Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Zwölf Testpflanzen des Weinbauinstituts Freiburg wurden auf deren Resistenzeigenschaften gegenüber dem Virusvektor Xiphinema index und dem GFLV getestet. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Entwicklung eines in-vitro-Testsystems für Reben, das detaillierte Einblicke in das Wurzel-Nematoden-System erlaubt. Anhand dieses in-vitro-Testsystems konnten zwei unterschiedliche Reaktionen der Wurzeln dieser Testreben auf die Saugtätigkeit der Nematoden festgestellt werden. Es konnte sowohl eine Gallenbildung als auch eine Nekrosenbildung bei den unterschiedlichen Kreuzungen der Testpflanzen beobachtet werden. Alle Testpflanzen aus verschiedenen Kreuzungen zeigten eine Abwehrreaktion gegenüber den Nematoden. Dies resultierte in Auftreten von Transkripten der Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL) und der Bildung von Superoxid-Radikalen. Bei zwei V. rotundifolia-Hybriden war zusätzlich die Callose-Synthase aktiv und es kam außerdem zu einer Callose-Deposition an den betroffenen Stellen im Wurzelgewebe. Bis auf Testpflanze 46, einem V. rotundifolia-Hybrid waren alle getesteten Reben nach vier Wochen Versuchsdauer sensitiv für eine Transmission des GFLV. Dieser Hybrid war an den Wurzeln durch die Saugtätigkeit der Nematoden nekrosenbildend und zeigte eine Callose-Synthase-Aktivität. X. index findet seine Wirtspflanzen durch Chemotaxis. Er orientiert sich anhand von Wurzelexudaten, die von Wurzeln ins Medium abgeben werden. Totes Wurzelgewebe kann der Nematode nicht lokalisieren und stellt keinen Stimulus dar. Bei knappem Nahrungsangebot nutzt der Nematode vorhandene Nahrungsressourcen aller Rebsorten mit verschiedenster Beschaffenheit. Mit dem Pflanzenhormon Methyljasmonat behandelte Wurzeln wurden gezielt gemieden. Zwei mit dem GFLV infizierte Rebflächen an verschiedenen Standorten zeigten innerhalb dreijähriger Beobachtung eine Zunahme von virustragenden Rebstöcken. Ein Hinweis auf die Verbreitung durch virusübertragende Nematoden konnte durch Bodenproben bisher nicht bestätigt werden.
Die Peltulaceae sind eine flechtenbildende Ascomycetenfamilie, die derzeit 43 morphologisch umschriebene Spezies in drei Gattungen umfasst. Systematisch gehören sie in die Ordnung Lichinales (Lichinomycetes, Pezizomycotina), ihre genaue Stellung im System der Ascomyceten ist unbekannt. Die Familie lebt exklusiv mit Cyanobakterien in Symbiose und besiedelt weltweit aride und semi-aride Habitate. Die aktuell bekannte Verbreitung zeigt Ähnlichkeiten zu derjenigen xerophytischer Moospflanzen, für die ein gondwanischer Ursprung angenommen wird. Außerdem besiedeln mehr Peltulaceen-Spezies die ehemaligen Gondwanakontinente (Afrika, Südamerika, Australien, Indien) als die übrigen, laurasischen Kontinente (Nordamerika, Europa, Asien); der Sörensen-Koeffizient für die Florenähnlichkeit beträgt 0,697. Die Hypothese, dass die Peltulaceae gondwanischen Ursprungs sind, sollte mit Hilfe einer phylogenetischen Analyse der Familie geklärt werden, indem durch darauf aufbauende geographische Analysen das Ursprungsareal auf kontinentalem Niveau identifiziert wird. Mit Hilfe des morphologischen Merkmalskomplexes ließ sich keine aufgelöste Phylogeniehypothese erstellen. Da die geographischen Analysen eine voll aufgelöste Phylogenie erfordern, wurden sechs molekulare Marker ausgewählt (nucSSU, nucLSU, mtSSU, ITS, RPB2/7-11, β-Tubulin) und zunächst für je einen Vertreter von 37 der 43 umschriebenen Morphotaxa sequenziert. Die resultierenden Stammbäume der ML- und Bayes'schen Analysen waren unterschiedlich gut aufgelöst und untereinander dergestalt inkompatibel, dass unterschiedliche monophyletische Beziehungen unterstützt wurden. Außerdem wies das β-Tubulin-Gen eine paraloge Kopie auf. Durch Kompatibilitätstests ließen sich keine Teilmengen kongruenter Daten feststellen. Die dennoch durchgeführte kombinierte Analyse aller sechs Marker war vom phylogenetischen Signal des RPB2/7-11-Gens dominiert und ließ sich nicht durch geographische, morphologisch-anatomische oder ökologische Merkmale bestätigen. Zwei verschiedene Methoden zur Detektion von Rekombination ergaben nicht-übereinstimmende Signale nur in der nucLSU beziehungsweise in allen Markern außer der ITS. Von den Genen ITS und RPB2/7-11 wurden zusätzlich Sequenzen weiterer Peltulaceae-Individuen erzeugt und ML- und Bayes‘sche Analysen durchgeführt, in der die Vertreter von zwölf Morphospezies keine monophyletischen Einheiten bildeten. Die Suche nach phylogenetischen Spezies mittels der Konsensusmethode zeigte lediglich eine nicht-terminale Gruppierung unterschiedlicher Morphotaxa: die Vereinigung dreier durch eine peltate Wuchsform charakterisierte Spezies. Dieses Merkmal besitzen jedoch auch andere, in dieser Gruppierung nicht eingeschlossene Spezies. Die Monophylie der Peltulaceae wurde mit molekularen Daten bestätigt, die Stellung im System der Ascomyceten konnte jedoch nicht geklärt werden. Die Existenz der Gattungen Neoheppia und Phyllopeltula konnte mittels molekularer Marker nicht bestätigt werden. Sie werden als taxonomische Konsequenz mit dem älteren Gattungsnamen Peltula synonymisiert, womit die Familie monogenerisch wird. Die vorhandenen Inkongruenzen zwischen den molekularen Markern deuten auf genetisch nicht isolierte Taxa hin. Die Peltulaceae werden nun als ein Spezieskomplex mit bisher ungeklärter Spezieszahl gedeutet. Die morphologische Speziesumschreibung bedarf einer Neubewertung, da sie sich größtenteils nicht mit molekularen Daten bestätigen ließ. Die Klärung der Ausgangsfrage nach dem geographischen Ursprung der Peltulaceae muss die Überarbeitung der Speziesabgrenzungen abwarten.
Haustoria of the rust fungus pathogen Uromyces fabae deliver RTP1 (Rust Transferred Protein1) into host plant cells. In this work, different heterologous expression systems were used to study RTP1 biological function as well as RTP1 transfer mechanism. The first part of this thesis focused on the identification of the subcellular target compartment of RTP1 in plant cells. In this respect we could identify a functional bipartite nuclear localization signal within RTP1. However, stable and transient expression studies of RTP1 in different plant species, including the host plant Vicia faba, interfered with plant cell vitality but did not result in detection of RTP1 protein. These findings led us to propose that RTP1 interferes with plant gene expression. However, the molecular basis of this interference remains unclear. By deletion studies, we could localize the active region of RTP1 within a 45 amino acid central domain. In the second part of this study, two different lines of approaches were taken to study RTP1 transfer mechanism. First, transient expression of secreted RTP1 (sRTP1) also interfered with plant cell vitality. Addition of an endoplasmic reticulum retention signal abolished sRTP1 interference with plant cell vitality, suggesting that RTP1 can reenter the plant cell from the apoplast after secretion in the absence of the pathogen. We have identified a PEST-like region within RTP1, however, contribution of this region to the stability of RTP1 is not clear. Site directed mutagenesis analysis showed that the PEST-like region is likely to play a role during the transfer of RTP1 through plant plasma membrane. In the second line of approach, we established a recombinant delivery model, using Ustilago maydis/Zea mays pathosystem, to pursue RTP1 translocation into the plant cell. Our results indicate that U. maydis is capable of secreting high amounts of recombinant RTP1, showing similar glycosylation pattern as RTP1 secreted from rust haustoria. Our data propose the use of this model system to study RTP1 domains mediating its entry into the plant cell. Haustoria of the rust fungus pathogen Uromyces fabae deliver RTP1 (Rust Transferred Protein1) into host plant cells. In this work, different heterologous expression systems were used to study RTP1 biological function as well as RTP1 transfer mechanism. The first part of this thesis focused on the identification of the subcellular target compartment of RTP1 in plant cells. In this respect we could identify a functional bipartite nuclear localization signal within RTP1. However, stable and transient expression studies of RTP1 in different plant species, including the host plant Vicia faba, interfered with plant cell vitality but did not result in detection of RTP1 protein. These findings led us to propose that RTP1 interferes with plant gene expression. However, the molecular basis of this interference remains unclear. By deletion studies, we could localize the active region of RTP1 within a 45 amino acid central domain. In the second part of this study, two different lines of approaches were taken to study RTP1 transfer mechanism. First, transient expression of secreted RTP1 (sRTP1) also interfered with plant cell vitality. Addition of an endoplasmic reticulum retention signal abolished sRTP1 interference with plant cell vitality, suggesting that RTP1 can reenter the plant cell from the apoplast after secretion in the absence of the pathogen. We have identified a PEST-like region within RTP1, however, contribution of this region to the stability of RTP1 is not clear. Site directed mutagenesis analysis showed that the PEST-like region is likely to play a role during the transfer of RTP1 through plant plasma membrane. In the second line of approach, we established a recombinant delivery model, using Ustilago maydis/Zea mays pathosystem, to pursue RTP1 translocation into the plant cell. Our results indicate that U. maydis is capable of secreting high amounts of recombinant RTP1, showing similar glycosylation pattern as RTP1 secreted from rust haustoria. Our data propose the use of this model system to study RTP1 domains mediating its entry into the plant cell.
Sepsis ist eine lebensbedrohliche Krankheit und eine der häufigsten Todesursachen auf Intensiv-Stationen. Eine der Hauptursachen für die Schwere dieser Krankheit ist die Lymphopenie, d. h. die apoptotische Depletion von Lymphozyten, die vor allem in der späten hypo-inflammatorischen Phase der Sepsis auftritt. Die dafür verantwortlichen Signalwege sind jedoch nicht im Detail geklärt. Die Liganden-vermittelte Aktivierung von PPARgamma (‚peroxisome proliferator activated receptor gamma’), einem wichtigen Regulator der Immunantwort, führt zur Apoptose in aktivierten T-Zellen. Daher postulierte ich, dass die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen zur Lymphopenie während der Sepsis beiträgt. Hierbei konnte ich zeigen, dass T-Zellen aus dem peripheren Blut von Sepsis-Patienten eine stark erhöhte PPARgamma-mRNA-Expression zeigten und in vitro stark erhöhte Apoptoseraten infolge einer Liganden-vermittelten PPARgamma-Aktivierung aufwiesen. Die hierfür erforderlichen PPARgamma-Liganden lagen im Plasma von Sepsis-Patienten vor. D. h. die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen könnte zur nachgewiesenen Lymphopenie während der Sepsis beitragen. Aufgrund der anti-inflammatorischen Wirkung von PPARgamma könnte dessen gezielte Aktivierung in der frühen hyper-inflammatorischen Phase durch Thiazolidindione (TZDs) als synthetische PPARgamma-Aktivatoren therapeutisch interessant sein. Da diese jedoch auch auf PPARgamma-unabhängigen Wegen den Zelltod in T-Zellen induzieren können, war es essentiell, die dafür verantwortlichen Signalwege zu klären. Dabei konnte ich feststellen, dass Ciglitazon Nekrose und Troglitazon Apoptose auf PPARgamma-unabhängigen Wegen bereits nach 4 h in Jurkat T-Zellen induzierten, wohingegen Rosiglitazon keinen Einfluss auf den Zelltod hatte. Die Inkubation der TZDs führte zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, welche eine wichtige Rolle bei der Ciglitazon-induzierten Nekrose, jedoch nur marginal bei der Troglitazon-induzierten Apoptose spielten. Durch Studien in submitochondrialen Partikeln konnte ich zeigen, dass die getesteten TZDs den Komplex I der mitochondrialen Atmungskette inhibierten, während nur Ciglitazon und Troglitazon zusätzlich den Komplex II hemmen konnten. Mit Hilfe synthetischer Atmungskette-Inhibitoren konnte ich weiterhin zeigen, dass die Zelltod-Induktion nach Ciglitazon und Troglitazon in Jurkat T-Zellen hauptsächlich auf der Hemmung des Komplexes II beruhte. Da die Ciglitazon-Inkubation zur Depletion des ATP-Gehaltes führte, erfolgte eine Nekrose-Induktion nach Ciglitazon, wohingegen Troglitazon den ATP-Gehalt nicht beeinflusste und daher Apoptose induzierte. Die von mir identifizierten PPARgamma-unabhängigen Mechanismen der Zelltod-Induktion durch TZDs könnten eventuell Nebenwirkungen bei TZD-basierten Therapien erklären.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Membranproteine mit strukturellen Ähnlichkeiten zu Anion:Cation-Symportern, insbesondere zu den Transportern der NaPi1- Familie aus Tieren untersucht. Neben den bereits bekannten Anion-Transporter (ANTR) aus Arabidopsis thaliana (ROTH et al., 2004) wurde in dieser Arbeit eine homologe Proteinfamilie aus Oryza sativa identifiziert. Dabei konnte die funktionelle Verwandtschaft der Proteine AtANTR5 aus A. thaliana und OsANTR5.1 aus O. sativa mittels Komplementation der antr5-Mutante nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung der physiologischen Bedeutung des AtANTR5-Proteins in der Phosphathomöostase, im Stickstoffstoffwechsel oder bei Pathogenbefall. Mittels GFP-Fusionsexperimenten konnte für AtANTR5 eine subzelluläre Lokalisierung im Golgi-Apparat festgestellt werden. Durch AtANTR5-Promotor-GUS-Pflanzen wurde die gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des Membranproteins untersucht. AtANTR5 weist in den meisten Geweben eine sehr geringe Transkriptmenge auf und ist mittels GUS-Färbung nur in Pollen detektierbar. Dennoch ist das AtANTR5-Protein für die ganze Pflanze von essentieller Bedeutung, da eine Inaktivierung des Gen zu gravierenden phänotypischen Veränderungen, gekennzeichnet durch zwergenhaften Wuchs, eingerollten Blättern und Blattläsionen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu tierischen Phosphattransportern, wurde zunächst der Einfluss von AtANTR5 auf die Phosphathomöostase in entsprechenden „knock out“-Mutanten untersucht. Es konnte jedoch keine Veränderungen im Phosphathaushalt festgestellt werden. Vielmehr weist die antr5-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Aminosäuren, Ammonium und Salz auf. Offensichtlich ist die durch AtANTR5 Transportaktivität innerhalb des Golgi-Apparates von außerordentlichen Wichtigkeit für den pflanzlichen Stoffwechsel. Des weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen AtANTR5 und Pathogenabwehr festgestellt werden. „Northern-Blot“-Analysen zeigten eine Induktion der AtANTR5-Expression als Antwort auf Pathogenbefall durch P. syringae. Zytologische sowie histochemische Analysen haben bei antr5-Pflanzen die Ausprägung zahlreicher Abwehrmechanismen, wie Ablagerungen von Callose in den Zellwänden, Akkumulation von phenolischen Metaboliten, Salizylsäure, PR Proteinen und Wasserstoffperoxid oder Absterben der Zellen, gezeigt. Weiterhin konnte eine erhöhte Resistenz der antr5-Pflanzen gegenüber dem Befall von P. syringae ermittelt werden. Durch die Expression des NahG-Gens in antr5-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Expression der PR-Gene Salizylsäure abhängig, das spontane Absterben der Zellen jedoch Salizylsäure unabhängig war. Dieses Befund lässt den Schluss zu, dass erhöhte SA-Akkumulation und die dadurch aktivierte Abwehr, sekundäre Effekte der AtANTR5-Inaktivierung darstellen.
Esterases and lipases are widely used as industrial enzymes and for the synthesis of chiral drugs. Because of their rich secondary metabolism, Streptomyces species offer a relatively untapped source of interesting esterases and lipases. S. coelicolor and S. avermitilis contain 51 genes annotated as esterases and/or lipases. In this study I have cloned 14 different genes encoding for lipolytic enzymes from S. coelicolor (11 genes) and S. avermitilis (four genes). Some of these genes were over-expressed in E. coli. Three of the produced enzymes, which were produced by the genes SCO 7131, SCO6966 and SCO3644, were characterized biochemically and one of them was subjected for directed evolution. The gene estA (locus SCO 7131) was annotated as a putative lipase/esterase in the genome sequence of S. coelicolor A3(2), but does not have a homologue in the genome sequence of S. avermitilis or in other known Streptomyces sequences. estA was cloned and expressed in E. coli as a His-tagged protein. The protein was purified and could be recovered in its non-tagged form after digestion with factor Xa. The relative molecular weight was estimated to be 35.5kDa. The enzyme was only active towards acetate esters and not on larger substrates. It had a stereospecificity towards α-naphathylacetate. It was thermostable, with a half-life at 50C of 4.5 hours. Est A showed stability over pH range 5.5-10, and had optimum pH of 7.5. Its activity was drastically decreased when it was pre-incubated in 10mM PMSF, Cu+2 and Hg+2. It was not very stable in most organic solvents and had only slight enantioselectivity. Est A belongs to the HSL family whose founder member is the human hormone-sensitive lipase. I have developed a protein profile for the HSL family modifying the conserved motifs found by Arpigny and Jaeger (1999). Due to the presence of several HSL members with known 3D structure and good homology to Est A, I was able to make a homology model of Est A. Five different mutants of Est A were produced through site directed mutagenesis: W87F, V158A, W87F/V158A, M162L and S163A. The mutants M162L and S163A did not produce a significant change either in substrate specificity or enzyme kinetics. The mutants V158A and W87F/V158A could act on the larger substrates p-nitrophenylbutyrate and caproate and tributyrin. The mutant V158A had improved thermostability and its t1/2 at 50ºC increased to 24h. The affinity of V158A towards p-nitrophenyacetate increased 6-fold when compared with the wild type, whereas the affinity of W87F decreased 4-fold. Directed evolution of Est A was done through random mutagenesis and ER-PCR. A library of 6336 mutants was constructed and screened for mutants with a broader spectrum of substrate specificity. The mutant XXVF7 did show alteration in the substrate specificity of Est A. The mutant XXVF7 had 5 amino acids changes L76R, L146P, S196G, W213R and L267R. The gene locus SCO 6966 (estB gene) was cloned and expressed in E. coli as a His-tagged protein. It was not possible to remove the His-tag using factor Xa. The tagged protein had a molecular weight 31.9kDa. Est B was active against short chain fatty acid esters (C2-C6). Its optimum temperature was 30ºC and was stable for 1h at temperatures up to 37ºC. The enzyme had maximum activity at pH 8-8.5 and was stable over pH range 7.5-11 for 24h. It was highly sensitive for PMSF, Cu+2 and Hg+2. The enzymatic activity deceased in presence of organic solvents, however it was fairly stable for 1h in 20% organic solvents solutions. A third esterase was produced from the gene locus SCO 3644. This esterase was a thermosensitive one with optimum temperature of 35ºC. The three characterized enzymes included a thermophilic, mesophilic and psychrophilic ones. This indicates the high variation in the characters of Streptomyces lipolytic enzymes and highlighting Streptomyces as a source for esterases and lipases of interesting catalytic activity. This study was an initial trial to provide a strategy for a comprehensive use of genome data.