Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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Molekulardynamische Simulation chiraler flüssigkristalliner Phasen Im Rahmen der Arbeit wird erstmals die Polymorphie chiraler flüssigkristalliner Phasen mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen untersucht. Am Beispiel des Modellsystems des chiralen Gay-Berne-Fluids, das bisher ausschließlich mittels Monte Carlo-Simulationen untersucht wurde, wird das Phasendiagramm in Abhängigkeit von Temperatur und Druck bestimmt. Ein Ziel ist insbesondere die Untersuchung der dynamischen Selbstdiffusionseigenschaften in chiralen Phasen in Abhängigkeit von Temperatur und Druck. Im Fall der im Mittelpunkt der Untersuchung stehenden cholesterischen Phase werden die Zusammenhänge zwischen Selbstdiffusionseigenschaften und Gleichgewichtshelixganghöhe beziehungsweise Ordnungsparameter bestimmt.
Die Ausschaltung autoantigener Immunzellen ist das Prinzip der antigenspezifischen Immunsuppression, einer erfolgversprechenden Methode zur Therapie von Autoimmunerkrankungen. Im Fall der Myasthenia gravis, bei der die Autoimmunreaktion gegen den nikotinischen Acetylcholinrezeptor (AChR) gerichtet ist, wurden Konjugate aus dem kompletten AChR und dem ribosomen-inaktivierenden Toxin Gelonin in in vivo Versuchen eingesetzt [Urbatsch et al., 1993; Brust et al., 1987]. Urbatsch und Brust gelang die Therapie von Ratten, bei denen sie die experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) ausgelöst hatten, durch Applikation dieser Konjugate. Zur Vermeidung unerwünschter Immunreaktionen gegen pathologisch irrelevante Teile des AChR, wurde die humane +- -Untereinheit, sowie der extrazelluläre Teil, in dessen Bereich die hauptantigene Determinante liegt, in E. coli exprimiert [Rousselle, 1996]. Allerdings konnten diese Peptide nur in denaturierter, unlöslicher Konformation als inclusion bodies erhalten werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolierung von AChR-Gelonin-Konjugaten aus nativen, gefalteten Rezeptor-Fragmenten und deren in vivo Einsatz zur Therapie der EAMG in Lewis-Ratten. Zur Induzierung der EAMG wurde der nikotinische AChR aus dem elektrischen Organ des Zitterrochens, Torpedo californica (T-AChR) isoliert und in fünf Lewis-Ratten eingesetzt. Der Verlauf der EAMG, wie auch die spätere Therapie mit den Konjugaten, sollte elektrophysiologisch mit Hilfe der repetitiven Serienstimulation verfolgt werden. Bei den Ratten konnte durch diese Methode eine pathologische Reduzierung der funktionstüchtigen AChR nachgewiesen werden. Zur Isolierung nativ gefalteter AChR-Fragmente wurde die Koexpression des Chaperoninsystems GroEL/GroES mit verschiedenen AChR-Fragmenten durchgeführt. Nur mit dem Plasmid polsi HE706 gelang es das AChR-Fragment zu exprimieren. Da das Fragment +- HE706 aber ausschließlich in Form von inclusion bodies detektiert wurde, muß die Koexpression mit dem Chaperonin-Komplex GroEL/GroES zur nativen Faltung des Proteins, als gescheitert angesehen werden. Da keine nativ gefalteten AChR-Fragmente isoliert werden konnten, stellte Prof. Dr. A. Maelicke (Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie, Mainz) freundlicherweise das rekombinante T-AChR1-209-Fragment zur Verfügung. Die hohe Aggregationsbereitschaft, die negative Reaktion mit konformellen Antikörpern und Schwierigkeiten das Protein aufzukonzentrieren, wiesen auf die unvollständige Faltung des T-AChR1-209 hin. Die Synthese des T-AChR1-209-Gelonin-Konjugates sollte mit dem Kopplungsreagenz BMME (Bis-( maleimido)-methylether) unter Ausbildung einer Thioetherbrücke erfolgen. Dabei ist es notwendig in beide Proteine, durch Modifikation mit 2-Iminothiolan, Thiolgruppen einzuführen. Da die Modifizierung des T-AChR1-209 scheiterte, sollte die Thioetherbrücke mit dem Kopplungsreagenz SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimido)-cyclohexan-1-carboxylat) eingeführt werden. Bei dieser Methode ist es nicht notwendig, den T-AChR1-209 mit Thiolgruppen zu modifizieren. Nach der Synthese des T-AChR1- 209-Gelonin-Konjugates konnte der freie T-AChR1-209 vollständig abgetrennt werden, während das Konjugat mit nicht umgesetztem Gelonin verunreinigt war. Da kein T-AChR1-209-Fragment mehr zur Verfügung stand, mußten Versuche zur Optimierung der Konjugatsynthese aufgegeben werden.
Das Ziel der vorliegender Arbeit war es, nähere Informationen über den Zusammenhang zwischen den Konformationsänderungen des Chaperonin-GroEL/ES-Systems und den einzelnen Schritten im Faltungsprozess zu erhalten. Dabei wurde die ESR-Spektroskopie als kon-formationssensitive Methode eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Doppelmutant GroEL C138S/C519S, der nur noch in Position 458 jeder Untereinheit ein einzelnes Cystein enthält, mit drei verschiedenen thiol-spezifischen Spin-Labeln, nämlich 4-(3-Iodo-acetamido)-2,2,6,6- tetramethyl-piperidin-1-oxyl (IAAT), 4-Maleimido-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinoxyl (MAL) und 4-(3?Iodo-2? oxopropyliden-1)?2,2,3,5,5? pentamethyl-[d15]? imidazolidin-1-oxyl (IOPI) modifiziert und untersucht. Um genaue Aussagen für die nun modifizierten Mutanten dmEL-IAAT, dmEL-MAL und dmEL-IOPI zu machen, wurden diese biochemisch charakterisiert und mit dem nicht spin-gelabeltem Doppelmutant GroEL (dmEL) und dem Wildtyp GroEL (wtEL) verglichen. Die biochemische Charakterisierung des nicht spingelabeltem dmEL und der modifizierten Mutanten erfolgte durch die Bestimmung von ATPase-Aktivität und Rückfaltungsaktivität. Zusätzlich wurde die Umgebung der kovalent eingebrachten Spin-Labeln (IAAT, MAL, IOPI) in Gegenwart und Abwesenheit von GroES und Substratproteins untersucht. Die verschiedenen Untersuchungen am dmEL und die entsprechenden experimentell erhalte-nen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ATPase-Aktivität des nicht spingelabelten dmEL leicht höher als die des wtEL ist, allerdings hat die Vorinkubation des dmEL mit ES in Anwesenheit von Nukleotiden keine Inhibierung der ATP-Hydrolyse im Falle des dmEL verursacht. Im Gegensatz dazu wurde im Falle des wtEL eine Inhibierung von etwa 25 % der ATP-Hydrolyse in Anwesenheit von ES im Vergleich zum wtEL-Wert in Abwesenheit von ES und Nukleotiden (wie auch in der Literatur [Viitanen et al., 1990; Langer et al., 1992; Chandrasekhar et al., 1986; Gray & Fersht, 1991; Jackson et al., 1993] beschrieben) bemerkt. Bei der Untersuchung der durch Chaperonin-GroEL unterstützten Rückfaltung von denaturierter LDH wurde eine deutliche Erhöhung der Ausbeute an zurückgefalteter LDH im vergleich zu der ?spontanen? nicht Chaperonin-abhängigen Rückfaltung von LDH bemerkt. Die ?spontane? nicht Chaperonin-abhängige Rückfaltung von LDH bei 25 °C zeigt eine Ausbeute an aktiven LDH von 23 %. In Gegenwart von dmEL und ATP wurden etwa 20 % der denaturierten LDH rückgefaltet. Die Zugabe von ES an dmEL in Anwesenheit von ATP hat die Ausbeute an Teil rückgefalteter LDH auf 42 % erhöht. Dies deutet auf eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL hin. Die Experimente am wtEL unter gleichen Bedingungen wie beim dmEL haben eine deutliche Erhöhung der Ausbeute an rückgefalteter LDH in Anwesenheit von wtEL und ATP auf 52 % gezeigt (wie auch schon bei [Guhr, 2000] beschrieben). Die Anwesenheit von ES hat die Ausbeute auf 65 % erhöht. Betrachtet man sich in diesem Zusammenhang den Unterschied zwischen den Ausbeuten an rückgefalteter LDH durch dmEL und wtEL, so ist anzunehmen, dass die gerin-gere Rückfaltungsaktivität des dmEL an der eingeführten Doppelmutation C138S/C519S liegt. Es liegt nahe, dass eine für die Rückfaltung eines Substratproteins benötigte Konformationsübertragung von der Doppelmutation beeinflusst wird. Das GroEL:GroES-Verhältnis war bei allen verschiedenen Untersuchungen 1:2. In unserem Arbeitskreis wurde schon bereits von P. Guhr (2000) gezeigt, dass unterschiedliche GroEL:GroES-Verhältnisse von entweder 1:1 oder 1:2 weder bei LDH noch bei MDH-Rückfaltung einen Einfluss auf die Ausbeute rückgefalteten Substratprotein hat. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass unter den verwendeten Reaktionsbedingungen nur die asymmetrischen GroEL/GroES-Komplexe ?bullet? als aktive Komponenten auftraten. Die Bestimmung von zugänglichen Nukleotidbindungsstellen am GroEL wurde mit Hilfe der ESR-Spektroskopie und C8-SL-ATP durchgeführt. Sowohl bei dmEL als auch bei wtEL konnten alle Nukleotidbindungsstellen besetzt werden. Im Gegensatz zum wtEL zeigt der dmEL eine sigmoidale Bindungskurve. Die Bestimmung von Nukleotidbindungstellen in Anwesenheit von ES zeigte kein sigmoidales Verhalten. Die Bildung des GroEL/ES-Komplexes in Gegenwart von C8-SL-ATP konnte von P. Guhr (2000) nicht erfolgreich nachgewiesen werden, da Versuche zum Nachweis des Komplexes mit Hilfe der nativen Gelelektrophorese scheiterten. Die chemische Modifizierung des dmEL mit IAAT-SL und die durchgeführten Untersuchun-gen zur biochemischen Charakterisierung des dmEL-IAAT-SL und deren Vergleich mit dem nicht spingelabelten dmEL haben die folgenden Schlüsse gelassen: Der IAAT-SL beeinflusst die ATPase-Aktivität des dmEL relativ wenig im Vergleich zum dmEL-Wert. Ebenso wurde die Nukleotidbindung an dmEL-IAAT-SL relativ wenig beeinflusst, allerdings zeigt die Nukleotidbindungskurve des dmEL-IAAT-SL kein sigmoidales Verhalten im Gegensatz zum dmEL. Auch bei der Bestimmung der Nukleotidbindungsstellen in Anwesenheit von ES wurden alle Nukleotidbindungsstellen besetzt. Die experimentell beobachtete Rückfaltungsaktivität des dmEL nach Modifizierung mit IAAT-SL wurde stark beeinflusst. Während etwa 20 % der denaturierter LDH durch dmEL in Anwesenheit von ATP rückgefaltet wurden, wurden nur etwa 5 % der denaturierten LDH durch dmEL-IAAT in Anwesenheit von ATP rückgefaltet. Allerdings hat die Anwesenheit von ES die Ausbeute an Teil rückgefalteter LDH im Falle des dmEL-IAAT-SL in Anwesenheit von ATP auf 8 % erhöht. Die beobachtete normale ATPase-Aktivität und die niedrige Rückfaltungsaktivität des dmEL-IAAT-SL deuten darauf hin, dass diese von einander abgekoppelt erfolgen. Die ESR-Untersuchungen am dmEL-IAAT-SL haben in Anwesenheit von verschiedenen Nukleotiden, GroES, und Substratprotein keine Konformationsänderungen in der Umgebung des modifizierten mit IAAT-SL C458 nachgewiesen. Es wurde nur in einem Fall in Abwesenheit von Substratprotein aber in Gegenwart von ATP und ES ein Effekt der ES-Bindung auf die ESR-Spektren gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass die Bindung von ES die Übertragung von strukturellen Änderung im Bereich des C458 beeinflusst hat. Im Gegensatz zum IAAT-SL hat der MAL-SL die ATPase-Aktivität des dmEL relativ stark beeinflusst, so dass die ATPase-Aktivität des dmEL-MAL nur 50 % der des dmEL-Wertes erreicht hat. Es besteht die Möglichkeit, dass durch eine Störung der Struktur der Nukleotid-bindungsstellen eine gestörte Konformationsübertragung verursacht wurde, so dass die ATPase-Aktivität zu tief abgefallen ist. Die Rückfaltungs-Untersuchungen am dmEL-MAL haben gezeigt, dass etwa 15 % der denaturierten LDH in Anwesenheit von dmEL-MAL und ATP seiner Ausgangs-Aktivität zurückgewinnt. Dieser Anteil an rückgefalteter LDH steigt auf etwa 25 % in Anwesenheit von dmEL-MAL, ATP und ES. Diese Erhöhung der Ausbeute deutet auf eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL hin. Die ESR-Untersuchungen an dmEL-MAL haben keine strukturellen Veränderungen im Bereich des mit MAL-SL modifizierten C458 des Proteins nachgewiesen. Der IOPI-SL hat bei der ATPase-Aktivität-Unteruschungen ein unterschiedliches Verhältnis im Vergleich zu IAAT-SL bzw. MAL-SL gezeigt. Bei Bestimmung der ATPase-Aktivität des dmEL-IOPI bei 30 °C wurde eine ATPase-Aktivität im selben Bereich wie beim dmEL gefunden. Bei 37 °C hat der dmEL-IOPI eine außergewöhnliche hohe ATPase-Aktivität mit fast 100 %iger Steigerung der des dmEL-Wertes gezeigt. Auch die ATPase-Aktivität des dmEL-IOPI nach Vorinkubation mit ATP oder ADP und in Anwesenheit von ES ist um etwa 166 % der des dmEL-Wertes gesteigert, anstatt abzufallen. Es konnten jedoch nur 4,8 % denaturierter LDH durch dmEL-IOPI in Anwesenheit von ATP rückfalten. Die Zugabe von ES hat diesen Anteil auf 21 % erhöht, jedoch liegt der Wert unterhalb der spontanen Rückfaltung (22 %). Wie in allen Fällen, wurde auch im Falle des dmEL-IOPI gezeigt, dass eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL besteht. Auch die ATPase läuft zu schnell ab und kann den Faltungsprozess von Substratprotein nicht unter-stützen. Wenn man das Verhalten der drei modifizierten Mutanten in Bezug auf die ATPase-Aktivität und Rückfaltung betrachtet, deuten die Ergebnisse darauf, dass die ATPase-Aktivität und die Rückfaltungsaktivität von einander abgekoppelt erfolgen. Auch im Falle des dmEL-IOPI haben die ESR-Spektren keine strukturellen Änderungen im Bereich des C458 nachgewiesen. Ein weiterer Ansatzpunkt zur Untersuchung des Chaperonins GroEL wären die folgenden Doppelmutationen einzuführen: C138S/C458S bzw. C458S/C519S und die gleichen Unter-suchungen der vorliegender Arbeit durchzuführen. Anderer Vorschlag wäre die chemische Modifizierung des Substratproteins oder auch des Co-Chaperonin-GroES innerhalb des ?mobile loop? nach einer entsprechenden Cysteinmutation und mit Hilfe der ESR-Spektroskopie könnten noch genauen Aussagen über den Funktions-mechanismus gemacht werden. Einführung von Cysteinmutation innerhalb der apikalen Domäne des GroEL und mit Hilfe der ESR-Spektroskopie könnte auch ermöglichen, nähere Informationen über die GroES- bzw. Substratproteinbindung zu gewinnen.
Der Variantenreichtum der Pentaphosphaferrocene konnte unter Verwendung von trimethylsilyl-substituierten CpR-Liganden erweitert werden. Neben den einfach und zweifach Tms-substituierten Cp- und Cp= Liganden kommt auch der gemischt substituierte Cp-'-Ligand zum Einsatz. Bei der Cothermolyse von [CpRFe(5-P5)] und [CpRCo(CO)2] entstehen eine Reihe von neuartigen und bekannten Cobalt und Eisen Mehrkernclustern mit unsubstituierten Pn-Liganden. Die Verbindungen [{Cp=Co}4P10], [{Cp=Co}4P4] und [{Cp-Co}4P4] fungierten ebenfalls in ausgewählten Reaktionen als Phosphorquelle mit einer erstaunlichen Produktpalette.
In Anlehnung an die konventionelle SSP-PCR-Methode wurde ein Low-Resolution-Panel mittels des TaqMan-Prinzips entwickelt und es wurde exemplarisch für DR4 und DR15/16 gezeigt, daß die auf dem 5 Nuklease-Assay beruhende Methode fähig ist, auch einzelne Punktmutationen voneinander zu unterscheiden. Das Grundprinzip dieser Methode basiert ähnlich dem der PCR-SSP auf dem Verfahren der PCR und auf dem Ausnutzen genetischer Unterschiede. So kommt es nur zu einer Amplifizierung wenn beide Primer spezifisch binden. Die Detektion einer erfolgreichen Amplifizierung erfolgt bei der TaqMan-Methode über eine Fluoreszenzmessung im gleichen Reaktionsgefäß. So entfallen jegliche Post-PCR-Schritte, d.h. es müssen weder weitere Pipettierschritte noch Gelelektrophorese eingesetzt werden. Das automatisch generierte Datenfile muß nur am Rechner ausgewertet werden. Mit Hilfe einer optimierten Schnell-DNA-Isolierungsmethode, die auf dem Binden an ein Säulenmaterial und Verdau etwaiger Proteine beruht, läßt sich eine DRB1-Typisierung nunmehr in etwas mehr als 2 Stunden durchführen, im Gegensatz zu den bisher 3-3.5 Stunden bei der konventionellen SSP-PCR. Durch den höheren Automatisierungsgrad, werden nicht nur Zeit und Arbeitsaufwand minimiert, sondern auch die potentiellen Fehlerquellen eingeschränkt, wie z.B. Kontaminationen durch PCR-Produkte, fehlerhaftes Auftragen der PCR-Produkte auf das Gel und die falsche Zuordnung von Banden. Bei Validierungsuntersuchungen dieses Tests ergab sich eine zufriedenstellende Übereinstimmung mit der konventionellen SSP-Typisierung und mit anderen molekularbiologischen Methoden wie RFLP. Die TaqMan-Methode stellt eine sehr nützliche Alternative zu herkömmlichen Typisierungsverfahren dar. Sie kann sowohl für Einzel- und Notfalltypisierungen, als auch für eine größere Zahl gleichzeitig durchzuführender Tests eingesetzt werden. Sie ist sehr zuverlässig, weniger zeit- und arbeitsintensiv als andere Methoden (SSP, SSO), besitzt ein höheres Automatisierungspotential und einen höheren Durchsatz. Sie ist erweiterbar für die Detektion neuer Allele und Subtypen. Die Technik ist in ihren Einsatzmöglichkeiten nicht begrenzt, im Gegensatz zu RFLP oder RSCA, die durch Enzyme bzw. ihre Schnittstellen limitiert sind. TaqMan-Assays sind weniger aufwendig und die Interpretation übersichtlicher als z.B. die einer Sequenzierung. Eine Ausdehnung der HLA-Typisierung mittels TaqMan-Verfahren auf andere HLA-Loci ist durchaus sinnvoll.
Photolysiert man [{Cp R Ru(CO)2}2] (Cp R = Cp", Cp*) (1a,b), in Gegenwart von weißem Phosphor, so können keine phosphorhaltigen Produkte isoliert werden. Setzt man [{Cp"Ru(CO)2}2] (1a) mit weißem Phosphor bei 190 °C in Dekalin um, dann lassen sich als einzige Verbindungen das Pentaphospharuthenocen-Derivat [Cp"Ru(h 5 -P5)] (3a, 6 % Ausbeute) und [Cp"2Ru2P4] (4a, 17 % Ausbeute) säulenchromatographisch abtrennen. Für 4a wird auf Grund seiner spektroskopischen Eigenschaften eine den röntgenstruktur-analytisch charakterisierten pseudo-Tripeldecker-Komplexen [{Cp R Fe}2(micro-h 4:4 -P4)] (Cp R = Cp" [35] , Cp"' [11] ) analoge Struktur mit s-cis-Tetraphosphabutadiendiyl-"Mitteldeck" vorgeschlagen; es sind jedoch auch zwei micro-h 2:2 -P2-Liganden denkbar. Die Cothermolyse von [{Cp"Ru(CO)2}2] (1a) und [Cp*Fe(h 5 -P5)] (2b) ergibt ein breites Produktbild. Während [Cp"Ru(h 5 -P5)] (3a), das chromatographisch nicht von 2b abgetrennt werden konnte, und [Cp"2Ru2P4] (4a, 6 % Ausbeute) in vergleichsweise geringen Mengen entstehen, können [{Cp"Ru}3P5] (6) in 17 % Ausbeute, [{Cp"Ru}2{Cp*Fe}P5] (7) in 7 % Ausbeute, [{Cp*Fe}2{Cp"Ru}P5] (8) in 22 % Ausbeute und [{Cp"Ru}3{Cp*Fe}(P2)2] (9) in 14 % Ausbeute isoliert werden. Für 9 wird, basierend auf den NMR-spektroskopischen Befunden, eine zu [{CpFe}4(P2)2] (10) [24] analoge Struktur mit einem hier verzerrten Dreiecksdodekaedergerüst vorge-schlagen, dessen vier Ecken der Konnektivität fünf von drei Rutheniumatomen und einem Eisenatom besetzt sind und dessen vier Ecken der Konnektivität vier zwei micro-h 2:2:1:1 -P2-Einheiten einnehmen. Es handelt sich bei 9 wie bei 10 um Cluster vom hypercloso-Typ (n+1 = 8 GEP). [30,31] Röntgenstrukturanalysen zeigen, daß 6, 7 und 8 ebenfalls verzerrt dreiecksdodekaedrische Gerüststrukturen besitzen. Damit ist auch die Struktur der bereits früher synthetisierten und spektroskopisch charakterisierten Komplexe [{Cp R Fe}3P5] (Cp R = Cp*, Cp*') (11b,c) [8] geklärt, deren NMR-Daten auf eine enge Verwandtschaft insbesondere mit 6 hinweisen. Gegenüber 9 bzw. 10 [24] mit einem M4P4-Gerüst (M = allgem. Übergangsmetallatom) ist in den Clustern 6, 7, 8 und 11b,c [8] mit M3P5-Gerüst formal ein 13 VE-Metallkomplex-fragment (Konnektivität fünf; 1 GE) durch ein Phosphoratom (3 GE) ersetzt, wodurch der Übergang zum closo-Strukturtyp des Dreiecksdodekaeders (n+1 = 9 GEP) [30,31] vollzogen wird. Die Cluster 6, 7, 8 und 11b,c [8] enthalten eine bisher unbekannte Koordinationsform der P5-Einheit. Bei der thermischen Umsetzung von [{Cp*Ru(CO)2}2] (1b) mit [Cp*Ru(h 5 -P5)] (3b) erhält man als Hauptprodukt den Dreikernkomplex [{Cp*Ru}3(P4)(P)] (17b, 62 % Ausbeute). Als einziges Nebenprodukt kann [Cp*2Ru2P4] (4b, 5 % Ausbeute) säulen-chromatographisch isoliert werden. Die NMR-Daten von 17b lassen in Analogie zum röntgenstrukturanalytisch charakterisierten [{Cp*'Fe}3(P4)(P){Mo(CO)5}] (18c) [8] auf eine cubanartige Struktur schließen, in der die fünf Phosphoratome in Form einer Isotetraphosphid-Einheit und eines einzelnen Phosphoratoms vorliegen. Die Gesamtzahl von 64 Valenzelektronen ist im Einklang mit drei Metall-Metall-Bindungen [31] . Für 4b ist wie für das voranstehend besprochene Cp"-Derivat 4a eine Pseudo- Tripeldecker-Struktur mit s-cis-Tetraphosphabutadiendiyl-"Mitteldeck" oder mit zwei micro-h 2:2 -P2-Liganden zu diskutieren. Thermolysiert man [{Cp* Ru(CO)2}2] (1c) mit 3b, so erhält man die Komplexe [Cp*'nCp*2-nRu2P4] (n = 0,1,2) (4b,d,c) und [{Cp*'Ru}n{Cp*Ru}3-n(P4)(P)] (n = 1,2,3) (17e,d,c) jeweils als nicht auftrennbare Gemische von analog aufgebauten Verbindungen, die sich nur im Zahlenverhältnis der verschiedenen Cyclopentadienyl-Liganden Cp*' und Cp* unterscheiden. In geringem Umfang beobachtet man dabei auch eine cyclo-P5-Übertragung unter Bildung des literaturbekannten [Cp*'Ru(h 5 -P5)] [7,10] , das im Gemisch mit nicht abreagiertem 3b anfällt. Durch Umsetzung mit [W(CO)5(thf)] gelingt die Komplexierung des dreiecks-dodekaedrischen Clusters [{Cp*Fe}2{Cp"Ru}P5] (8) zum Monoaddukt [{Cp*Fe}2{Cp"Ru}P5{W(CO)5}] (19), während beim Komplexierungsversuch des ebenfalls dreiecksdodekaedrischen Clusters [{Cp*'Fe}3P5] (11c) mit [Mo(CO)5(thf)] [8] eine Gerüstumlagerung zur cubanartig aufgebauten Verbindung [{Cp*'Fe}3(P4)(P){Mo(CO)5}] (18c) erfolgt. Der Strukturvorschlag für 19 basiert auf dem 31 P-NMR-Spektrum. Versuche zur Oxidation von 8 mit gelbem Schwefel bei Raumtemperatur führen zu unspezifischer Zersetzung bzw. Folgereaktionen von 8. Orientierende Versuche mit grauem Selen als milderem Oxidationsmittel deuten darauf hin, daß unter geeigneten Reaktionsbedingungen eine einfache Selenierung am endständigen Phosphoratom des P5-Liganden von 8 erfolgt. Bei der Umsetzung von [{Cp"Ru}3{Cp*Fe}(P2)2] (9) mit gelbem Schwefel können je nach Reaktionsbedingungen bis zu drei Phosphoratome oxidiert werden. Vollständige Sulfurierung wie im Falle von [{CpFe}4(P2S2)2] [24] wird nicht beobachtet. Die Sulfurierung ist regioselektiv. Für einen bestimmten Sulfurierungsgrad wird jeweils nur ein Produkt erhalten. Die Strukturvorschläge für die Cluster 21 23 werden anhand ihrer 31 P-NMR-spektroskopischen Daten abgeleitet.
Demizellisierung Die isotherme Titrationskalorimetrie ist eine leistungsfähige, schnelle und einfache Methode, die den großen Vorteil bietet, aus ein und demselben Experiment die CMC und die Demizellisierungsenthalpie eines Tensids in einem weiten Temperaturbereich zu bestimmen [48,51,102,103]. Die in dieser Arbeit verwandten Detergentien Octylglucosid und Dodecylmaltosid zeichnen sich durch ihre milden Eigenschaften beim Herauslösen von Proteinen aus bakteriellen Membranen und bei deren Rekonstitution in definierten Lipidmatrizen aus [104-106]. Diese nichtionischen Tenside besitzen eine relativ hohe Aggregationszahl, woraufhin die Näherungen des Phasenseparationsmodells gemacht werden können. Die CMC ist eine Funktion der Temperatur, der Neutralsalzkonzentration und der Alkylkettenlänge. Bei Prozessen, die durch den hydrophoben Effekt bedingt sind kehrt sich mit steigender Temperatur das Vorzeichen der Enthalpie um; dort besitzt DHDemiz eine Nullstelle. Die entsprechende Temperatur wird TH genannt. Ebenso weist die Entropie eine Nullstelle bei TS auf. Im Bereich von TH ist es schwierig wenn nicht sogar unmöglich die CMC und die Demizellisierungsenthalpie auf titrationskalorimetrischem Wege genau zu bestimmen. Mit Hilfe der van t Hoff schen Reaktionsisobare lassen sich DHDemiz und die CMC aus den experimentell zugänglichen Werten mathematisch anpassen [51,55]. Die starke Temperaturabhängigkeit der Enthalpie und Entropie kompensieren sich weitgehend und es resultiert nach Gibbs-Helmholtz eine nur schwache Temperaturabhängigkeit der freien Enthalpie. Die Ableitung der Enthalpie nach der Temperatur ergibt die Wärmekapazität. Diese ist ein Maß inwieweit hydrophobe Oberfläche durch die Mizellbildung vom Einfluß des Wassers abgeschirmt wird. Solubilisierung Mit Hilfe der ITC lassen sich, für den Prozeß der Solubilisierung, die Phasengrenzen des Koexistenzbereichs einfach bestimmen. Sie sind aus den Kalorigrammen zugänglich als Wendepunkte des intermediären Extremwertes. Als Erste setzten Heerklotz et al. die Titrationkalorimetrie im Zusammenhang mit dieser Problemstellung ein [66]. Desweiteren läßt sich aus dieser Art von Experiment die Solubilisierungskraft verschiedener Tenside bestimmen. So besitzt Dodecylmaltosid eine deutlich höhere Solubilisierungskraft als Octylglucosid. Dies ist zu ersehen aus den für DM niedrigeren Re sol -Werten. Die Solubilisierung der synthetischen Lezithine in pH 6 Phosphatpuffer bei 70 °C zeigen einen linear ansteigenden Verlauf mit Zunahme der Acylkettenlänge des Lipids. Im Gegensatz dazu zeigt OG eine sprunghafte Änderung zwischen DPPC und DSPC. Dies deutet darauf hin, daß die Form und oder Größe der entstehenden Aggregate in der gemischtmizellaren Phase differieren. Die Werte in Pufferlösung liegen leicht unter denen in reinem Wasser. Dies wird verursacht durch die Verringerung der Hydratation der Kopfgruppen in den Aggragaten. Die Reihenfolge der Solubilisierung in Abhängigkeit der Kopfgruppe des Lipids nimmt sowohl für DM als auch für OG in der Richtung PA>PC>PG ab. Ursache hierfür sind die in dieser Richtung abnehmenden intermolekularen H-Brückenbindungen. Gleichzeitig nehmen in dieser Richtung die intramolekularen H-Brückenbindungen zu. Deshalb läßt sich PG leichter als die anderen Lipide solubilisieren. Die temperaturabhängigkeit des Gesamtverhältnisses Rt # des Beispiels OG/P90g in Wasser zeigt analog der temperaturabhänigigkeit der Demizellisierung ein Minimum zwischen 42 und 46 °C (quadratisch angepaßt). Die typische, auf den hydrophoben Effekt basierende Umkehr der Reaktionsenthalpie findet hier bei 42 °C statt. Das effektive Molverhältnis Re # zeigt für die Solubilisierung einen leichten und für die Saturierung einen stärkeren Anstieg mit steigender Temperatur. Der Einfluß der Größe der ursprünglich eingesetzten Vesikel wurde bei dem System OG/DMPC in Wasser bei 27 °C untersucht. Es konnte kein Einfluß der Vesikelgröße festgestellt werden. Die Solubilisierung des Gemisches DMPC/DMPG mit OG wurde in pH 6 Phosphatpuffer bei 70 °C untersucht. Die Solubilisierungsgrenze der DMPC-Membran wird durch beimischung von DMPG bis zu einem Molenbruch XMG = 0,4 erhöht. Die DMPG-Membran wird durch den DMPC-Anteil bis XMC = 0,2 destabilisert. Verteilungsexperimente Die Experimente, bei denen Lipid zu einer Detergensvorlage titriert wurde, wurden mit konstantem Verteilungskoeffizienten P angepaßt. Der Verteilungskoeffizient und die Transferenthalpie nehmen mit zunehmendem OG-Gehalt in der DMPC-Membran bei 30 °C ab. Es scheinen anfängliche Fehlstellen abgesättigt zu werden. Gleiches Verhalten zeigt sich bei 70 °C. Lediglich die Transferenthalpie nimmt betragsmäßig leicht zu. Die Abhängigkeit von der Kopfgruppe des Lipids zeigt eine Zunahme des Verteilungskoeffizienten von DPPA<DPPC<DPPG bei 70 °C in pH 6 Phosphatpuffer. Dies läßt sich verstehen durch die bereits vorher erwähnte Abnahme der intermolekularen H-Brückenbindungen. Dadurch wird die Membran flexibler und der Detergenseinbau erleichtert. Die Konstanz des Verteilungskoeffizient P war zu erwarten, da der Vorgang sich innerhalb eines kleinen Konzentrationsbereichs abgespielt hat und immer derselbe Prozeß stattgefunden hat, nämlich der Einbau von wenig Detergens in die reine Lipidmembran. Die Experimente, bei denen Detergens zu einer Lipidvorlage titriert wurde, konnten, wegen des nichtidealen Mischungsverhaltens, nicht mehr mit einem konstanten Verteilungs-koeffizienten P angepaßt werden. Die Anpassung wurde mit dem athermischen Mischungsmodell von Guggenheim realisiert. Dabei enthält die Gibbs sche freie Mischungs-enthalpie einen Exzeßterm. Der Verteilungskoeffizient P0 nimmt mit steigendem Vesikeldurchmesser ab. Die Krümmung der Vesikel hat somit großen Einfluß auf die Fehlstellen in der Membran. Die Werte der Fit-Parameter schwanken leider sehr stark mit dem Intervall der Schrittweite für die Anpassung. Die Ursache hierfür liegt an der Qualität der experimentellen Werte. Bei der in dieser Arbeit durchgeführten Verteilungsexperimenten ist das Signal/Rausch Verhältnis recht klein und am Rande der Auflösung des Kalorimeters. Es ergeben sich somit schon bei der Integration und Basislinienkorrektur grobe Toleranzen. Für die mathematische Anpassung stehen desweiteren nur eine relativ geringe Datenmenge von ca. 20 - 40 Meßpunkten zur Verfügung. Es lassen sich somit bei Experimenten in diesem meßtechnischen Grenzbereich eher nur eine Abschätzung als genaue Absolutwerte bestimmen. Die Signale dieser Art von Experimenten sind deshalb so gering weil zu der geringen Verdünnungsenthalpie nur noch die Transferenthalpie weniger Detergensmoleküle beiträgt. Das nichtideale Mischungsverhalten dieses Verteilungsexperimentes ist zu verstehen, aus der Unteschiedlichkeit beider Amphiphile hinsichtlich Ihrer Strukturformel und ihrem physikalischen Verhalten. DSC Die Solubilisierung wurde auch mit der DSC-Methode untersucht. Der Einbau von OG in DPPC zeigt schon bei geringen Detergensmengen ein Verschwinden der Vorumwandlung (Lb' -> Pb' ). Die Hauptumwandlung verschiebt sich mit steigender Detergenskonzentration zu niedrigeren Temperaturen. Beim Überschreiten der Saturierungsphasengrenze geht die Kooperativität der Umwandlung zunehmends verloren und die anfänglichen Umwandlungspeaks werden zu Umwandlungsbereichen. Sogar noch in der mizellaren Phase sind Umwandlungsbereiche zu erkennen, was darauf hindeutet, daß selbst dort noch Domänen mit kooperativem Umwandlungsverhalten existieren müssen, da in reinen OG-Mizellen keine Umwandlung detektiert werden konnte. Die Verschiebung der Umwandlung und die Schärfe der Bereiche ist reversibel. Der Einfluß von 150 mM NaCl-Puffer bewirkt lediglich eine Verschiebung der Umwandlungstemperaturen um ca. 5 °C zu niedrigeren Werten, was sicherlich auf die Änderung der Hydratation im Kopfgruppenbereich der Aggregate zurückzuführen ist. Lichtstreuung Mit Hilfe der dynamischen und statischen Lichtstreuung lassen sich die Grenzen des kalorimetrisch bestimmten Koexistenzbereichs bestätigen. Außerdem konnte ein kleiner lokaler Extremwert im Titrationskalorigramm als Ende der makroskopischen Phasenseparation identifiziert werden. Beim synthetischen Lipid DMPC reicht diese Mischungslücke vom Koexistenzbereich bis in den mizellaren Bereich. Bei dem natürlich vorkommenden SojaPC liegt diese Mischungslücke innerhalb des kalorimetrisch bestimmten Koexistenzbereich. Das anionische DMPG weist keine Mischungslücke auf. Rheologie Das Anionische Lipid DMPG weist beim titrieren mit OG in pH 6 Phosphatpuffer bei 30 °C eine starke Basislinienverschiebung auf. Die Ursache hierfür ist eine sprungartige Zunahme der Viskosität beim Überschreiten der Saturierungsphasengrenze. Diese Basislinienverschiebung nimmt mit steigender Temperatur ab bedingt durch die Zunahme der thermischen Energie. Die rheologischen Eigenschaften des Systems OG/DMPG wurden mit einem Rotationsviskosimeter näher untersucht. Im Koexistenzbereich zeigt sich scherverdünnendes, anti-thixotropes Verhalten. Dies läßt sich erklären durch die Bildung von würmchenähnlichen Mizellen. Vor Beginn der Scherung sind die Würmchenmizellen durch die Brown sche Molekularbewegung völlig ungeordnet. Mit eintretender Scherung findet eine Orientierung der Mizellfäden statt. Durch besseres aneinander Vorbeigleiten tritt eine Viskositätserniedrigung ein. Bei weiterer Erhöhung von & g kommt es verstärkt zu Rheo-destruktion und die Moleküle müssen sich neu assoziieren. Erniedrigt man die Scherrate wieder, kommt es durch die Reassoziation zu verstärkten Wechselwirkungen zwischen den verzweigten, fadenförmigen Mizellen. Dadurch ist die Viskosität beim Reduzieren der Scherrate höher und die Kurve verläuft linksherum (anti-thixotrop).
Die Untersuchung der Induktion der Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) Aktivität durch die "dioxinartigen" PCBs 77, 81, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169 und 189 in der Hepatoblastom-Zellinie HepG2 und, zur Vervollständigung bereits veröffentlichter Daten, in primären Rattenhepatozyten und in der Rattenhepatom-Zellinie H4IIE wurde im ersten Teil der Arbeit durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß die ausgewählten PCBs in HepG2 weniger potent sind als in H4IIE-Zellen bzw. primären Rattenhepatozyten. In HepG2-Zellen konnte lediglich für die PCBs 77, 81, 114 und 126 eine Induktion der EROD-Aktivität detektiert werden. Für PCB 169, eines der potentesten Kongenere in H4IIE-Zellen und primären Rattenhepatozyten, wurde keine EROD-Induktion in HepG2-Zellen gemessen. Diese und weitere Speziesunterschiede verdeutlichen, daß eine Extrapolation der Daten aus Experimenten mit Nager-Zellen zur Risikoabschätzung auf den Menschen nur bedingt möglich ist. PCB 81 zeigte in den vorliegenden Messungen einen REP-Wert von 0,02 und 0,05 in HepG2-Zellen bzw. primären Rattenhepatozyten. Die Beeinflussung der basalen und induzierten Apoptose durch die PCBs 81, 126 und 169 wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht. Es zeigte sich, daß die PCBs 81 und 126 in primären Rattenhepatozyten die basale Apoptose induzieren können. Für das PCB 169 wurde dagegen keine Veränderung der Apoptoseinzidenz im Rahmen der verwendeten Konzentrationen festgestellt. Wurde die Apoptose durch UV-Strahlung induziert, so hemmten die PCBs konzentrationsabhängig die Apoptoserate auf durchschnittlich 62% gegenüber der Kontrolle. Bei höheren Konzentrationen wurde die Inhibierung durch einen induzierenden Effekt aufgehoben.