Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Die steigende Verfügbarkeit von Smartphones und Tablet-PCs in der Schule bieten neue methodische und mediale Wege der Unterrichtsgestaltung, die zur Beurteilung der Lernwirksamkeit eine wissenschaftliche Betrachtung erfordern. Während zahlreiche Publikationen zu Augmented Reality (AR) im Bildungskontext existieren, fehlt es an einer differenzierten Betrachtung der Lernwirksamkeit AR-typischer Merkmale sowie breit angelegter Untersuchungsdesigns. Ziel dieser Arbeit ist es, die Lernwirksamkeit von AR in authentischen biologischen Unterrichtsszenarien multiperspektivisch zu betrachten. Zur Beurteilung der Lernwirksamkeit wurden Daten zu Lernzuwachs (LZ), Cognitive Load (CL), Nutzungserlebnis (UX), empfundener Lernunterstützung (ELU) sowie zur Immersion gemessen. Die Forschungsfragen beziehen sich auf den Einfluss der Art des Mediums, der Steuerung, des Triggers und der medialen Repräsentation auf die Lernwirksamkeit.
Die Untersuchungen wurden mithilfe eigens entwickelnder AR-Apps mit 769 Teilnehmenden aus rheinland-pfälzischen Gymnasien und zwei Universitäten durchgeführt. Neben dem Nachweis theoretischer Zusammenhänge der untersuchten Parameter mittels Strukturgleichungsmodellierung konnten mehrheitlich signifikante Unterschiede im LZ zugunsten von AR festgestellt werden. Darüber hinaus zeigten die Studien dieser Arbeit einen positiven Einfluss von AR auf den CL, sodass sich der Einsatz von AR nicht nachteilig auf die kognitive Belastung auswirkt. Neben des überdurchschnittlich bis exzellenten Abschneidens der AR-Apps im Benchmark-Vergleich (Vergleichsgruppe n = 20190 (Schrepp, 2019)), konnten positive Effekte der UX-Dimension Stimulation auf die Reduktion des lernhinderlichen Extraneous Cognitive Loads und die Steigerung des lernförderlichen Germane Cognitive Loads nachgewiesen werden. Hinsichtlich der ELU zeigten sich verschiedene mediale Präferenzen der Teilnehmenden, sodass durch die Verwendung von AR im Sinne eines wechselnden Medieneinsatzes die Bedürfnisse aller Lernenden abgedeckt werden kann. Weiterhin erreichten die Teilnehmenden die höchste der drei Ebenen der Immersion, sodass die Art des Triggers die 21 Immersionsfaktoren von Georgiou und Kyza (2017a) ergänzt.
Die Arbeit leistet auf Grundlage der Identifikation von AR-typischen Merkmalen einen Beitrag zum besseren Verständnis der lernwirksamen Potenziale von AR-basierten Lernumgebungen und zeigt darüber hinaus theoriebildende Implikationen zur Messung des CL auf. Ob sich mithilfe von AR der CL senken lässt, bedarf es Untersuchungen in Lernsettings, die einen hohen CL aufweisen. Weiterhin bietet der ARI-Fragebogen einen geeigneten Ausgangspunkt zur Erforschung AR-typischer Immersionsfaktoren. Trotzdem bedarf es weiterer Studien zur Validierung des ARI-Fragebogens und zur systematischen Untersuchung der Lernwirksamkeit von AR-typischen Merkmalen.
Omics-basierte Untersuchungen zum Wirkmechanismus des makrozyklischen Lactons Oxacyclododecindion
(2023)
Die Suche nach neuen therapeutischen Wirkstoffen ist, aufgrund der geringen Erfolgsquote vor allem
in späteren Phasen der Zulassung, nach wie vor eine große Herausforderung. Für einen möglichst
effizienten Entwicklung- und Zulassungsprozess zu erhöhen, ist eine möglichst genaue
Charakterisierung des Moleküls und der davon ausgehenden biologischen Aktivität sinnvoll. Eine
wertvolle Quelle an potenziellen Wirkstoffen stellen Sekundärmetaboliten aus Bakterien, Algen,
Pflanzen oder Pilzen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene, aus Pilzen isolierte Stoffe
näher untersucht, die durch eine phänotypische Wirkstoffsuche gefunden wurden. Im Gegensatz zu
einer Target-basierten Wirkstoffsuche, wird sich bei dieser Methode nicht auf ein bestimmtes
Zielprotein fokussiert, sondern in einem zellbasierten System nach Stoffen gesucht, die einen
phänotypischen Effekt hervorrufen. Das genaue Target bleibt daher zunächst unbekannt.
Hauptsächlich wurde das Makrolacton Oxacyclododecindion (Oxa) bzw. dessen Derivate untersucht.
In phänotypischen Analysen stellte sich Oxa bereits in der Vergangenheit als vielversprechender
Wirkstoff zur Behandlung inflammatorischer und fibrotischer Erkrankungen heraus. Verschiedene
Derivate des Naturstoffs wurden durch die Abteilung für Organische Chemie der Johannes
Gutenberg-Universität Mainz synthetisiert und im Rahmen dieser Arbeit auf ihre biologische Aktivität
hin untersucht. So konnte der Einfluss verschiedener Derivatisierungen auf die biologische Aktivität
analysiert und mit bereits publizierten Derivaten verglichen werden. So konnte die optimale Position
für weitere Funktionalisierungen des Moleküls gefunden werden.
Neben der Analyse globaler Effekte auf BEAS-2B und HepG2 stand vor allem die Identifikation
möglicher Targets im Vordergrund. Dazu wurden zunächst verschiedene Ansätze zur Identifikation
von Proteinen, die an das besonders aktive Derivat 14-Deoxy-14-methyloxacyclododecindion (DM-Oxa) binden, durchgeführt. So konnten bereits erste Kandidaten, insbesondere das
Hitzeschockprotein HSP90, als mögliche Interaktoren identifiziert werden. Dieses Protein hat einen
zentralen Stellenwert in zahlreichen zellulären Prozessen, wodurch es bereits als mögliches Target
für verschiedene Erkrankungen bekannt ist.
Um erstmals einen Einblick in die globalen Effekte von DM-Oxa auf die Genexpression und das
Proteom in verschiedenen Zelltypen zu erhalten, wurden sowohl mRNA-Sequenzierungs- als auch
MS-Proteomics-Ansätze durchgeführt. Somit konnten bereits bekannte Charakteristika verifiziert und
neue Einblicke in beteiligte Signalwege gewonnen werden. Im Rahmen dieser Analysen konnten
potenzielle Zielproteine von DM-Oxa identifiziert werden. Darunter beispielsweise die zentralen
Transkriptionsfaktoren FOXO3 und AP-1.
Auch die Rolle von HSP90 als möglicher Interaktionspartner von DM-Oxa wurde weiter beleuchtet.
Dazu wurde eine Co-Immunpräzipitation mit HSP90 Antikörpern durchgeführt, um Veränderungen in
der Abundanz von Proteinen, die an HSP90 binden, festzustellen. Solche Veränderungen könnten
auf die Blockade von Bindestellen durch DM-Oxa hinweisen. Tatsächlich wurde die Abundanz von
100 bekannten Interaktionspartnern durch DM-Oxa Behandlung signifikant beeinflusst, sodass die
Rolle von HSP90 als Oxa-Target weiter ins Zentrum rückt.
Neben der Analyse von Oxacyclododecindion und verschiedenen Derivaten wurden zwei weitere
bisher unveröffentlichte Naturstoffe aus einem Pilz der Gattung Alternaria näher untersucht. Diese
gehören zu Klasse der Perylenchinone und zeigten zum Teil toxische und oxidative Wirkung in
BEAS-2B-Zellen, was durch verschiedene Versuchsansätze nachgewiesen werden konnte.
Die Sensorkinasen MsmS und RdmS aus dem methanogenen Archaeon M. acetivorans liegen
mit Genen, die für die Regulatoren der Msr-Familie, MsrG, MsrF und MsrC, kodieren, assoziiert
im Genom vor und sind an der Regulation der methylsulfidspezifischen Methyltransferasen
MtsH, MtsD und MtsF beteiligt, die für die Verstoffwechselung von Methylsulfiden innerhalb
der Methanogenese von Bedeutung sind. Diese Systeme eignen sich bestens, um die
Signaltransduktion in Archaea im Allgemeinen besser zu verstehen und wurden daher im
Rahmen dieser Arbeit näher charakterisiert.
Im Vorfeld wurden die Sensorkinasen MsmS und RdmS als Häm-basierte Redoxsensoren
beschrieben, die an Serin- oder Tyrosinresten phosphoryliert werden. Entgegen dieser
Annahme konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RdmS keine Autokinaseaktivität
aufweist und dass die in vorangegangenen Studien identifizierten Phosphorylierungen auf
unspezifische Interaktionen der Proteine mit ATP unter den getesteten Bedingungen
zurückzuführen sind. ATP-Binde- und Hydrolyseassays konnten allerdings zeigen, dass RdmS
in der Lage ist, ATP zu binden und dieses auch zu hydrolysieren. Aufgrund der genomischen
Organisation wurde daher ein Phosphatgruppentransfer von RdmS auf den Regulator MsrF
untersucht. Dies konnte jedoch nicht bestätigt werden und auch andere Phosphoakzeptor
konnten im Zuge dieser Arbeit nicht identifiziert werden.
Mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie und in vivo Crosslinking-Experimenten konnte die Interaktion der Sensorkinase RdmS mit den Regulatoren MsrF und
MsrC und die Interaktion der Sensorkinase MsmS mit dem Regulator MsrG bestätigt werden.
Auf Grundlage dieser und vorangegangener Analysen sind die Kinasen jeweils in der Lage,
mit allen drei Msr-Regulatoren zu interagieren, weshalb angenommen werden kann, dass das
untersuchte Signaltransduktionssystem ein Multi-Komponenten-System darstellt und die
Kinasen und Regulatoren miteinander kreuzregulieren.
Durchgeführte Electrophoretic mobility shift assays zeigen, dass MsrG, MsrF und MsrC
spezifisch an die Promotorbereiche der mts-Gene binden. Dabei konnte eine Bindung jeweils
nur an den mts-Promotorbereich identifiziert werden, der mit dem jeweiligen msr-Gene
assoziiert auf dem Genom vorliegt. Die Bindestellen von MsrF im mtsD-Promotor und die
Bindestelle von MsrG im mtsH-Promotor konnten zudem auf einen ca. 140 bp bzw. 60 bp
großen Bereich stromaufwärts des Transkriptionsstarts begrenzt werden und legen beiden
Regulatoren somit eine Rolle als Transkriptionsaktivator nahe. Durch Sequenzvergleiche
konnte in diesen Bereichen zudem das putative Bindemotiv ATCAA-xxxxxx-TTGAT
ausgemacht werden, welches jedoch in weiterführenden Analysen bestätigt werden muss.
Das Zytosol ist der Hauptort der Proteinbiosynthese. Während viele Proteine im Zytosol
bleiben, muss ein Großteil zu unterschiedlichen Kompartimenten der Zelle transportiert
werden. Die korrekte Lokalisation der Polypeptide ist essentiell für die Homöostase der Zelle.
Werden Proteine fehlgeleitet oder gar nicht transportiert, können diese in der Zelle
aggregieren, was zu Stress bis hin zum Zelltod führen kann. Obwohl der Import
mitochondrialer Proteine über die verschiedenen Membranen der Mitochondrien sehr gut
erforscht ist, war lange unklar, wie diese Proteine zu ihrem Zielorganell transportiert werden.
In den letzten Jahren wurde diese Wissenslücke teilweise gefüllt, neue zytosolische Faktoren
wurden identifiziert und alternative Transportwege aufgedeckt.
Eine solche Entdeckung war der Transportweg namens ER-SURF. Hier werden
mitochondriale Proteine an die Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert, wo
sie vom Co-Chaperon Djp1 gebunden und zu den Mitochondrien gebracht werden. Im Zuge
der Studie zu ER-SURF wurde ein Protein identifiziert, das bisher noch uncharakterisiert war.
Dieses Protein nannten wir Ema19 („Efficient Mitochondria Targeting–Associated Protein
19”). Es ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das vier
Transmembrandomänen besitzt.
Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von Ema19 für die Zelle zu analysieren. Durch ein
Alignment konnte ich feststellen, dass das Protein bis in den Menschen hoch konserviert ist,
was auf eine wichtige Rolle für die Zelle schließen ließ. Da Ema19 im Zusammenhang mit
dem ER-SURF Transportweg identifiziert wurde, habe ich zunächst eine mögliche Rolle für
den Transport und Import mitochondrialer Proteine in unterschiedlichen Experimenten
getestet. Im Laufe der Arbeit wurde jedoch deutlich, dass Ema19 keine direkte Rolle beim
Import von mitochondrialen Proteinen spielt. Allerdings konnte ich durch mehrere
unabhängige Versuche einen Zusammenhang mit der Lokalisation und dem Abbau
mitochondrialer Proteine feststellen. Fehlt Ema19 in der Zelle, ist vor allem das
mitochondriale Protein Oxa1 mehr am endoplasmatischen Retikulum vorzufinden. Ebenso
konnte ich feststellen, dass Oxa1, sowie das Intermembranraumprotein Erv1, langsamer
abgebaut werden als in Wildtypzellen. Diese Experimente geben erste Hinweise auf eine
mögliche Rolle von Ema19 für den Abbau mitochondrialer Proteine an der ER-Membran.
Nichtsdestotrotz bleiben noch viele Fragen offen und weitere Versuche sind nötig, um diese
Hypothese weiter zu unterstützen.
Untersuchungen zur Struktur und Spezifität der Phycobiliproteinlyase CPES aus Guillardia theta
(2020)
Cryptophyten verwenden neben Chlorophyll zusätzliche Lichtsammelproteine für die Photo-synthese – die Phycobiliproteine (PBP). In Cyanobakterien, Rotalgen und Glaukophyten sind PBP ebenfalls ubiquitär verbreitet. Für den Zweck der Lichtsammlung tragen die PBP- Untereinheiten kovalent gebundene offenkettige Tetrapyrrol-Chromophore an konservierten Cysteinresten. Diese Phycobiline sind in der Lage, grünes Licht zu absorbieren und es für die Photosynthese zur Verfügung zu stellen. Die Fähigkeit zur Photosynthese erlangten Crypto-phyten bei der sekundären Endosymbiose durch Aufnahme einer früheren Rotalge. Die evolutionäre Entwicklung brachte schließlich modifizierte PBP hervor. In Gegensatz zu ande-ren Organismen liegen die PBP in Cryptophyten in löslicher Form im Thylakoidlumen des Plastiden vor. Cryptophyten besitzen lediglich einen Typ an PBP, Guillardia theta verwendet Phycoerythrin PE545. Die α-Untereinheiten sind jeweils mit einem Molekül 15,16-Dihydrobi-liverdin (DHBV) und die β-Untereinheiten mit drei Molekülen Phycoerythrobilin (PEB) chromophoryliert. Die Chromophorylierung cryptophytischer Apo-PBP ist bisher wenig un-tersucht und verstanden. Aus Cyanobakterien ist jedoch bekannt, dass die Chromophorylie-rung häufig mit Hilfe von Phycobiliproteinlyasen (PBP Lyasen) stattfindet, welche die Phyco-bilinübertragung unterstützen.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der eukaryotischen S-Typ-PBP Lyase GtCPES aus G. theta. Mittels Fluoreszenzspektroskopie und Zink-induzierter Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass GtCPES den Transfer von 3(Z)-PEB auf Cys82 der PBP-β-Untereinheit aus Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB) vermittelt. An der PEB-Bindung sowie am -Transfer beteiligte Aminosäuren wurden mit Hilfe Zielgerichteter Muta-genese identifiziert. Anhand spektroskopischer Binde- und Transferstudien mit den Protein-varianten wurden drei Aminosäuren in der Ligandenbindetasche ermittelt, die relevant für die Bindung sind (Trp69, Glu136, Glu168). Diese koordinieren vermutlich PEB in der Bindetasche und stabilisieren somit die Konformation. Zusätzlich konnten zwei im PEB-Transfer involvierte Aminosäuren eindeutig identifiziert werden (Trp75, Ser150). Trp75 kommt dabei eine essenzielle Bedeutung für den Transfer zu. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Met67 für die auf PEB und DHBV beschränkte Substratspezifität von GtCPES verantwortlich ist. Die Variante GtCPES_M67A bindet sowohl PEB als auch das rigide Phycocyanobilin (PCB) stabil unter Bildung eines farbigen Komplexes in vitro und in vivo in Escherichia coli. GtCPES_M67A scheint zudem in der Lage zu sein, PCB auf geeignete Apo-Proteine zu transfe-rieren. Neben der sterischen und elektrostatischen Umgebung entscheidet damit zusätzlich die Substratspezifität der PBP Lyase über die gebundenen Chromophore am PBP.
Die Funktion der c-di-GMP modulierenden Membranproteine NbdA und MucR in Pseudomonas aeruginosa
(2019)
NbdA und MucR sind Multi-Domänenproteine aus Pseudomonas aeruginosa. Beide Proteine besitzen eine ähnliche Domänenorganisation mit einer N-terminalen, membranständigen
MHYT-Domäne sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne im Cytoplasma. Die
cytosolischen Domänen von MucR sind beide aktiv, während NbdA neben der intakten
EAL-Domäne eine degenerierte GGDEF-Domäne mit dem Motiv AGDEF aufweist. Bioinformatischen
Vorhersagen zufolge soll die MHYT-Domäne eine sensorische Funktion für diatomische Gase wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoff vermitteln. Die phänotypische Charakterisierung der markerlosen PAO1-Deletionsmutanten \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR und \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR zeigte, dass NbdA und MucR nicht in die NO-induzierte
Dispersion involviert sind. Ebenso konnte in einem neu etablierten heterologen in-vivo-System in E. coli keine NO-sensorische Funktion der Proteine detektiert werden. Im Weiteren wurde festgestellt, dass die MHYT-Domäne keinen ersichtlichen Einfluss auf die
Enzymaktivität von NbdA und MucR unter aeroben Bedingungen hat. Demzufolge fungiert
die Membrandomäne vermutlich weder als Sensor für Sauerstoff, noch für NO. Anhand heterologer Komplementationstests konnte eine PDE-Aktivität des NbdA-Volllängenproteins
nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die degenerierte AGDEF-Domäne einen regulatorischen Effekt auf die EAL-Domäne hat, der essentiell für die in-
vivo-Aktivität von NbdA ist. In-vivo-Untersuchungen bestätigten die postulierte DGC-Aktivität von MucR. Weiterhin konnte belegt werden, dass MucR ein bifunktionelles Enzym
ist. Entgegen den Erwartungen scheint es jedoch im Planktonischen als DGC und im
Biofilm als PDE zu fungieren.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der homologen Überexpression
von nbdA in P. aeruginosa, welche teilweise unerwartete Phänotypen ergab. Anhand
der homologen Überproduktion einer inaktiven NbdA-Variante stellte sich heraus, dass die
Hemmung der Motilität unabhängig von der Aktivität von NbdA auftritt. Massenspektrometrische
Analysen deuteten daraufhin, dass NbdA lokal c-di-GMP hydrolysiert. Diese
Ergebnisse implizieren, dass NbdA eine Trigger-PDE ist, deren primäre Funktion die Regulation
anderer makromolekularer Zielmoleküle ist. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ist bekannt, dass das NbdA-Homolog Pfl01_1252 mit den Homologen von MucR (Pfl01_2525) und SadC (Pfl01_4451) interagiert. Ergebnisse einer früheren Arbeit lassen eine Interaktion
von NbdA und SadC ebenso in P. aeruginosa vermuten. Daher ist denkbar, dass sich
NbdA im gleichen Netzwerk wie MucR und SadC befindet und deren Aktivität reguliert.
Botrytis cinerea, der Erreger der Graufäule, infiziert hunderte verschiedene Pflanzenspezies und verursacht weltweit enorme landwirtschaftliche Verluste. Dabei tötet er das Wirtsgewebe sehr schnell mithilfe lytischer Enzyme und Nekrose-induzierender Metaboliten und Proteine ab. Das Signal-Mucin Msb2 ist in B. cinerea, wie in anderen pathogenen Pilzen, wichtig für die Oberflächenerkennung, Differenzierung von Appressorien und die Penetration des Pflanzengewebes. Msb2 agiert oberhalb der BMP1 Pathogenitäts-MAPK-Kaskade. In dieser Studie konnte eine direkte Interaktion zwischen Msb2 und BMP1, sowie zwischen den beiden Sensorproteinen Msb2 und Sho1 nachgewiesen werden. Dennoch führte die Deletion von sho1 lediglich zu geringfügigen Defekten im Wachstum, der Hyphendifferenzierung und der Bildung von Infektionsstrukturen. Sho1 zeigte nur einen geringen Einfluss auf die Aktivierung von BMP1. Das Fehlen von Sho1 verursachte keine Virulenzdefekte, während der Doppel-KO von msb2 und sho1 zu einer stärkeren Reduzierung der Läsionsausbreitung im Vergleich zu msb2 Mutanten führte. Es wurden mehrere keimungsregulierte, BMP1 abhängige Gene deletiert und die Mutanten phänotypisch charakterisiert. Keines der Gene für lytische Enzyme oder putative Effektorproteine beeinflusste die Virulenz. Mutanten, denen das für ein Ankyrin-repeat Protein codierende arp1 Gen fehlt, zeigten eine gestörte Oberflächenerkennung, gravierende Wachstumsdefekte und reduzierte Virulenz.
B. cinerea VELVET-Mutanten sind in der lichtabhängigen Differenzierung und der Ausbreitung nekrotischer Läsionen beeinträchtigt. In dieser Arbeit ermöglichte die Charakterisierung mehrerer Mutanten ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge, aufgrund derer der VELVET-Komplex die Entwicklung und Pathogenese in B. cinerea reguliert. Quantitative Vergleiche der in planta Transkriptome und Sekretome führten zur Identifizierung eines für drei VELVET-Mutanten gemeinsamen Sets an herunterregulierten Genen, welche für CAZymes, Proteasen und Virulenz-assoziierte Proteine codieren. Die meisten dieser Gene wurden zusätzlich im Wildtyp während der Infektion verstärkt exprimiert, was zusätzliche Hinweise auf deren Relevanz im Infektionsprozess lieferte. Die drastisch verringerte Expression von Genen für Proteasen konnte mit niedrigerer Proteaseaktivität und der unvollständigen Mazeration des Gewebes an der Infektionsstelle in Verbindung gebracht werden. Der neu etablierte quantitative Sekretom-Vergleich des Wildtyps und der VELVET-Mutanten mithilfe 15N-markierter Proteine korrelierte eindeutig mit den Transkriptomdaten sekretierter Proteine. Damit wurde gezeigt, dass die Abundanz der Proteine maßgeblich von deren mRNA-Level abhängt. Die Unfähigkeit zur Ansäuerung des Wirtsgewebes ist einer der interessantesten phänotypischen Aspekte der VELVET-Mutanten. Während Citrat die dominierende von B. cinerea ausgeschiedene Säure ist, sekretierten VELVET-Mutanten deutlich weniger Citrat. Weder für Oxalat noch für Gluconat konnte eine wichtige Rolle während der Infektion bestätigt werden. Die Läsionsausbreitung der Mutanten wurde sowohl durch Zugabe von Vollmedium, als auch durch künstlich konstant niedrig eingestellte pH-Werte an den Infektionsstellen gefördert, während die Einstellung auf neutrale pH-Werte die Expansion beim B. cinerea Wildtyp stark beeinträchtigte. Damit ist die Ansäuerung in Tomatenblättern ein wichtiger Virulenzmechanismus, der möglicherweise essentiell für die Aktivität der sekretierten Proteine ist.
Überraschenderweise scheint eine Ansäuerung des Gewebes für die erfolgreiche Infektion der Ackerbohne Vicia faba nicht notwendig zu sein. Weder B. cinerea noch der am nächsten verwandte Botrytis fabae, welcher sich als Spezialist auf V. faba aggressiver verhält, zeigten während der erfolgreichen Infektion eine Ansäuerung des Ackerbohnenblattgewebes. B. fabae ist auf wenige Wirtspflanzen der Fabaceae begrenzt. Die Grundlagen der Wirtsspezifität sind bisher unklar. Vergleichende Transkriptom- und Sekretom-Analysen ergaben Hinweise für die molekularen Ursachen der unterschiedlichen Wirtsspektren von B. cinerea und B. fabae. In dieser Arbeit konnte die schlechte Infektion durch B. fabae auf Tomatenblättern mit einer deutlich niedrigeren Proteaseaktivität in Verbindung gebracht werden, während artifiziell konstant niedrige pH-Werte die Läsionsausbreitung kaum förderten. Im Gegensatz zur Infektion von Tomatenblättern wurden jedoch auf V. faba insgesamt deutlich niedrigere Proteaseaktivitäten in den Sekretomen beider Spezies gemessen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die beiden Spezies nicht nur generell unterschiedliche Infektionsstrategien anwenden, sondern dass die Virulenzmechanismen zusätzlich vom infizierten Pflanzengewebe abhängig sind.
Diversitätsgenerierende Retroelemente (DGRs) wurden im Jahre 2002 in Bordetella‐Phagen entdeckt
und stellen eine einzigartige Klasse unter den Retroelementen dar. Durch einen speziellen „Copy‐and‐
Replace“ Mechanismus sind sie in der Lage ein bestimmtes Zielgen zu hypermutieren. Bei diesem
Mutagenic Homing‐Prozess wird die RNA der Templat‐Region (TR) durch die elementeigene reverse
Transkriptase (RT) transkribiert. Die dabei entstandene mutierte cDNA wird anschließend in die
variable Region (VR) des Zielgens inkorporiert und dieses somit diversifiziert. Hierbei steht der
experimentelle Nachweis für die Hypermutation durch die RT noch aus. Zudem spielt das akzessorische
Protein (Avd) eine weitere wichtige Rolle im Mutagenic Homing Prozess, wobei dessen tatsächliche
Funktion noch nicht charakterisiert werden konnte. Bis dato gibt es vor allem Analysen in Bezug auf
das Bordetella‐Phagen DGR, womit sich die Frage nach anderen Systemen und allgemeiner
Anwendbarkeit stellt. Daher war die Analyse des Nostoc sp. PCC 7120 DGR Hauptgegenstand dieser
Arbeit, wobei der Fokus auf der Untersuchung der reversen Transkripase (nRT), sowie der
Charakterisierung des akzessorischen Proteins (nAvd) aus dem Nostoc sp. PCC 7120 DGR lag.
Die nRT konnte überexprimiert werden, wobei sie nur teilweise löslich vorlag. Eine effektive
Aufreinigung der nRT konnte mit den hier getesteten Methoden nicht erzielt werden, sodass andere
Aufreinigungsmethoden erprobt werden müssen. Zudem war die nRT nicht lagerfähig, wodurch eine
regelmäßige neue Proteinpräparation nötig war. In Aktivitätsstudien konnten erste Hinweise auf eine
Aktivität der nRT erhalten werden. Dabei konnten die entstandenen Nukleinsäuren nicht nur
detektiert, sondern auch mittels analytischem Verdau als DNA identifiziert werden. Darüber hinaus
konnte die synthetisierte cDNA mittels PCR amplifiziert und die PCR‐Produkte anschließend
sequenziert werden. Hierbei wurden jedoch keine Adenin‐spezifischen oder sonstigen Mutationen
beobachtet. Somit konnte kein Nachweis für Hypermutation durch die RT erbracht werden. Bei
Untersuchungen bezüglich einer möglichen Interaktion zwischen nRT und nAvd konnte keine erhöhte
nRT‐Aktivität durch die nAvd festgestellt werden.
Die Untersuchungen der nAvd zeigten, dass diese Nukleinsäuren bindet. Hierbei waren Präferenzen
gegenüber verschiedenen Nukleinsäuren zu beobachten. Vor allem RNA/DNA‐Hybride zeigt die
höchste Affinität gegenüber der nAvd, während dsDNA eine höhere Affinität zur nAvd aufweist als
ssRNA. Zudem ist die nAvd in der Lage Nukleinsäuren zu hybridisieren. Hierbei hybridisiert sie ATreiche
DNA‐Moleküle von mittlerer Länge (48 bp) am effizientesten. Ein von der nAvd katalysierter
Strangaustausch konnte nicht beobachtet werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die nAvd selbst
bis 95 °C hitzestabil ist und im Anschluss an Hitzestress weiterhin Nukleinsäuren hybridisieren kann.
Darüber hinaus ist sie befähigt Nukleinsäuren unter Hitzestress zu stabilisieren. Diese Ergebnisse lassen
auf eine Rolle der nAvd als Lotse oder zur Stabilisierung von Nukleinsäuren schließen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten weiterführende Erkenntnisse über die Regulation des Na+/H+-Antiporters AtSOS1 erbracht werden. Die Analyse von Mutanten, die den zytosolischen AtSOS1 C terminus überexprimieren, bestätigte eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Salztoleranz. Diese Feststellung lässt sich an verschiedenen Beobachtungen festmachen: Unter Salzstressbedingungen i.) akkumulieren die Überexpressionsmutanten deutlich weniger Natrium im Spross, ii.) sie blühen früher, iii.) sie weisen eine geringere Expression des Salz-induzierten Gens wrky25 auf, iv.) sie häufen geringere Mengen „kompatibler Solute“ an und v.) sie speichern weniger Stärke im Vergleich zum Wildtyp.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Überexpression der C-terminalen Domäne des SOS1 zu einer erhöhten Salztoleranz der entsprechenden Mutanten durch erhöhte Aktivierung des endogenen SOS1-Transporters führt. Es lässt sich spekulieren, dass negative Regulatoren des SOS-Signalwegs vom löslichen C-terminus abgefangen werden, wodurch ihre inhibierende Funktion auf das endogene SOS-Netzwerk verloren geht.
Im Gegensatz dazu führt der Verlust des SOS1-Transporters in den sos1 Knockout-Pflanzen zu einer erhöhten Salzsensitivität. Diese Feststellung lässt sich wiederum an verschiedenen Beobachtungen festmachen: Unter Salzstressbedingungen i.) akkumulieren die Knockout-Mutanten deutlich mehr Natrium im Spross sowie vor allem in der Wurzel, ii.) sie blühen verzögert bis gar nicht, iii.) sie weisen eine höhere Expression des Salzstress-Indikatorgens wrky25 auf, iv.) sie häufen große Mengen kompatibler Solute in Form löslicher Zucker an und v.) sie speichern mehr Stärke im Vergleich zum Wildtyp.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen zwischen dem SOS1 C terminus und den regulatorischen At14-3-3 Proteinen υ, ω, κ und λ, sowie zwischen AtTST1/AtVIK1 und 14-3-3 κ und λ mittels Bimolekularer Fluoreszenz-Komplementation verifiziert. Sie binden den SOS1 C terminus an der Stelle 1112TRQNTMVESSDEEDEDEG1129, den AtTST1 an der Stelle 361DDGAGDDDDSDNDLR375. Beide Bindemotive weisen einen hohen Anteil negativ geladener Aspartat- und Glutamat-Reste auf. Durch die Analyse von At14 3 3 λκ Knockout-Pflanzen wurden diese Proteine als Signalstoffe im Zuckerhaushalt von A. thaliana identifiziert. Ihr Fehlen führt zu einer Veränderung im „sugar sensing“ bzw. „sugar signaling“. Diese Behauptung lässt sich an verschiedenen Beobachtungen festmachen: Unter Hochzucker-Bedingungen i.) akkumulieren die Knockout-Mutanten mehr Biomasse, ii.) sie akkumulieren weniger Zucker und iii.) sie weisen eine gesteigerte Expression der Glukose-reprimierten Gene cab1 und suc2 auf.
Der rasante Anstieg an ß-lactamresistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweites medizinisches Problem dar. Für die Bekämpfung von resistenten Stämmen ist es wichtig, den Mechanismus der Resistenzentstehung zu verstehen. Die im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehenden S. pneumoniae-Isolate entstammen zwei unterschiedlichen Strategien zur Untersuchung der Entstehung und Verbreitung ß-lactamresistenter Pneumokokken. Die im Fokus des ersten Teils der vorliegenden Arbeit stehende Glycosyltransferase CpoA wurde von Grebe et al. (1997) als Resistenzdeterminante in zwei spontan-resistenten Labormutanten, P104 und P106, entdeckt. Beide wurden ausgehend von dem sensitiven S. pneumoniae R6 auf einer erhöhten Piperacillinkonzentration selektioniert. Berg et al. und Edman et al., beschrieben CpoA biochemisch als a-Galactosyl-Glycosyl-Diacylglycerin-Synthase, die einen Galactosylrest von UDP-Galaktose auf Glycosyldiacylglycerin (GlcDAG) überträgt (Berg et al., 2001; Edman et al., 2003) und so Galactosyl-Glycosyldiacylglycerin (GalGlcDAG), das Hauptglycolipid der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae bildet. Durch Detektion der Glycolipide in R6, P104, P106 und R6ΔcpoA konnten diese in vitro Daten in vivo bestätigt werden. Keine der cpoA-Mutanten wies eine detektiertbare Menge an GalGlcDAG auf. Neben der Veränderung des Glycolipidverhältnisses offenbarte die Darstellung der Membranlipide auch eine Änderung des Phospholipidverhältnisses. Die phänotypische Charakterisierung der cpoA-Mutanten zeigte eine pleiotropen Phänotyp, der mit einer verlangsamten Generationszeit, einer verminderten Säuretoleranz, einem erhöhten Bedarf an zweiwertigen Magnesiumionen, dem Verlust der natürlichen Transformierbarkeit, einer verzögerten Triton-induzierte Zelllyse, sowie eine reduzierte Bacitracinresistenz einher ging. Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse konnte gezeigt werden, dass vor allem Membranproteine, wie PTS-Systeme und ABC-Transporter, eine unterschiedliche Expressionsstärke im Vergleich zum Parentalstamm R6 aufwiesen. Als Grundlage für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit diente ein von Todorava (2010) durchgeführtes Transformationsexperiment, indem der sensitive S. pneumoniae R6 mit chromosomaler DNA des hochresistenten S. oralis Uo5 transformiert wurde. In sechs Transformationsschritten mit sukzessiv ansteigender Antibiotikakonzentration, konnten sechs Transformanten mit einer stufenweise erhöhten ß-Lactamresistenz generiert werden. Durch die Arbeiten von Todorova et al. (2015), konnte bereits gezeigt werden, dass drei niederaffine PBPs, sowie die Aminosäureligase MurE den Resistenzanstieg der ersten drei Selektionsschritte vermitteln. In dieser Arbeit wurde sich mit den Transformanten der Selektionsschritte vier, fünf und sechs beschäftigt. Durch Genomsequenzierung und anschließende Überprüfung bestimmter Sequenzbereiche konnten die Grenzen des horizontalen Gentransfers aufgewiesen werden. Der Resistenzanstieg in den letzten drei Selektionsschritten wurde nicht durch die Übertragung resistenter Uo5-Gene, sondern einzig durch Punktmutationen vermittelt. Die Charakterisierung, sowie die phänotypischen Auswirkungen der Veränderungen standen nach ihrer Identifizierung im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. In der Transformante des vierten Selektionsschrittes, PCPC, konnten zwei Punktmutationen identifiziert werden. Eine Punktmutation innerhalb des Histidinkinasegens ciaH des Zweikomponentensystems CiaRH und eine weitere in spr1992, welches für ein hypothetisches Protein codiert. Bei CiaH handelt es sich um die erste nicht-PBP-Resistenzdeterminante, die in S. pneumoniae entdeckt wurde (Guenzi et al., 1994). Es zeigte sich, dass das neu entdeckte ciaH-Allel (ciaH773) eine Hyperaktivität des CiaRH-Systems bewirkt und zur Instabilität neigt. Um das Risiko von sekundären Mutationen zu mindern, wurde die Expression von ciaH773 unter die Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors gestellt. Es konnte gezeigt werden, dass ciaH773 einen 11-fachen Anstieg der CiaR-vermittelten Genregulation, sowie eine Erhöhung der ß-Lactamresistenz bewirkt und zum Verlust der natürlichen Transformierbarkeit führt. Neben der Punktmutation in ciaH, konnte im vierten Selektionsschritt noch eine weitere Veränderung in spr1992 identifiziert werden. Beim Genprodukt von spr1992 handelt es sich um hypothetisches Protein. Blastanalysen lassen auf eine regulatorische Funktion von Spr1992 schließen. Die innerhalb dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten stark auf einen Beitrag der Punktmutation in spr1992 zur CiaR-vermittelten Genregulation, sowie zur Cefotaximresistenz in PCPC hin. Zukünftige Untersuchungen könnten den Zusammenhang von spr1992 mit dem CiaRH-System weiter spezifizieren.Innerhalb des fünften Selektionsschrittes konnte eine 10 bp Deletion in der Serinprotease HtrA detektiert werden, die aufgrund der Lokalisation im ersten Drittel der Serinprotease mit einem Knockout von HtrA vergleichbar ist. Es konnte gezeigt werden, dass die HtrA-Deletion zu einer weiteren Steigerung der CiaRH-vermittelten Genregulation, sowie zu einer Erhöhung der ß-Lactamresistenz führt. Durch Einbringen des ciaH773-Allels in S. pneumoniae R6 und anschließender htrA-Deletion konnte dieser regulatorische Effekt auch im Wildtyp-Hintergrund nachgewiesen werden. Durch anschließend durchgeführte globalen Transkriptomanalysen konnten weitere Einblicke in die regulatorische Funktion von HtrA im Hintergrund eines hyperaktiven CiaRH-Systems gewonnen werden. In PCPCCO, der Transformante des sechsten Selektionsschrittes, konnte eine Punktmutation im Penicillin-bindenden Protein 2b innerhalb des bereits im dritten Selektionsschritt ausgetauschten Uo5-Sequenzbereiches als Resistenzdeterminante identifiziert werden. Durch Einbringen von Q406P in S. pneumoniae R6 konnte das Resistenz vermittelnde Potential dieser Veränderung auch im Wildtyphintergrund nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass eine Resistenzdeterminante, die über horizontalen Gentransfer auf S. pneumoniae übertragen wurde, durch eine sekundäre Mutation, das Resistenzniveau ihres Rezipienten weiter steigern kann.