Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Faculty / Organisational entity
Streptococcus pneumoniae ist ein human-pathogenes Bakterium, das den Nasopharnyx gesunder Menschen besiedeln kann. Das Bakterium kann sich lokal ausbreiten und zu schweren invasiven Erkrankungen führen, wie der Pneumonie, der Meningitis und der Sepsis. Zahlreiche, vor allem oberflächenlokalisierte Proteine ermöglichen die Kolonisierung und Invasion der Pneumokokken. Von Zysk et al. (2000) wurden über ein Genbankscreening neue Proteine von S. pneumoniae gefunden. Eines davon ist die Serinprotease PrtA, die 2001 von Bethe näher untersucht wurde. PrtA ist eine in der Zellwand der Pneumokokken verankerte Protease, die als Prä-Pro-Protein synthetisiert wird. Im Mausmodell zeigte sich die Virulenz der Protease. Aufgrund der immunogenen Eigenschaften wird PrtA als potentieller Vakzine-Kandidat beschrieben. In der vorliegenden Arbeit sollte die Serinprotease PrtA nativ aufgereinigt und Untersuchungen zur biologischen Funktion durchgeführt werden. Über eine durch ortsspezifische Mutagenese hergestellte Mutante konnte die Protease nativ aus dem Kulturüberstand als ein HisTag-Fusionsprotein aufgereinigt werden. Neben den zwei angenommenen Hauptformen von PrtA mit Molekulargewichten von 240 kDa und 215 kDa konnten weitere Formen des PrtA durch Westernblot-Analysen identifiziert werden. Mehrere PrtA-Fragmente sowie die Identifizierung mehrerer Proteinspots bei einer zweidimensionalen Auftrennung des aufgereinigten PrtA, legen den Schluss nahe, dass es sich bei der Protease um ein instabiles Protein handelt. Diese Autoprozessierung zeigte sich als konzentrationsabhängig. Die genauen Prozessierungsstellen konnten noch nicht geklärt werden. Die Expression der Protease unterliegt einer Regulation. Sowohl auf transkriptionaler wie auf translationaler Ebene zeigte sich eine Beeinflussung der Expression von PrtA durch atmosphärische Bedingungen, sowie durch Glukose. Eine Beteiligung von PrtA am Abbau der in der Arbeit erwähnten Substrate konnte mit den verwendeten Methoden nicht gezeigt werden. Bindungsversuche von Pneumokokken an Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin, Kollagen I, III und IV, ließen keine Beteiligung des PrtA an der Bindung an die jeweiligen Proteine erkennen. Einen Hinweis auf die Modifikation eines bakterieneigenen Proteins durch PrtA, ergaben zweidimensionale Untersuchungen des Protein-Expressionsprofils. Das modifizierte Protein konnte bislang noch nicht analysiert werden. Die Identifizierung dieses Proteins würde neue Einblicke in den Aufgabenbereich der Protease liefern.
Die vorliegende Arbeit gliedert sich in die drei Themenschwerpunkte FICTION-Technik (Fluorescence-Immunophenotyping and Interphase Cytogenetic as a Tool for Investigation of Neoplasms), SKY-Technik (Spectral Karyotyping) und Kultivierungsverfahren. Mittels der FICTION-Technik konnte gezeigt werden, dass die Trisomie 12 bei 53 untersuchten B-CLL-Patienten mit etwa 11% deutlich seltener auftrat, als in der Literatur beschrieben. Es scheint eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer Trisomie 12 und einer atypischen B-CLL vorzuliegen, da drei der sechs Fälle mit Trisomie 12 eine atypische B-CLL Variante darstellten. Bei einem Fall konnte der Trisomie 12 tragende Klon über 13 Monate beobachtet werden und zeigte in diesem Zeitraum keine signifikante Veränderung. Der Klon blieb weitestgehend stabil. Eine aus Vorversuchen von Doris Herrmann vermutete Existenz einer Monosomie 12 bei B-CLL-Patienten (persönliche Miteilung) hat sich nicht bestätigt. Bei allen untersuchten Proben lagen die Zellen mit Monosomie 12 unter dem ermittelten cut off level von 10,2% für die Hybridisierung. Als zweiter Schwerpunkt wurde die Einsatzfähigkeit der SKY-Technik in der Tumorzytogenetik durch die Analyse von 20 Tumorfällen ausgetestet. Unter den 20 untersuchten tumorzytogenetischen Fällen konnte bei 12 der durch G-Bänderung erhobene Befund verbessert und erweitert werden. Bei drei Fällen wurden neue, in der G-Bandenanalyse nicht gefundene Aberrationen identifiziert und in fünf Fällen bestätigte sich der G-Bandenbefund. Die SKY-Technik erwies sich als wertvolle Methode zur weiteren Charakterisierung von komplex aberranten Karyotypen oder zur Identifikation von Markerchromosomen, wobei nicht alle Aberrationen aufklärt werden konnten. Unter den 20 untersuchten Fällen wurde bei zwei myeloischen Erkrankungen neben einer Monosomie 7 die Translokation t(3;21)(q26;q22) gefunden. Möglicherweise kommt diese häufiger als bisher beschrieben in myeloischen Erkrankungen vor, weil sie durch die G-Bandenanalyse nicht sicher erkannt wird. Vorzugsweise scheint sie neben einer Monosomie 7 aufzutreten. In dem Schwerpunkt, der sich mit der Kultivierung von neoplastischen B-Zellen beschäftigte, konnte ein neues Kultivierungsverfahren für B-Zellen entwickelt werden. Eine Kultivierung mit MP-6 Zellen konditioniertem ISCOVE-Medium und dem Phorbolester TPA zeigte in 15 von 20 Proben einen synergistischen Effekt auf die Proliferationssteigerung (um das 1,5-21 fache) gegenüber dem TPA-Standardansatz in RPMI-Medium. Durch eine Metaphasenanalyse von fünf Fällen mit numerischen Mosaikbefunden konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen aberranten und normalen Klonen bei beiden Kultivierungsarten etwa gleich blieb. Eine Lebend-Tot-Bestimmung vor und nach der Kultivierung zeigte, dass nach 72-stündiger Kultivierung in den Kulturen mit dem höchsten Mitoseindex die durchschnittlich Lebendzellzahl am geringsten (ca. 70%) war.
Bei Frauen ist Brustkrebs mit einem Viertel aller Krebserkrankungen die am häufigsten diagnostizierte Krebsart, während die Inzidenz bei Männern wesentlich geringer ist. Nur 10-15% aller Brustkrebserkrankungen können auf familiär prädisponierende Faktoren wie BRCA1 und BRCA2 zurückgeführt werden. Eine genetische Prädisposition bei hereditärem männlichem Brustkrebs wird für BRCA2 bestätigt. Funktionelle Analysen geben Grund zur Annahme, dass BRCA2 eine duale Rolle besitzt. Neben der Caretaker-Funktion für genomische Stabilität, ist auch eine Gatekeeper-Funktion bei der Transkriptionsregulation beschrieben. Die Basis dieser Arbeit beruht auf der Beobachtung, dass männliche BRCA2-Mutationsträger von 3 verschiedenen Familien mit hereditärem Brustkrebs auffällige chromosomale Veränderungen der Region 9p23-24 aufweisen. Vorarbeiten ließen einen kausalen Zusammenhang zwischen BRCA2-Mutation und 9p-Veränderung möglich erscheinen. Das Ziel der Arbeit bestand darin, durch molekularbiologische Methoden die Bruchpunkte in 9p23-24 bei BRCA2-Mutationsträgern unabhängiger Familien zu identifizieren und damit einen weiteren Hinweis auf die Entstehung dieser Instabilität zu geben. In dieser Arbeit konnten mittels FISH, PFGE und bioinformatischer Techniken sowohl Inversionen als auch Duplikationen festgestellt werden. Eine überlappende Inversion zeigte sich hierbei deutlich bei allen untersuchten Mutationsträgern. Mit einer FISH-Analyse konnte bei den Mutationsträgern der Familien 1 bis 3 eine Inversion im Bereich der STS-Marker D9S267 und D9S775 detektiert werden. Ferner konnte durch Interphasen-FISH eine Duplikation im Bruchpunktbereich um den STS-Marker D9S268 identifiziert werden. Southern-Analysen konnten Bruchpunkte in den Mutationsträgern der Familien 1 und 2 mittels der Enzyme EcoRI und SacI bestätigen. In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich die Inversionsbruchpunkte der Mutationsträger 3.3, 3.4 und 3.5 von Familie 1 in der unmittelbaren Nähe von low-copy repeats befinden, deren Größe 5kb-8kb beträgt. Die identifizierte Inversion überspannt im Wesentlichen die Gene TYRP1 und mPDZ. Bei dem durch die Inversion direkt betroffenen Gen handelt es sich um das mPDZ-Gen. Das Protein besitzt 13 PDZ-Domänen, deren Interaktionspartner beschrieben sind. Die Genexpression beider Gene konnte in lymphoblastoiden Zellen nachgewiesen werden. Die Erkenntnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass Repeat-Sequenzen in der Umgebung der Bruchpunkte bei der Entstehung von Rearrangements auch in diesen BRCA2-Mutationsträgern eine große Rolle spielen.
Die obligat endocytisch in Paramecium lebenden bakteriellen Symbionten der Gattung Caedibacter können bislang weder außerhalb ihrer Wirtszellen kultiviert noch genetisch transformiert werden. Entsprechend limitiert sind unsere Möglichkeiten der Erforschung oder gar Nutzung dieser Bakterien. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zur Isolierung der Endosymbionten aus Paramecien etabliert und Strategien zur genetischen Transformation von Paramecium-Endosymbionten getestet. Es zeigte sich, dass eine Transformation außerhalb der Wirtszellen nicht möglich ist, da die Bakterien nicht in vitro selektiert werden können und eine Reinfektion der Symbionten entsprechender aposymbiontischer Wirtszellen auf dem vermuteten Infektionsweg scheiterte. Die Transformation der Endosymbionten sollte daher direkt in den Paramecien erfolgen. Es wurden Verfahren entwickelt, mit deren Hilfe die Transformation der Endosymbionten mittels Elektroporation bzw. Partikelbombardement innerhalb der Wirtszellen getestet wurde. Die zu diesen Versuchen eingesetzten Plasmide verfügten über verschiedene Replika mit nachweislich weitem Wirtsspektrum. Als Markergene dienten zum einen ein Streptomycinresistenz-Gen und zum anderen zwei Varianten des Green Fluorescent Protein. Es zeigte sich, dass die Transformation von Caedibacter derzeit noch nicht möglich ist. Weiterhin wurde untersucht, ob der Promotor des RebC-Locus aus Caedibacter für eine Kontrolle einer heterologen Genexpression unter natürlichen Bedingungen in Frage kommt. Durch Studien mit Hilfe von Promotorsonden-Vektoren, in die die entsprechende Sequenz vor ein GFP-Gen kloniert wurde, konnte in E. coli gemessen werden, inwieweit unterschiedliche physiologische Stressbedingungen zu einer Aktivierung des RebC-Promotors führen. Die Promotorstudien erfolgten nach zwei unterschiedlichen Verfahren. Unter den getesteten Stressfaktoren bewirkten Hunger und Hitzeschock die stärkste Aktivierung des untersuchten Promotors. Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen Hinweis darauf, dass die R-Körpersynthese in Caedibacter in der Natur unter Mangel- bzw. Stressbedingungen erfolgt.
Das Plasmid pKAP298 aus Caedibacter taeniospiralis, einem obligaten Parasiten aus Paramecium tetraurelia, wurde in Gänze sequenziert, analysiert und annotiert, mögliche vom Plasmid kodierte Funktionen wurden charakterisiert. Es konnten Plasmid-Fragmente mit Transkriptions-Aktivität identifiziert werden, eine Transkriptions-Aktivitätskarte bildet die Basis zur weiteren Identifizierung der aktiven ORFs. Anhand der Transkriptions-Aktivität und den identifizierten putativ kodierenden ORFs auf dem Plasmid pKAP298 konnten neue Hinweise auf ein wahrscheinlich auf dem Plasmid lokalisiertes Toxin-Gen gegeben werden. Aus Ähnlichkeiten zu schon bekannten Sequenzen konnte die Hypothese, dass pKAP298 aus einem Bakteriophagen evolvierte, gestützt und erweitert werden