Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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Rutheniumkomplexe mit N-heterocyclischen Carbenliganden stellen aufgrund ihrer katalytischen Eigenschaften eine interessante Verbindungsklasse dar. Obwohl in den vergangenen Jahren eine Vielzahl von Untersuchungen auf diesem Gebiet der Chemie durchgeführt wurden, fanden die Imidazol-2-ylidene vom "Kuhn-Typ" nur wenig Beachtung. Ein thematischer Schwerpunkt meiner Dissertation ist deshalb die Darstellung und Charakterisierung von Rutheniumkomplexen mit "Kuhn-Carbenen" als Liganden. Dabei steht auch die katalytische Aktivität dieser neuen Verbindungen im Mittelpunkt des Interesses. Anhand ausgewählter Reaktionen kann gezeigt werden, daß mehrere Vertreter als Katalysatoren für die Knüpfung von C/C-Bindungen fungieren können. So können mit Hilfe von Rutheniumalkyliden-Komplexen mit einem oder zwei nucleophilen Carbenen als Liganden bestimmte Diene einer Ringschlußmetathese unterzogen werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt meiner Arbeit basiert auf einer von Polifka in der Arbeitsgruppe Binger entdeckten Darstellung eines 1H-Phosphols durch Umsetzung von tert-Butylphosphaacetylen mit einem Rutheniumvinylcarben-Komplex. Nach erfolgreicher Optimierung kann die Phospholsynthese auf eine breite Basis gestellt werden, wobei sowohl eine Variation am Phosphaalkin als auch am Rutheniumvinylcarben-Komplex möglich ist. Durch Modifikation der Reaktionsbedingungen wird ein neuer Zugang zur Substanzklasse der 1H-Phosphirene eröffnet. Die beiden Phosphaheterocyclen, sowohl die Drei- als auch die Fünfringe, werden durch analytische und spektroskopische Methoden charakterisiert und auf ihre Reaktivität hin überprüft. Abschließend wird das Reaktionsverhalten von Carbonylkomplexen der 8. Gruppe mit Phosphaalkinen untersucht. In diesem Zusammenhang gelingt erstmals die Darstellung von 1,3-Diphosphet-Komplexen der Metalle Ruthenium und Osmium. Daneben lassen sich teilweise Dreikerncluster mit Ketenylphosphiniden-Liganden isolieren.
Aktin und Myosin sind die beiden wichtigsten molekularen Komponenten der Myofibrillen, die für die Muskelkontraktion verantwortlich sind. In Nichtmuskelzellen bildet Aktin die Mikrofilamente, die wiederum über Wechselwirkungen mit Myosin kontraktile Einheiten bilden. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Aspekte und Funktion der beiden Motor-proteine sowie ihre Interaktion mittels der hochauflösenden Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) untersucht. Die Struktur von filamentösem Aktin (F-Aktin) wird durch das komplexierte bivalente Ion beeinflußt. Mit drei voneinander unabhängigen Methoden wurde gezeigt, daß in Mg 2+ -F-Aktin im Gegensatz zu Ca 2+ -F-Aktin die N-terminalen Domänen der Monomereinheiten hochmobil sind. Sie sind durch 1 H-NMR-Signale mit schmaler Linienbreite charakterisiert, die selbst im polymeren Zustand im Filament zu beobachten sind. Die chemische Modifikation des Cys 374 mit dem Markierungsreagenz 4-Perfluorotert.-butylphenyliodacetamid (PFP) ermöglichte die Untersuchung des C-Terminus mit der 19 F-NMR-Spektroskopie. Unabhängig vom gebundenen Ion wurden die intensiven 19 F-Signale des G-Aktins nach der Polymerisation zu F-Aktin sehr stark verbreitert. Dies bewies die Immobilisierung des C-Terminus und damit, daß die scharfen NMR-Signale des Mg 2+ -F-Aktins von anderen Domänen stammen müssen. Die Bindung von Antikörperfragmenten (Fab) gegen die ersten sieben Aminosäurereste des Aktins führte zur Unterdrückung der scharfen 1 H-NMR-Signale des Mg 2+ -F-Aktins, die der mobilen Region zugeordnet waren. Dies deutete auf stark bewegliche Aminosäurereste im N-Terminus nach der Polymerisation hin. Schließlich wurden in sehr konzentrierten Mg 2+ -F-Aktin-Proben mit der homonuklearen 2D-NMR-Spektroskopie die Resonanzlinien der 25 N-terminalen Aminosäurereste des Aktins sequentiell zugeordnet. Anhand der Quantifizierung der TOCSY-Kreuzsignal-Volumina wurde nachgewiesen, daß die ersten sechs Aminosäurereste am beweglichsten sind. Die Aminosäurereste in den beiden folgenden b-Faltblattsträngen bis Position 20 besitzen eine intermediäre Mobilität. In der folgenden Schleife verringert sich die Beweglichkeit weiter und die Amino-säurereste des dritten b-Faltblattstranges sind durch die Umgebung im Protein vollständig fixiert. Die Dynamik des N-Terminus bleibt dabei unabhängig von pH-Wert und Temperatur. In Mg 2+ -F-Aktin wurde eine niederaffine Mg 2+ -Bindungsstelle durch eine Gleichgewichts-titration bestimmt. Da die N-terminale Acetylgruppe beobachtet wurde, sollte sich die Bin-dungsstelle in der Nähe des N-Terminus befinden. Allerdings könnten auch konformationelle Änderungen induziert worden sein, die nur indirekt den N-Terminus beeinflussen. Der Austausch des im Aktin gebundenen Ca 2+ durch Mg 2+ war eine neue und sehr schonende Methode, um das Cys 10 in der Subdomäne I von Aktin für Markierungsreagenzien zugänglich zu machen. Anhand der sehr sensitiven PFP-Markierung an Cys 10 wurden in der 19 F-NMR-Spektroskopie zwei verschiedene Zustände der Bindung von Myosin S1 an das Aktinfilament beobachtet. Solange ATP im Überschuß vorhanden war, schien die im Fließgleichgewicht dominierende Konformation des Myosin-Nukleotid-Komplexes mit der Subdomäne I von Aktin zu interagieren und die PFP-Markierung zu immobilisieren. Nach der Hydrolyse von ATP erhöhte sich die Mobilität der Markierung signifikant. Durch NMR-Experimente mit gepulsten Feldgradienten wurde der Diffusionskoeffizient von Mg 2+ -G-Aktin und Mg 2+ -F-Aktin bestimmt. Der relativ große Wert, der für den Diffusionskoeffizient von filamentösem Aktin (0,34 x 10 -6 cm 2 /s) erhalten wurde, deutete daraufhin, daß die Aktindiffusionsmessungen nicht durch ein einfaches starres Körpermodell erklärt werden können, sondern die interne Bewegung im Filament einen zusätzlichen Beitrag leistet. Um das Muskelaktin aus Kaninchen mit Nichtmuskelaktin zu vergleichen, wurde Aktin aus dem Schleimpilz Dictyostelium discoideum in ausreichenden Mengen für erstmalige NMR-spektroskopische Untersuchungen isoliert. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden auch Studien am Interaktionspartner von Aktin durchgeführt. Mit der 31 P-NMR-Spektroskopie wurden die strukturellen Änderungen der Nukleotidbindungsstelle im Myosin S1 bei verschiedenen Temperaturen verfolgt. Die Komplexe von Myosin S1.ADP und Myosin S1.ADP.VO4 3- lagen bei 298 K jeweils in einer bevorzugten Konformation vor, die strukturell dem ADP.Pi-Zustand zuzuordnen ist. Bei tieferen Temperaturen liegt wahrscheinlich eine Vielzahl von Konformeren im Gleichgewicht vor. Die Reso-nanzlinien sind dann durch Austauschprozesse bis auf das Rauschniveau verbreitert und können nicht mehr detektiert werden. Im Gegensatz zum Myosin S1.ADP- bzw. Myosin S1.ADP.VO4 3- -Komplex existiert eine diskrete Tieftemperaturkonformation von Myosin S1.ADP.AlF4 - und Myosin S1.ADP.BeFx. Durch Temperaturerhöhung kann Myosin S1.ADP.AlF4 - in eine weitere Konformation überführt werden. Die Existenz einer zweiten Konformation von Myosin S 1.ADP.BeFx bei höheren Temperaturen war nicht eindeutig nachzuweisen. Die in Dictyostelium discoideum exprimierte Motordomäne M754 besitzt eine verkürzte Halsregion und kann im Gegensatz zu Myosin S1 keine leichten Ketten mehr binden. Die 1 H-NMR- spektroskopischen Untersuchungen beider Motorproteine ergab, daß die Motordomäne selbst sehr kompakt strukturiert ist. Die in der 1 H-NMR-Spektroskopie beobachtbaren mobilen Bereiche des Myosin S1 sind fast ausschließlich in den leichten Ketten lokalisiert und wurden durch die Bindung an Aktin im Aktomyosinkomplex immobilisiert. Die Veränderung des Nukleotidbesetzungszustands von Myosin S1.ADP zu Myosin S1.ADP.VO4 3- führt zu einer anderen Proteinkonformation und verschiebt das Gleichgewicht von gebundenem zu freiem Myosin S1. Die im ersten Teil der Arbeit als mobil charakterisierte N-terminale Acetylgruppe von Aktin wurde im ADP-Zustand des Myosins entgegen der Erwartung nicht immobilisiert.
In dieser Arbeit konnte ein Protokoll für die Isolierung von bisher nicht zugänglichen Mengen des ionotropen Glutamatrezeptors GluRB erarbeitet werden. Insbesondere die im Vergleich zu früheren Präparationen deutlich verbesserte Reinheit und Homogenität des Proteins ermöglichten erste Schritte hin zu einer strukturellen Aufklärung. Wenngleich diese bei den verschiedenen Ansatzpunkten - hydrodynamische Eigenschaften, Rekonstitution, Quervernetztung, 3D-Rekonstruktion und auch den in jüngerer Zeit begonnenen 2D-Kristallisationversuchen - bislang nur zu vorläufigen und oftmals negativen Ergebnissen geführt hat, so stellt doch die Verfügbarkeit des Proteins im heutigen Maßstab eine wichtige Voraussetzung für alle genannten und weitere Untersuchungen dar. Die Untersuchungen der hydrodynamischen Eigenschaften des Proteins konnten die oligomere Zusammensetzung des Ionenkanals nicht endgültig aufklären. Weitere Untersuchungen sind deshalb unerlässlich. Insbesondere die bessere Verknüpfung von Quervernetzungs- und STEM-Untersuchungen scheint ein vielversprechender Ansatz zur Ermittlung des Molekulargewichtes zu sein. Dennoch sind die hier vorgestellten Ergebnisse mit der Vorstellung eines tetrameren Ionenkanals eher in Einklang zu bringen, als mit einer pentameren Zusammensetzung. Die Hinweise auf das Vorliegen von Dimeren in STEM- und Quervernetzungsexperimenten, seien sie gedeutet als Zerfallsprodukte des intakten-Kanals oder als weitere stabile Konformation des Proteins, lassen die Hypothese zu, daß sich Glutamatrezeptoren zur Ausbildung des Ionenkanals aus zwei Dimeren zusammensetzen, wobei die Wechselwirkungen innerhalb eines Dimers stärker sind als diejenigen zwischen ihnen. Inwieweit dies physiologische Bedeutung haben könnte, ist derzeit aber nicht bekannt. Auf dem Wege zu einer strukturellen Charakterisierung des GluRB sollten Rekonstitutionsversuche auch weiterhin unternommen werden, obgleich sich Hinweise auf funktionelle Inkorporation des Proteins in dieser Arbeit nicht ergaben. Besonders wichtig für das Membranprotein scheint es zu sein, auch im solubilisierten Zustand Bedingungen vorzufinden, die seinem nativen Zustand nahe kommen. Aufgrund der weiterhin begrenzten Verfügbarkeit von GluRB sowie der zahlreichen Parameter, die die Rekonstitution beeinflussen, haben die hier vorgestellten Experimente allenfalls vorläufigen Charakter und sollten nicht zum Anlaß genommen werden, die Rekonstitution grundsätzlich als wichtige Methode zur strukturellen Charakterisierung des GluRB in Frage zu stellen. Die gegenwärtig durchgeführte Einzelpartikelanalyse könnte durch eine gelungene Rekonstitution wesentlich erleichtert werden. Leider ist die Expression des neuronalen a7-Acetylcholinrezeptors nicht mit gleichem Erfolg gelungen. Im Baculovirussystem konnte lediglich ein fragmentierter Rezeptor mit schlechten Ligandenbindungseigenschaften exprimiert werden. Hefen und Bakterien ergaben noch schlechtere Ergebnisse. Optimistisch mag die Erkenntnis stimmen, daß das Expressionsniveau der Fragmente in den Insektenzellen erstaunlich hoch war. Die Proteolyseanfälligkeit ist das eigentliche Problem in dieser Arbeit gewesen. Mittels einer verbesserten Aufreinigung, eventuell unter Verwendung einer 10fach-Histidinmarkierung oder anderer C-terminaler Epitope, könnte die Ermittlung der Proteaseschnittstelle gelingen. Die Expression müßte mit einem a7-Konstrukt versucht werden, in dem diese Schnittstelle durch Mutation entfernt wurde. Insgesamt konnte gezeigt werden, daß das Baculovirusexpressionssystem gute Möglichkeiten bietet, eukaryontische Neurotransmitterrezeptoren in für strukturelle Untersuchungen notwendigem Maße zu erzeugen. Im Falle des a7-nAChR müßte es allerdings gelingen, die Fragmentierung zu unterdrücken. Die Aufreinigung und weitere Untersuchung bleibt angesichts der im Vergleich zu löslichen Proteinen weitaus niedrigeren Expression weiterhin schwierig. Die zahlreichen Arbeiten, die gegenwärtig an Membranproteinen durchgeführt werden, führen in absehbarer Zeit sicherlich zu einem besseren Verständnis dieser wichtigen Klasse von Proteinen und werden dann auch experimentelle Erfolge ermöglichen, die in dieser Arbeit noch nicht gelungen sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde an einem kleinen Spektrum humaner Xenograft-Tumoren exemplarisch die cAMP-hydrolysierende PDE-Aktivität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich Tumoren unterschiedlichen Gewebeursprungs stark in ihrer cAMP-hydrolysierenden PDE-Aktivität unterscheiden können, aber dass auch bei verschiedenen Tumoren des gleichen Gewebes die PDE-Aktivität ebenfalls stark variiert. Gleichzeitig wurden große Unterschiede im prozentualen Anteil an PDE4 gefunden. In nahezu der Hälfte der untersuchten Xenografts stellen Isoenzyme der PDE4-Familie weniger als 50% an der Gesamt-PDE-Aktivität dar. Bei Untersuchungen des großzelligen humanen Lungenxenografts LXFL529, der verglichen mit allen anderen untersuchten Tumoren die höchste PDE-Aktivität aufweist, konnte gezeigt werden, dass dieses Tumorgewebe PDE4D3 zu enthalten scheint, die jedoch sehr leicht proteolytisch gespalten wird. Außerdem wurden kurze Formen des PDE4D-Gens detektiert. Dabei könnte es sich um PDE4D1, PDE4D2 oder die von Eyschen (1999) aus LXFL529-Tumorgewebe isolierte trunkierte PDE4D3 handeln. Möglicherweise wird in LXFL529-Xenograftgewebe auch eine kurze Form einer nicht zur PDE4D-Isoenzymfamilie gehörenden PDE exprimiert. Zur genauen Bestimmung müssen noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Bislang wurden wirkmechanistische Untersuchungen mit PDE4-Hemmstoffen ausschließlich an Permanent-Zelllinien durchgeführt. Um Aussagen über die Übertragbarkeit der Ergebnisse in vitro auf die in vivo-Situation zu ermöglichen, wurde Tumorgewebe zweier unterschiedlicher Lungentumor-Xenografts, LXFL529 und das humane kleinzellige Lungenkarzinom LXFS650, bezüglich seiner cAMP-hydrolysierenden PDE-Aktivität und dem Gehalt an PDE4 mit den entsprechenden Permanent-Zelllinien verglichen. Dabei wiesen beide Zelllinien eine wesentlich niedrigere PDE-Gesamtaktivität als die entsprechenden soliden Xenograft-Tumoren auf. Der Anteil an PDE4 liegt in LXFL529L-Zellen und soliden Tumor in der gleichen Größenordnung. Auch im Cytosol von LXFS650 (Zelllinie und Tumor) wird der gleiche Prozentsatz PDE4 nachgewiesen, während er im Partikular der Zelllinie deutlich höher liegt im entsprechenden Tumor. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit waren Untersuchungen zum Wirkmechanismus des potenten PDE4-Inhibitors DC-TA-46. Dieser Hemmstoff zeigt große Unterschiede in den IC50-Werten der Hemmung isolierter PDE4 aus LXFL529-Tumorgewebe (0,016 microM) bzw. der Wachstumshemmung von LXFL529L-Zellen (2,3 microM). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Verteilung des Hemmstoffs vermutlich eine wesentliche Rolle spielt. Die PDE-Aktivität von Proteinpräparationen aus LXFL529L-Zellen wird durch DC-TA-46 mit IC50-Werten von 0,22 microM (Cytosol) und 0,5 microM (Partikular) gehemmt und unterscheidet sich in der Sensitivität damit nicht von Proteinpräparationen aus solidem Tumorgewebe. Inkubiert man jedoch LXFL529L-Zellen mit der Substanz, so erreicht man erst bei Konzentrationen > 10 -6 M eine Hemmung der cytosolischen PDE-Aktivität. Im Partikular der Zellen zeigt sich hingegen durch die Anreicherung von DC-TA-46 in Membranstrukturen eine deutliche Erhöhung der Hemmwirkung im Vergleich zur entsprechenden isolierten Proteinpräparation. Die Hemmung der intrazellulären PDE-Aktivität scheint dabei auch zelltyp-spezifisch zu sein. Analoge Versuche mit LXFS650L-Zellen zeigten eine deutlich höhere Hemmung der cytosolischen PDE im Vergleich zu LXFL529L-Zellen. Dies scheint mit der höheren Sensitivität von LXFS650L-Zellen gegenüber der wachstumshemmenden Wirkung von DC-TA-46 im Sulforhodamin B-Test zu korrelieren. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Bestimmung der intrazellulären Hemmwirkung eine wesentliche Messgröße zur Untersuchung potentieller PDE-Hemmstoffe darstellt. Deshalb wurde für die bislang in unserem Arbeitskreis zur Verfügung stehenden Pteridinderivate die Hemmung der intrazellulären PDE untersucht. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an LXFL529L-Zellen ergaben keine Anhaltspunkte für Unterschiede in der subzellulären Lokalisation der verschiedenen Derivate. Alle Substanzen scheinen sich ebenso wie DC-TA-46 in Membranstrukturen in der perinuklearen Region anzureichern. Die Derivate unterscheiden sich jedoch deutlich in ihrer Hemmung. Durch Variation der Substituenten in 4- und 7-Position bzw. an 6-Position konnte am ehesten eine gute PDE-Hemmung erreicht werden. Zwei an 7-Position substituierte Derivate mit basischem Stickstoff ohne H-Donorfunktion zeigten sogar eine bessere Inhibition der zellulären PDE als DC-TA-46. Durch Variationen der Substituenten in 2-Position des Grundgerüsts kann keine bzw. nur geringe Hemmung zellulärer PDE erreicht werden. Die meisten Veränderungen an 4 -Position konnten keine PDE-Hemmung erzielen. Für die Hemmung zellulärer PDE scheint also ein größerer Rest an 6-Position als Wasserstoff wichtig zu sein bzw. eine Wasserstoffdonorfunktion des basischen Stickstoffs in 4 -Position. Lediglich eine an 4 -Position mit einem Acetylrest substituierte Verbindung war in LXFL529L-Zellen ein potenter PDE-Hemmstoff, nicht jedoch am isolierten Enzym, was auf die Freisetzung der Leitsubstanz DC-TA-46 durch metabolische Prozesse in der Zelle zurückzuführen sein kann. Deshalb sollte bei zukünftigen biologischen Testungen nicht nur am isolierten Enzym, sondern auch in Zellen getestet werden sollte, da nur so pharmakologische Prozesse einbezogen werden. In vitro führt die Behandlung von Tumorzellen mit DC-TA-46 zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase des und zur Induktion von Apoptose [Wagner, 1998; Marko et al., 1998]. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieser Zellzyklus-Arrest nicht durch die Wirkung des Pteridinderivats auf die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p21 cip1 und p27 kip1 zustande kommt. Der cAMP-Gehalt von Zellen kann während des Zellzyklus periodischen Schwankungen unterliegen [Millis et al., 1974]. In LXFL529L-Zellen konnte eine positive Korrelation zwischen der PDE-Aktivität im Cytosol und dem Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus detektiert werden. Im Partikular hingegen ist ein deutlicher Zusammenhang zwischen der PDE-Aktivität und des Gehalts von G2/M-Phase-Zellen bzw. eine negative Korrelation zwischen partikulärer PDE-Aktivität und dem Anteil der G1-Phase-Zellen zu sehen. Da DC-TA-46 aufgrund seiner subzellulären Lokalisation hauptsächlich im Partikular wirksam ist, scheint v.a. die Hemmung der partikulären Isoenzyme für den G1-Arrest wesentlich zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun umgekehrt gezeigt werden, dass in LXFL529L-Zellen in der G1-Phase eine geringe partikuläre PDE-Aktivität vorliegt.
Bilanzierungen über die Eintrags- und Austragswege von Schwermetallen in landwirtschaftlich genutzte Flächen deuten darauf hin, daß auch in Zukunft mit einer Erhöhung der Schwermetallbelastung, insbesondere durch die Verwendung von sogenannten Sekundärrohstoffdüngern wie z.B. Klärschlamm, zu rechnen ist. Die Gehalte an Schwermetallen, insbesondere von Cd, sollten aber möglichst gering sein, um Toxizitäten und Ertragseinbußen bei Pflanzen sowie Gesundheitsschäden von Mensch und Tier zu vermeiden. Deshalb ist es notwendig, neben einer Minimierung des Neueintrages von Schwermetallen in landwirtschaftlich genutzte Flächen auch nach Wegen zu suchen, die Schwermetallaufnahme in die Pflanzen zu senken. Da es große Unterschiede in der Schwermetallakkumulation zwischen Pflanzenarten und auch -sorten gibt, sollte es möglich sein, Sorten mit besonders niedriger Schwermetallaufnahme bzw. -akkumulation in den Ernteprodukten zu züchten. Daraus leitet sich die Zielstellung der vorliegenden Arbeit ab, Zusammenhänge zwischen wichtigen Parametern der Nährstoffaufnahme, die auch für die Schwermetalle von Bedeutung sind, und den Schwermetallgehalten in den Pflanzen herzustellen, um so mögliche Wege für eine gezielte Selektion auf niedrige Schwermetallgehalte zu finden. Insbesondere die Rolle von Wurzelexsudaten bei der Mobilisierung und Aufnahme der Schwermetalle Kupfer, Zink und Cadmium soll dabei näher untersucht werden da bekannt ist, daß Pflanzen, insbesondere unter Phosphatmangel, vermehrt organische Säuren über die Wurzeln in den Boden ausscheiden und damit die chemischen Eigenschaften im nahen Bodenraum (Rhizosphäre) meßbar verändern können. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß die Mechanismen der Schwermetallmobilisierung und Aufnahme durch Pflanzen sehr komplex sind. Neben physikochemischen Bodeneigenschaften spielen insbesondere morphologische und physiologische Pflanzeneigenschaften eine große Rolle. Die Bodeneigenschaften bilden dabei die Ausgangssituation, wobei neben den Schwermetall-Gesamtgehalten insbesondere der pH-Wert, der Gehalt an organischer Substanz und der Tongehalt, sowie die Bindungsformen der Schwermetalle im Boden über den Anteil der mobilen und pflanzenverfügbaren Fraktion entscheiden. Diese Ausgangssituation wird von den Pflanzen in unterschiedlicher Weise genutzt und beeinflußt. Pflanzen mit großen Wurzelsystemen stehen zu einer größeren Bodenmenge in Kontakt. Die Ergebnisse zeigen, daß es eine positive Beziehung zwischen den Kupfer-, Zink- und Cadmiumgehalten der Sprosse von 11 Spinatsorten und dem Wurzel-Sproß-Verhältnis gibt. Die insbesondere bei P-Mangel beobachtete verstärkte Exsudation von organischen Säuren erhöht die Löslichkeit von Cu, Zn und Cd in der Rhizosphäre bei Spinat deutlich. Wenn auch das WSV offenbar für hohe Schwermetallgehalte in den Spinatsorten eine große Bedeutung hat, so wirkt sich offenbar die genotypisch variierte Säureexsudation und damit veränderte Schwermetallöslichkeit in der Rhizosphäre klar auf die Schwermetallgehalte in den Sprossen aus. Diesen Schluß lassen jedenfalls die Differenzen zwischen den Sorten Monnopa (niedrige Schwermetallgehalte, niedrige Exsudationsraten) und Tabu (hohe Schwermetallgehalte, hohe Exsudationsraten) zu. Betrachtet man die Wirkung der organischen Säuren im Boden, so zeigt sich, daß diese die Löslichkeit von Cu, Zn und Cd erhöhen. Dabei gibt es allerdings große Unterschiede in der Effektivität der einzelnen Säuren sowie in den Wirkmechanismen. Die Löslichkeit von Cu ist vor allem auf die Komplexierung mit den Säureanionen zurückzuführen. Bei den Elementen Zn und Cd wird die Löslichkeit zum Teil durch Komplexierung der Ionen, in erster Linie aber durch Änderungen im pH-Wert beeinflußt. Erst bei hohen pH-Werten tritt der Anioneneffekt in den Vordergrund. Signifikante Unterschiede bei den Aufnahmeraten von Schwermetallen aus komplexierten und unkomplexieren Schwermetallösungen konnten im Versuch nicht festgestellt werden. Daraus ergibt sich der Schluß, daß Spinatsorten mit geringer Exsudationsrate organischer Säuren in Hinsicht auf geringe Schwermetallgehalte der Sprosse positiv zu bewerten sind. Die Eigenschaften "kleines WSV" und "niedrige Exsudationsraten organischer Säuren" könnten somit aufgrund der vorliegenden Ergebnisse als Selektionskriterium für Spinat auf niedrige Schwermetallgehalte geeignet sein.
Rafts sind Mikrodomänen in der Zellmembran, die stark angereichert sind mit Sphingolipiden, Cholesterin, signaltransduzierenden Molekülen, GPI-geankerten Proteinen und einigen transmembranen Molekülen. Rafts spielen eine wichtige Rolle in der T-Zell-Funktionalität. In der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle der Rafts bei der Regulation der Zelladhäsion untersucht. Ausgehend von der Integrinaktivierung über das GPI-geankerte Molekül CD24 wurde ein genereller Mechanismus zur Regulation der Aktivität des Leukozyten-Funktions-Antigens-1 (LFA-1) in T-Lymphozyten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, daß Antikörper gegen das GPI-geankerte Molekül CD24 eine Aktivierung des LFA-1- Integrins zu induzieren vermögen. Diese Aktivierung hängt ab von der Kolokalisation des Integrins mit CD24 in den Rafts der Zellmembran und ist bedingt durch eine Vernetzung der Rafts, was zu einer Erhöhung der Avidität des Integrins führt. Das Vernetzen des Raft-Markers GM1 kann die Avidität in gleicher Weise erhöhen. In den o. g. Aktivierungsmechanismus sind die PI3-Kinase, Tyrosin-Kinasen und das Zytoskelett involviert. Cholesterin-Depletion inhibiert den Aktivierungsmechanismus des LFA-1 über Raft-Clustern. Eine physiologische Relevanz des vorgestellten Aktivierungsmechanismus konnte für aktivierte T-Zellen gezeigt werden. Durch Cholesterin-Depletion kann das basale Bindungsvermögen der Zellen reduziert werden. Die Rolle von CD24 als Raft-Molekül wurde bei der Regulation des alpha-4-Integrin in präB-Lymphozyten untersucht. In diesem System führte die Anwesenheit von CD24 auf der Zelloberfläche zur erhöhten Bindung an ein alpha-4-Integrin-Substrat. Auch in diesen Zellen ist CD24 und das alpha-4-Integrin z. T. in den Rafts lokalisiert. Der in T-Lymphozyten nachgewiesene Aktivierungsweg des Integrins durch Clustern der Rafts ist auch hier aktiv. Ein Einfluß von CD24 auf die Aktivität des alpha-4-Integrins konnte auch in der alpha-4-abhängigen Migration gezeigt werden. In CD24-negativen Zellen konnte durch externe Gabe von löslichem CD24 die alpha-4-vermittelte Bindung rekonstituiert werden. Der Effekt kann durch Cholesterin-Depletion wieder aufgehoben werden. Der gleiche Effekt gilt für die Inkubation der Zellen mit DIG-Fraktionen, die CD24 enthielten. Der Effekt war spezifisch für CD24 und wurde nicht mit GPI-geankerten Kontrollmolekülen beobachtet. PI-PLC-Behandlung von CD24-positiven Zellen reduziert die alpha-4-vermittelte Bindung. Die Ergebnisse werden im Sinne einer Funktion des CD24 bei der Stabilisierung von Raft-Clustern in der Membran diskutiert.
Ein Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von in vitro Testsystemen zur Erfassung androgener und vor allem antiandrogener Aktivität. Es gelang, drei in der Gruppe neue, unterschiedliche in vitro Testsysteme zu etablieren und mittels der bekannten Antiandrogene zu validieren. Zunächst konnte ein transienter Transaktivierungsassay unter Verwendung des Androgenrezeptor-Expressionsplasmids pSG5AR, des Reportergenplasmids pMamneoLuc und des Kontrollplasmids pSV in COS-7 Affennierenzellen aufgebaut werden. Dadurch wurde eine erste Untersuchung potentieller Androgene/Antiandrogene ermöglicht. Ein für ein effizienteres Screening benötigtes stabil transfiziertes Testsystem konnte gleichzeitig in T47D Brustkrebszellen nach stabiler Transfektion des Reportergenplasmids pMamneoLuc und entsprechender Selektion gewonnen werden. Dagegen war ein nach Transfektion von CV-1 Affennierenzellen mit pMamneoLuc und pSG5AR gewonnenes Testsystem nicht über einen längeren Zeitraum stabil. Das Plasmid pSG5AR enthält keinen Selektionsmarker und wurde daher vermutlich im Laufe der Selektionsphase von den Zellen wieder ausgeschleust. Ein transgenes Reportergentestsystem in den Osteosarkomazellen SaOS-2, wie von Wiren et al. 1997 entwickelt, konnte aufgrund des mittels RT-PCR nachgewiesenen zu geringen Androgenrezeptorgehaltes nicht nachvollzogen werden. Die beiden etablierten transgenen Reportergenassays (transienter Transaktivierungsassay in COS-7 Zellen; Transaktivierungsassay in stabilen T47D- Luc Zellen) wiesen in etwa vergleichbare Sensitivität und Präzision auf. Der zum Vergleich erfolgreich etablierte und validierte nicht transgene Reportergenassay auf Basis des endogenen Reporters PSA war dagegen deutlich sensitiver und präziser. Ein Proliferationsassay konnte weder in MFM-223 Brustkrebszellen noch in SaOS-2 Zellen etabliert werden. Dies ist im Falle der SaOS-2 Zellen auf eine veränderte Steroidhormonrezeptorausstattung zurückzuführen. In den drei etablierten in vitro Testsystemen wurden mittels online Strukturdatenbank-Recherche ausgehend von zwei vorselektierten Leitstrukturen identifizierte Verbindungen untersucht. Bei den Benzophenon-Analoga wurden Oxybenzon, p,p'-Dihydroxybenzophenon, p,p'-Dichlorbenzophenon, p,p'-Dibrom- benzophenon, p,p'-Dimethoxybenzophenon, Benzophenon und Xanthon stellvertretend herausgegriffen, bei den Phenylharnstoff-Analoga Linuron, Monolinuron, Metobromuron, Diuron, Fluometuron und Phenylharnstoff. Die Benzophenon-Analoga wurden im transienten Transaktivierungsassay und im PSA Assay, die Phenylharnstoff-Analoga im stabilen T47D-Luc Transaktivierungsassay und im PSA Assay untersucht. Im transienten Transaktivierungsassay zeigten alle untersuchten Benzophenone eindeutig antiandrogene Aktivität. Dies bestätigte sich im PSA Assay mit einer Ausnahme. Für das unsubstituierte Benzophenon konnte in diesem Testsystem auch bei hoher Konzentration (10 microM) keine antiandrogene Aktivität nachgewiesen werden. Die untersuchten Phenylharnstoff-Analoga zeigten ebenfalls in den eingesetzten Testsystemen, PSA Assay und stabiler Transaktivierungsassay, eindeutig antiandrogene Wirkung, die aber im Vergleich zu den etablierten Verbindungen Hydroxyflutamid und Vinclozolin M2 schwächer ausfiel. Der unsubstituierte Phenylharnstoff war in beiden Testsystemen auch bei 10 microM nicht antiandrogen aktiv. Androgene Effekte wurden im transienten Transaktivierungsassay in COS-7 Zellen untersucht. Anhand einer Signifikanzschwelle wurden lediglich Vinclozolin M2, p,p'- DDE und Hydroxyflutamid als eindeutig androgen aktiv identifiziert. Die erhaltenen Ergebnisse wurden zum Aufstellen von dreidimensionalen Struktur- Aktivitätsbeziehungen (3D-QSAR) herangezogen. Zur Generierung des dazu benötigten einzelnen Zahlenwertes wurden die IC50 R bzw. IC30 RWerte der gemessenen Dosis-Wirkungskurven errechnet. Dabei mußte ein erheblicher Fehler in Kauf genommen werden. Unter Verwendung der Daten aus dem PSA Assay konnte für die Phenylharnstoff-Analoga dennoch ein signifikantes Modell mit einem kreuzvalidierten q 2 -Wert von 0,36 erhalten werden. Für die Benzophenon-Analoga dagegen war aufgrund eines negativen q 2 -Wertes das erhaltene Modell nicht zuverlässig. In diesem Fall ergaben die Daten aus dem transienten Transaktivierungsassay aber ein aussagefähiges Modell mit einem q 2 -Wert von 0,47. Die beiden signifikanten Modelle können zur Vorhersage der antiandrogenen Aktivität von bisher nicht getesteten, strukturell ähnlichen Verbindungen herangezogen werden. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein wichtiger Beitrag zur Identifizierung endokriner Disruptoren geleistet werden. Mit Hilfe der validierten in vitro Testsysteme konnten die ausgewählten Leitstrukturen bestätigt und ein QSAR Ansatz zur schnellen theoretischen Prüfung von Antiandrogenen entwickelt werden.
Aus Lösungen von Bismuttrichlorid in 1,2,3-Trimethylbenzol bzw. 1,2,4-Trimethylbenzol können die gelben Aren-Komplexe Trichloro(1,2,3-trimethylbenzol)- bismut (16) und Trichloro(1,2,4-trimethylbenzol)bismut (17) isoliert und kristallstrukturanalytisch charakterisiert werden. Während 16 im festen Zustand als Schichtpolymer vorliegt, bilden die Bausteine von 17 eindimensionale polymere Ketten. Die Umsetzung von Bismut(III)-oxid mit Trifluoressigsäureanhydrid führt nicht wie frühere Arbeiten suggerieren zu Bi(O2CCF3)3 (4), sondern in der Regel zu einem Produktgemisch, bestehend aus 4, Bi(O2CCF3)3.(F3CCO)2O (22) und Bi3O(O2CCF3)7 (23). 22 konnte in Substanz isoliert und kristallstruktur- analytisch charakterisiert werden. Die Charakterisierung von 23 gelang indirekt über den dreikernigen Aren-Komplex 24, der aus hexamethylbenzol- haltigen Toluollösungen der Substanz isoliert werden kann. Ebenfalls indirekt konnte 4 über Adduktbildung mit Hexamethylbenzol und die kristallstrukturanalytische Charakterisierung des auf diesem Weg erhaltenen Aren-Komplexes 25 bestätigt werden. Bei der Thermolyse von Bismut(III)-trifluoracetat (4) in Gegenwart von Hexamethylbenzol wird zunächst die hellgelbe Verbindung 25 erhalten. Bei weiterer thermische Belastung bilden sich daraus im Verlauf mehrerer Wochen dunkelrote nadelige Kristalle von catena-Poly[tetrakis(trifluoracetato)dibismut- (Bi-Bi)-hexamethylbenzol (27). Sowohl 25 als auch 27 konnte kristallstrukturanalytisch charakterisiert werden. Das Aren-Addukt 27 enthält als Bestandteil eines Stapelverbandes mit Hexamethylbenzol das erste reduzierte Hauptgruppenelementcarboxylat. Bei Verwendung von Penta- statt Hexamethylbenzol sind die zu 25 und 27 analogen Verbindungen 28 und 29 zugänglich. Die in dieser Arbeit vorgestellten Bi(II)- und Bi(III)-trifluoracetatverbindungen besitzen unterschiedlich koordinierte Trifluoracetatliganden, woraus eine Vielfalt der Koordinationsfiguren der Bismutatome resultiert. Die Umsetzung von Bismuttrichlorid mit Trifluormethansulfonsäure liefert als Produkte das Bismut(III)-trifluormethansulfonat (30) und "BiCl(O3SCF3)2", das in Form des THF-Komplexes 31 isoliert und charakterisiert werden konnte.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Photoreaktivität von Tricarbonyl(n^5-5 -cyclohepta-2,4-dien-1- yl)mangan (1) gegenüber ausgewählten symmetrischen und unsymmetrischen Alkinen untersucht. Die neu dargestellten Verbindungen wurden säulen- und HPL-chromatographisch gereinigt und mittels IR-, 1 H-NMR- und 13 C-NMR-Spektroskopie sowie CH-Analysen charakterisiert. Des weiteren wurden zur Unterstützung der Konstitutionsaufklärung H,H-korrelierte 1 H-NMR- sowie 2D-NMR-Spektren herangezogen. Für die Verbindungen 5, 6 und 7 gelang es zudem, geeignete Einkristalle für die Kristallstrukturanalyse zu erzeugen. Bei den photochemischen Umsetzungen von 1 mit den Alkinen Diphenylacetylen (c), 1-Phenyl-2-trimethylsilylacetylen (d) und Ethoxyacetylen (h) lassen sich Komplexe isolieren, die dem Typ A entsprechen. Hierbei addiert eine Alkin-Einheit unter einer formalen [5+2]-Cycloaddition an den Cycloheptadienylliganden von 1 unter Ausbildung eines * 3:2 -gebundenen, bicyclischen [3.2.2]nona-3,6- dien-1-yl-Liganden. Werden die Alkine 2-Butin (a), c und 1-Phenylacetylen (e) als Reaktionspartner von 1 eingesetzt, so isoliert man ein weiteres 1:1-Addukt, welches aus einer einfachen CC-Verknüpfung mit anschließendem 1,8-H-Shift zwischen dem Cycloheptadienylliganden und dem Alkin hervorgeht. Als ein Folgeprodukt des Typs A sind die Verbindungen des Typs C anzusehen. Durch eine homo[5+2]-Cycloaddition eines zweiten Äquivalents Alkin an den Bicyclus, entstehen Tricarbonyl-Mangan- Verbindungen, deren tricyclische Liganden über eine * 2:2:1 -Koordination an das Zentralatom gebunden sind. Beim Einsatz der unsymmetrischen Alkine e, Trimethylsilylacetylen (f) und tert-Butylacetylen (g) erfolgt der Aufbau des Liganden dermaßen, daß eine alternierende Reihenfolge der Substituenten am Tricyclus zu erkennen ist. Dabei findet die erste CC-Verknüpfung zwischen dem zweiten Alkin und dem Bicyclus an der sterisch weniger aufwendigen Seite statt. Das Ergebnis entspricht einer formalen [5+2],homo[5+2]-Cycloaddition. Wird 3-Hexin (b) photolytisch mit 1 umgesetzt, so isoliert man nach HPL-chromatographischer Aufarbeitung Verbindung 7, die aus einer vergleichbaren Reaktion wie die des Typs C mit einer anschließenden 1,5-H-Verschiebung vom Substituenten an 11-Positionin in den Tricyclus entsteht. Auffallend für die Verbindungsklassen E und F sind die nicht vollständig abgeschlossenen [5+2],homo[5+2]-Cycloadditionen. Bedingt durch die voluminösen Reste des Alkins d, kommt es lediglich zur Ausbildung des [5+2]-Cycloadduktes, gefolgt von einer einfachen CC-Bindungsknüpfung eines zweiten Äquivalents Alkin an die 4-Position des Bicyclus. Der Ringschluß unterbleibt aufgrund der sterischen Hinderung der Reste. Bemerkenswert ist die zur Absättigung des Komplexes 14 erfolgte CO-Insertion zwischen dem Vinylen in 4-Position und dem Zentralatom. Als ein Nebenprodukt dieser Umsetzung kann die Metall-freie Verbindung 12 nach HPL-chromatographischer Aufarbeitung isoliert werden. Der Ringaufbau entspricht dem von 14. Somit kann 12 als ein Zersetzungsprodukt angesehen werden. Der zur Absättigung der Radikals nötige Wasserstoff stammt aus dem Lösungsmittel. Mit den Alkinen a und b gelingt die Isolierung von Verbindungen des Typs G. Hierbei addieren drei Einheiten des jeweiligen Alkins an den Cycloheptadienylliganden derart, daß zuerst eine einfache CC-Verknüpfung gefolgt von einem 1,8-H-Shift sowie einer darauf folgenden [5+2],homo[5+2]-Cycloaddition stattfindet. Als ein weiteres Reaktionsprodukt aus der Umsetzung von 1 mit a kann die durch zweifache Addition von a an 1 entstandene Verbindung 4 isoliert werden. Auffällig hierbei erscheint die Ringerweiterung vom Sieben- zum * 3:2 -koordinierten Achtring. Dies kann nur über eine Cyclopropan-haltige Zwischenstufe geschehen. Hierzu muß das erste an 1 addierte a einen Carben-artigen Aufbau besitzen, der aus einer 1,4-H-Verschiebung resultiert. Nach Öffnung der Cyclopropanzwischenstufe erfolgt eine zweite 1,4-H-Verschiebung sowie die Addition der zweiten Einheit a an die 5-Position des Liganden, gefolgt von einem weiteren 1,6-H-Shift, der den generellen Aufbau des Komplexes 4 abschließt. Die Molekülstruktur des Komplexes 6 zeigt, daß der Komplex formal aus einem Tricarbonyl-Mangan-C3H3- Fragment sowie vier 2-Butin-Einheiten entstanden ist. Die Bildung dieser Verbindung dürfte bis zur zweiten Anlagerung von a analog Typ C erfolgen. Im Unterschied dazu addiert sich nun ein drittes a an den koordinativ ungesättigten Komplex, so daß nach Insertion in die Mangan-Kohlenstoff-A~ -Bindung eine Kette von vier sp 2 -Kohlenstoffen vom Liganden ausgeht. Eine erneute Bindungsknüpfung mit dem Bicyclus sowie eine darauf folgende zweifache Ringspaltung des ursprünglichen Siebenrings führt zu einem substituierten Intermediat, aus dem sich durch eine anschließende formale [5+2],homo[5+2]-Cycloaddition der Komplex 6 ergibt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das biologisch aktive Alkaloid Lycorin aus Pflanzenmaterial isoliert. Durch Oxidation von Lycorin konnte das biologisch ebenfalls wirksame Lycobetain (Ungeremine) dargestellt werden. Zur Identifizierung der für die biologischen Wirkungen wesentlichen strukturellen Elemente dieser Substanzen, wurden verschiedene Phenanthridin- und Benzo[c]phenanthridin-Derivate synthetisiert und auf ihre cytotoxische Wirkung untersucht. Die biologische Wirkung der synthetisierten Substanzen wurde mittels Sulforhodamin-B-Assay, Ethidiumbromid-Verdrängungsassay und dem Kompetitionsassay mit Hoechstfarbstoff H33258 untersucht. Die wachstumshemmende Wirkung der Phenanthridin- und Benzo[c]phenanthridin-Derivate war im Vergleich zu Lycorin (~ 2 microM) und Lycobetain (~ 3 microM) deutlich niedriger und lag bei allen Substanzen über 10 microM. Auch bei den Ergebnissen zur DNA-Interaktion zeigte sich, dass keine der Phenanthridin- und Benzo[c]phenanthridin-Derivate im Ethidiumbromid-Verdrängungsassay einen ED50-Wert kleiner als 20 microM (Lycobetain: ED50 = 13 microM) bzw. im Kompetitionsassay mit H33258 einen ED50-Wert kleiner als 1 microM (Lycobetain: ED50 = 0,5 microM) besaßen.