Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Die Resistenz solider Tumoren gegenüber der Behandlung mit Medikamenten oder Bestrahlung ist ein häufig auftretendes Phänomen. Insbesondere das Auftreten von Chemoresistenzen stellt ein großes Problem bei der Behandlung von Krebs dar. Aufgrund einer Unterversorgung des Gewebes kommt es in soliden Tumoren zur Bildung des so genannten ‚hypoxischen Kern’ (hypoxic core), welcher bei der Progression und Metastasierung des Tumors eine wichtige Rolle spielt. Es wird diskutiert, inwieweit Hypoxie an der Entstehung von Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Therapieansätzen beteiligt ist. Das Ziel der Arbeit war es, die Fragestellung zu klären, ob Hypoxie vor Apoptose, ausgelöst durch Chemotherapeutika, schützt. Wenn sich diese Vermutung bestätigen sollte, sollten die zu Grunde liegenden Mechanismen dieser Chemoresistenz aufgeklärt werden. Es konnte festgestellt werden, dass es in A549 Zellen unter Hypoxie durch ein Zusammenspiel mehrerer unabhängiger Signalwege zum Schutz vor Etoposid-induzierter Apoptose kommt. Zum einen induziert Hypoxie die Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1. Über einen intrazellulären Mechanismus, wahrscheinlich der Expression anti-apoptotischer Zielgene, kommt es zur Desensitivierung der Zellen gegenüber der Behandlung mit Etoposid. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass es unter Hypoxie unabhängig von HIF-1 zur Freisetzung von Schutzfaktoren kommt. Diese vermitteln über auto- oder parakrine Wege anti-apoptotische Signale. Hypoxie führte zu einer Akkumulation der Cyclooxygenase-2 (COX-2), welche maßgeblich an der Freisetzung des Schutzfaktors beteiligt ist. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass die Stimulation mit PGE2 zu einer erhöhten Resistenz von A549 Zellen gegenüber Etoposid-induzierter Apoptose führte. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die basale Aktivität der Sphingosin-Kinasen für die Vitalität von A549 Zellen essenziell ist. Unter Hypoxie wurde darüber hinaus eine Aktivierung der Sphingosin-Kinase 2 (SphK2) festgestellt, wodurch eine vermehrte Synthese und Freisetzung von Sphingosin-1-phosphat (S1P) induziert wurde. Es kommt unter Hypoxie über zwei unabhängige Signalwege zur Freisetzung von PGE2 und S1P, welche in Zielzellen einen chemoresistenten Phänotyp induzieren. Die Übertragung des anti-apoptotischen Signals erfolgte über die Aktivierung der ERK1/2-Signalkaskade. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass Hypoxie über die Aktivierung von HIF-1, COX-2 und SphK2 in A549 Zellen die Resistenz gegenüber Chemotherapeutika induziert. Hierbei sind neben intrazellulären Signalen auch auto- und parakrin wirkende Mechanismen beteiligt. Als Übermittler des übertragbaren anti-apoptotischen Signals konnten S1P und PGE2 identifiziert werden, die über die Aktivierung von ERK1/2 vor Apoptose schützen.
The hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), a heterodimer composed of HIF-1alpha and HIF-1beta, is activated in response to low oxygen tension and serves as the master regulator for cells to adapt to hypoxia. HIF-1 is usually considered to be regulated via degradation of its a-subunit. Recent findings, however, point to the existence of alternative mechanisms of HIF-1 regulation which appear to be important for down-regulating HIF-1 under prolonged and severe oxygen depletion. The aims of my Ph.D. thesis, therefore, were to further elucidate mechanisms involved in such down-regulation of HIF-1. The first part of the thesis addresses the impact of the severity and duration of oxygen depletion on HIF-1alpha protein accumulation and HIF-1 transcriptional activity. A special focus was put on the influence of the transcription factor p53 on HIF-1. I found that p53 only accumulates under prolonged anoxia (but not hypoxia), thus limiting its influence on HIF-1 to severe hypoxic conditions. At low expression levels, p53 inhibits HIF-1 transactivity. I attributed this effect to a competition between p53 and HIF-1alpha for binding to the transcriptional co-factor p300, since p300 overexpression reverses this inhibition. This assumption is corroborated by competitive binding of IVTT-generated p53 and HIF-1alpha to the CH1-domain of p300 in vitro. High p53 expression, on the other hand, affects HIF-1alpha protein negatively, i.e., p53 provokes pVHL-independent degradation of HIF-1alpha. Therefore, I conclude that low p53 expression attenuates HIF-1 transactivation by competing for p300, while high p53 expression negatively affects HIF-1alpha protein, thereby eliminating HIF-1 transactivity. Thus, once p53 becomes activated under prolonged anoxia, it contributes to terminating HIF-1 responses. In the second part of my study, I intended to further characterize the effects induced by prolonged periods of low oxygen, i.e., hypoxia, as compared to anoxia, with respect to alterations in HIF-1alpha mRNA. Prolonged anoxia, but not hypoxia, showed pronounced effects on HIF-1alpha mRNA. Long-term anoxia induced destabilization of HIF-1alpha mRNA, which manifests itself in a dramatic reduction of the half-life. The mechanistic background points to natural anti-sense HIF-1alpha mRNA, which is induced in a HIF-1-dependent manner, and additional factors, which most likely influence HIF-1alpha mRNA indirectly via anti-sense HIF-1alpha mRNA mediated trans-effects. In summary, the data provide new information concerning the impact of p53 on HIF-1, which might be of importance for the decision between pro- and anti-apoptotic mechanisms depending upon the severity and duration of hypoxia. Furthermore, the results of this project give further insights into a novel mechanism of HIF-1 regulation, namely mRNA down-regulation under prolonged anoxic incubations. These mechanisms appear to be activated only in response to prolonged anoxia, but not to hypoxia. These considerations regarding HIF-1 regulation should be taken into account when prolonged incubations to hypoxic or anoxic conditions are analyzed at the level of HIF-1 stability regulation.