siliciumanteilen hergestellt, was das Einbringen verschiedener Mengen an Nickel durch Ionenaustausch erlaubte. Hierbei zeigte sich, dass die Selektivität zu den Zielprodukten mit dem Nickelgehalt zunimmt und durch Verwendung eines H-SAPO-5 mit xSi = 0,20 (und damit hoher Ionenaustauschkapazität) bis zu 89 % Selektivität zu C12-Isomeren erreicht werden können, wobei diese je etwa zur Hälfte aus n-Dodecen und zur Hälfte einfach verzweigte Dimeren bestanden. Sollten bevorzugt einfach verzweigte Dodecene hergestellt werden, so war es durch Festkörperreaktion des BrØnsted-aciden Trägers mit Nickelacetat möglich, einen Katalysator zu präparieren, der keine linearen Produkte lieferte und bei geeignetem Nickelgehalt eine hohe Selektivität zu einfach verzweigten Dimeren aufwies. Dieser Effekt ist nur wenig vom Porensystem des Trägers, jedoch stark von dessen Ionenaustauschkapazität abhängig. Je höher diese ist, umso höher ist auch die Selektivität des resultierenden Katalysators. Wie TPD-Messungen mit 1-Aminopentan und Ammoniak als Sondenmoleküle zeigten, besaßen die so präparierten Materialien keine sauren Zentren mehr. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass es durch geeignete Wahl der Präparationsmethode und der Porengeometrie möglich ist, Katalysatoren zu erhalten, die entweder zur Herstellung von n-Dodecen oder zu überwiegend wenig verzweigten C12-Isomeren geeignet sind. Überraschenderweise, gelang es außerdem, mit dem gleichem Trägermaterial Katalysatoren herzustellen, welche kein n-Dodecen liefern, aber eine sehr hohe Selektivität zu einfach verzweigten C12-Isomeren besitzen. Vor allem anhand von NiH-SAPO-5 konnte weiterhin belegt werden, dass die Kombination aus geeigneter Porengeometrie und Nickel eine geeignete Methode zur Herstellung von Katalysatoren für die selektive Dimerisierung von 1-Hexen zu n-Dodecen ist.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Cobalt(II)-Komplexe mit Akzeptor-substituierten β-Diketonat-abgeleiteten Liganden geeignete Reagenzien sind, um molekularen Sauerstoff effektiv zu aktivieren und zur stereoselektiven Synthese β-hydroxylierter Tetrahydrofurane aus 1-substituierter Bishomoallylalkoholen zu verwenden. Die Reaktionen verliefen hoch diastereoselektiv (cis:trans < 1:99) und lieferten 2,5-trans-konfigurierte 2-Hydroxymethyltetrahydrofurane. Reaktivität und Selektivität waren abhängig von Solvens, Temperatur, Katalysatormenge und -konzentration, O2-Druck sowie Substitutionsgrad an den reaktiven Teilstrukturen, d. h. der olefinischen Doppelbindung und der Hydroxylgruppe. Es konnten Beiträge präparativer und mechanistischer Art geleistet werden, die einerseits zu einem vertieften Verständnis der Gesamtreaktion und andererseits zu einer weiteren Anwendung der Cobalt(II)-katalysierten Oxidation von Alkenolen führten. In präparativer Hinsicht wurde zunächst eine verbesserte Methodik entwickelt, um Alkenoloxygenierungen in einer stationären O2-Atmosphäre ohne Substrat- und Produktverlust durchzuführen. Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen bezüglich der oben genannten Parameter wurde die aerobe Oxidation von 2,2-Dimethyl-6-hepten-3-ol im Detail untersucht. Hierbei wurden unter Verwendung der Kombination aus Lösungsmittel iPrOH, 60 °C, c0 (CoIIKat.) = 1.25 ´ 10–2 M und 1 bar O2-Druck die höchsten Ausbeuten an Zielmolekül [5-(tert-Butyl)tetrahydrofur-2-yl]methanol (63–64 %) erzielt. Präparativ interessante Ausbeuten (53–66 %) an β-hydroxylierten Tetrahydrofuranen konnten ebenfalls für die Oxidation von 4-Phenylpent-4-en-1-ol sowie von (E)- und (Z)-konfigurierten Methyl- und Phenyl-substituierten Bishomoallylalkoholen unter Anwendung der optimierten Bedingungen erzielt werden. Die erhaltene 2,5-trans-Selektivität und die Diastereoselektivität in der Seitenkette waren hierbei unabhängig – die Reaktivität und Produktselektivität dagegen abhängig – von den Substituenten und der ursprünglichen Konfiguration der π-Bindung. Im Zusammenhang mit mechanistischen Fragenstellungen gelang zum ersten Mal eine nahezu vollständige Massenbilanzierung bei aeroben Oxidationen 1-substituierter Bishomoallylalkohole. Hierbei wurden Verbindungen, deren Bildung auf reduktive Cyclisierungen, C,C-π-Bindungsspaltungen, Dehydrierungen sowie Alken-Hydratisierungen und -Reduktionen zurückgeführt wird, als Nebenprodukte identifiziert und quantifiziert. Zudem konnte eine Umkehr der Produktselektivität zugunsten der Bildung von 2-Methyl-, 2-Ethyl- und 2-Benzyl-substituierten 2,5-trans-Tetrahydrofuranen nach Durchführung der Reaktion in einem Gemisch aus Cyclohexa-1,4-dien und Benzol [50:50 (v/v)] erreicht werden. Darüber hinaus gelang eine Quantifizierung von Wasser und Aceton, den Redoxkoppelprodukten aerober Alkenoloxidationen in Isopropanol. Dabei korrelierten die ermittelten Acetonmengen mit der Bildung der 2-Hydroxymethyltetrahydrofurane und die des Wassers mit dem Reaktionsumsatz. Basierend auf den erhaltenen Daten und unter Berücksichtigung vorliegender Informationen über ähnliche Umsetzungen aus der Literatur wurde ein mechanistischer Vorschlag für den Reaktionsverlauf Cobalt(II)-katalysierter Oxidationen von Bishomoallylalkoholen entworfen, welcher die Bevorzugung des 5-exo-Ringschlusses und die beobachteten Selektivitäten erklärt. Hierbei wurde das Auftreten eines Tetrahydrofurylalkylradikals als zentrale Zwischenstufe postuliert, welches durch Heteroatomdonoren oder durch Alkene zu 1/1-Addukten abgefangen werden könnten. Aufgrund der hohen Stereoselektivität des vorangegangenen Ringschlusses würde eine Anwendung der Methode insbesondere in der Naturstoffsynthese ganz neue Perspektiven eröffnen.
Der Entkopplermechanismus von UCP-2 sollte weitergehend untersucht sowie eine Methode zur Messung des Einfluss von UCP-2 auf die ROS-Homöostase gefunden werden. Durch Kompetitionsmessungen mit spinmarkierten Fettsäuren an rekonstituiertem UCP-2 sollte das Flip Flop Modell als Entkopplungsmechanismus weiter unterstützt und Bindungskonstanten abgeschätzt werden. Dies sollte in Titrationsmessungen mit kompetitierenden Fettsäuren und Purinnucleotiden gezeigt und mit Messungen in Gegenwart eines Kontrollproteins ohne Fettsäurebindungsstelle verglichen werden. Es konnte allerdings kein substöchiometrischer Verdrängungseffekt mit den Fettsäuren oder ATP gezeigt werden. Deswegen wurde der Einfluss des Detergens sowie der Ionenstärke auf das ESR-Signal untersucht und das Vorhandensein hochimmobilisierter spektraler Komponenten, typisch für die Einlagerung in eine Bindungsstelle, auch in Abwesenheit von UCP-2 gefunden. Um einen potenziellen Einfluss von UCP-2 auf die Homöostase von ROS zeigen zu können, sollte ein ESR-basierter Assay etabliert werden. Dazu wurden Spin Trapping Experimente mit ex vivo Detektion (Extraktion der generierten ROS in Ethylacetat) und in situ Detektion (direktes Messen bei der Entstehung) mit biologischen Proben (Mitochondrien, Mitoplasten und Zellen aus Zellkulturen) durchgeführt. Der in situ Assay schien geeigneter, allerdings waren die Radikalkonzentrationen nahe der Nachweisgrenze. Um dennoch eine zeitaufgelöste Auswertung der Daten zu ermöglichen und das Signal-Rauschen-Verhältnis zu verbessern, wurde zur Datenanalyse das Rauschen mit einer auf Singulärwertzerlegung basierten Methode gefiltert und zum Teil die zeitlichen Spuren der verschiedenen Radikaladdukte bestimmt. Eine weitere Methode zum Nachweis von UCP-2 auf die ROS-Homöostase ist die Verwendung fluoreszierender Double Spin Traps. Hier erlischt die zuächst vorhandene Fluoreszenz durch ROS-Einwirkung. Die Double Trap p-Nitrostilbentert.butylnitron sollte durch veränderte Substitution so modifiziert werden, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften verbessern. Beide Spin Traps wurden hinsichtlich optischer und ESR-spektroskopischer Eigenschaften sowie dem Verhalten in der Zelle verglichen. Da die Einführung eines Coumarinrestes als Fluorophor nicht zur erhofften Rotverschiebung der Anregungswellenlänge führt, aber die Cytotoxizität ausgeprägter ist, ist NSN geeigneter, zumal dessen Fluoreszenz deckungsgleich mit dem mitochondrialem Marker TMRE ist. Das spricht für Akkumulation an diesem wichtigen Entstehungsort von ROS. In Gegenwart von ROS zeigen beide Spin Traps ein ESR-Signal und auch das Löschen der Fluoreszenz aufgrund des nahe gelegenen stabilen Radikals. Bei NSN war der Effekt ausgeprägter: Die Halbwertszeiten des Fluoreszenzrückgangs wurden zu typischerweise 25 s in Anwesenheit von ROS-induzierenden Atmungsketteninhibitoren und 180 s in deren Abwesenheit bestimmt. Zusammenfassend kann mit den vorgestellten Spin Trapping Methoden der Einfluss von UCP-2 auf die ROS-Homöostase direkt gemessen werden, indem Zellen mit deletierter Expression von UCP-2 mit adäquaten Wildtypzellen verglichen werden. Mit NSN lässt sich ROS mittels Fluoreszenzmikroskopie mit subzellulärer Auflösung in Mitochondrien detektieren.
Das zelluläre Uhrwerk der circadianen Rhythmik enthält eine autoregulatorische negative Feedbackschleife. Dabei induzieren am Beginn des circadianen Rhythmus die heterodimeren Komplexe aus CLOCK- und BMAL1-Proteinen die Transkription ihrer Zielgene, darunter auch die der Period- (PER) und Cryptochrom- (CRY)-Gene. Am Ende des circadianen Rhythmus inhibieren die CRY- und PER-Proteine die CLOCK/BMAL1-gesteuerte Transkription. Die durch Sauerstoffmangel gesteuerte Regulation der Transkription wird durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) reguliert, von denen HIF-1α eine besondere Rolle bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen spielt. Im Schlaf, d.h. in der circadianen Nachtphase ändert sich die funktionelle Organisation der Atmung grundlegend und es kommt zu einer leichten Reduktion des Sauerstoffpartialdruckes und das Auftreten hypoxischer Perioden wird begünstigt, was auf einen Zusammenhang zwischen circadianer Rhythmik und Hypoxie-gesteuerter Transkription hindeutet. Daher wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welchen Einfluss die circadianen Proteine CRY1 und PER1 auf HIF-1α und die HIF-1 regulierte Transkription haben. Es konnte die Interaktion zwischen den circadianen Proteinen CRY1 und PER1 mit HIF-1α erstmalig in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Die HIF-1α-Proteinregion in der sich die basic-Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Domäne befindet und die C-terminale tail-Region des CRY1-Proteins konnten als verantwortliche Proteindomänen für die Interaktion zwischen CRY1 und HIF-1α identifiziert werden. Die Interaktion von HIF-1α mit PER1 erfolgte ebenso über die bHLH Domäne des HIF-1α-Proteins. Die CRY1-HIF-1α-Interaktion beeinflusste die transkriptionelle Aktivität von HIF-1α negativ und verringerte die Expression von HIF-1-Targetgenen, wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1). Darüberhinaus konnte mit CRY- und PER-defizienten Zellen gezeigt werden, dass CRY1 und PER1 unabhängig von der Interaktion mit HIF-1α auch eine Repression der HIF-1α-mRNA-Expression und der HIF-1α-Promotoraktivität verursachen. Diese Daten zeigen, dass die Regulation der Transkription durch Hypoxie durch die negativen Regulatoren der circadianen Rhythmik beeinflusst werden kann. Diese Befunde könnten somit zum besseren Verständnis bestimmter Krankheiten, wie der Tumorigenese oder dem Schlaf-Apnoe-Syndrom beitragen. Da HIF-1α ein wichtiger Faktor in der Tumorigenese ist, der durch Veränderungen im Redoxzustand der Zellen beeinflusst wird und dabei möglicherweise mitochondriale ROS, die einem circadianen Rhythmus unterliegen, eine wichtige Rolle spielen, wurde untersucht, inwiefern eine Erhöhung der mitochondrialen ROS-Spiegel durch Defizienz der MnSOD tumorprogressiv ist. Die MnSOD wird als eines der wichtigsten intrazellulären antioxidativen Enzyme angesehen und soll eine Rolle als Tumorsuppressor spielen. Mittels Microarraytechnologie wurde die differentielle Genexpression in den Lebern der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Mäuse untersucht. Es konnte die Repression von vielen Genen gefunden werden, deren Produkte eine wichtige Rolle in der Abwehr gegen oxidativen Stress, der Krebsabwehr und der Hemmung der Apoptose spielen. Auf der anderen Seite konnte die Überexpression vieler Indikatoren für oxidativen Stress festgestellt werden. Desweiteren konnte die Induktion von nur zwei Genen, die eine Rolle in der Abwehr gegen den oxidativen Stress spielen gemessen werden, so dass insgesamt nur ein geringer kompensatorischer Effekt auf die MnSOD-Defizienz erreicht wird. Ein Vergleich der differentiell exprimierten Gene in der Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Maus mit differentiell exprimierten Genen aus unter Hypoxie inkubierten bzw. HIF-1α-dominant-aktiven arteriellen Endothelzellen brachte keine Überschneidungen und zeigt, dass die höheren ROS-Level in den MnSOD-defizienten Hepatozyten die Hypoxie nicht imitieren bzw. nicht zu einer Expression von HIF-1-Targetgenen führen. Die MnSOD-defizienten Lebern waren auch anfälliger für die Entwicklung von hepatozellulären präneoplastischen Läsionen nach Induktion durch eine Einzeldosis Diethylnitrosamin (DEN). Die Anzahl der präneoplastischen Herde und die Bildung von Adenomen war im Vergleich zu den Wildtyptieren bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD-defizienten Tieren signifikant erhöht. Diese Daten zeigten, dass die Entstehung von präneoplastischen Läsionen und Tumoren unter Einwirkung von karzinogenen Substanzen bei den Hepatozyten-spezifischen MnSOD(-/-)-Mäusen mit einer stark erhöhten Rate im Vergleich zu den Wildtyptieren auftritt. Damit konnte die Rolle der MnSOD als Tumorsuppressor zumindest für die Leber bestätigt bzw. direkt aufgezeigt werden.
The enamide moiety is an important substructure often encountered in biologically active compounds and synthetic drugs. Furthermore, enamides and their derivatives are versatile synthetic intermediates for polymerization, [4+2] cycloaddition, crosscoupling, Heck-olefinination, Halogenation, enantioselective addition or asymmetric hydrogenation. Traditional syntheses of this important substrate class involve rather harsh reaction conditions such as high temperatures and/or the use of strong bases. In continuation of our work on the addition of secondary amides to alkynes, we have developed a broadly applicable protocol for the catalytic addition of N-nucleophiles such as primary amides, imides and thioamides to terminal alkynes. The choice of ligands and additives determines the regiochemical outcome so that with two complementary catalyst systems, both the E-anti-Markovnikov products and the Z-anti-Markovnikov products can be synthesized highly regio- and stereoselectively.