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Faculty / Organisational entity
Die Kanzerogenität von Dioxinen ist bisher am besten an der Prototyp“-Verbindung 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) untersucht worden. TCDD wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als Klasse I Kanzerogen eingestuft, obwohl bislang die Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD noch nicht hinreichend geklärt werden konnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde von der Arbeitshypothese ausgegangen, dass TCDD über die durch den Arylhydrocarbon Rezeptor (AhR) massiv vermittelte Induktion von fremdstoffmetabolisierenden Phase I Enzymen, vor allem von CYP1A1, eine erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verursacht, welche die DNA schädigen können und potenziell mutagen sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein System entwickelt, das ausreichend große Mengen an CYP1A1 exprimieren sollte ohne dass zuvor eine das Studienergebnis möglicherweise verfälschende Behandlung mit einem AhR-Agonisten (z.B. TCDD) stattgefunden hat. Erstes Ziel war die Etablierung eines geeigneten in-vivo Systems, nämlich die Erzeugung einer transgenen, humanes CYP1A1 überexprimierenden Maus. Das humane CYP1A1 Transgen wurde in den generierten, transgenen Mauslinien nicht wie erwartet exprimiert, obwohl die Integration in das Genom der Mäuse zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Zwar konnte eine Induktion von hCYP1A1 in verschiedenen Organen der Mäuse auf mRNA Ebene nachgewiesen werden, allerdings wurde im Vergleich zu Wildtyp Tieren weder eine Steigerung der CYP1A1 Proteinmenge noch deren katalytischer Aktivität erzielt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden in-vivo Untersuchungen hinsichtlich oxidativem Stress und DNA-Schädigung an TCDD behandelten C57B6 Mäusen und Sprague-Dawley Ratten bzw. an deren entsprechenden Kontrollen, sowie an transgenen Mäusen mit konstitutiv aktivem AhR (CA-AhR) durchgeführt. Die CA-AhR Linie bot eine weitere Möglichkeit, die Auswirkungen der AhR-vermittelten Genexpression ohne Verwendung eines AhR-Liganden in-vivo zu untersuchen. Als Messparameter für oxidativen Stress wurde der auf Fluoreszenz basierende H2DCFDA Assay im 96 Well Format etabliert. Als Marker für oxidative DNA-Schäden wurde der Gehalt an 8-oxo dG in genomischer DNA individueller Proben mittels HPLC-MS quantifiziert. Ob evtl. erhöhte ROS Gehalte bzw. DNA Schäden nach TCDD Expostition in einen direkten Zusammenhang mit AhR-regulierten CYP1A Induktion stehen wurde durch die Analyse der katalytischen CYP1A Aktivität mittels EROD-Assay überprüft. Die gefundenen Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die ROS Bildung möglicherweise auch im in-vivo Experiment davon abhängt, wie stark TCDD als Induktor von CYP1A Enzymen wirkt. Die Daten zeigten aber auch, dass es sich in-vivo bei der TCDD vermittelten Induktion von oxidativen DNA-Schäden vermutlich um einen chronischen Langzeiteffekt handelt, der nicht ausschließlich von TCDD Leberlast oder CYP1A Enzyminduktion abzuhängen scheint. Mit Hilfe von Mikrosomen (SupersomesTM) aus stabil transfizierten Insektenzellen wurde des weiteren das individuelle ROS-Bildungspotenzial einzelner, AhR-regulierter CYP-Enzyme mittels H2DCFDA Assay untersucht. Die SupersomesTM Experimente bestätigten generell die Hypothese, dass TCDD induzierte CYPs eine potenzielle Quelle für ROS darstellen. Generell konnte die Hypothese bestärkt werden, dass die ROS Bildung nach TCDD Exposition eine Konsequenz der AhR vermittelten CYP Induktion darstellt. Isolierte RNA aus den Lebern von Mäusen wurde mit Hilfe von Microarrays auf Veränderungen der Genexpressionsmuster untersucht, die Hinweise auf gentoxischen bzw. oxidativen Stress und andere prokarzinogene Veränderungen als Konsequenz einer TCDD Exposition bzw. der konstitutiven Aktivität des AhR geben sollten. Die (permanente) Aktivierung des AhR führte einerseits in der Leber von Mäusen generell zu einem erhöhten oxidativen Stress. Andererseits konnte gezeigt werden, dass pro- und antiapoptotische Signalwege an diesem Prozess beteiligt zu sein scheinen, möglicherweise als Konsequenz des induzierten oxidativen Stresses.