Stefanie Knerr

• Die Kanzerogenität von Dioxinen ist bisher am besten an der Prototyp“-Verbindung 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) untersucht worden. TCDD wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als Klasse I Kanzerogen eingestuft, obwohl bislang die Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD noch nicht hinreichend geklärt werden konnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde von der Arbeitshypothese ausgegangen, dass TCDD über die durch den Arylhydrocarbon Rezeptor (AhR) massiv vermittelte Induktion von fremdstoffmetabolisierenden Phase I Enzymen, vor allem von CYP1A1, eine erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verursacht, welche die DNA schädigen können und potenziell mutagen sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein System entwickelt, das ausreichend große Mengen an CYP1A1 exprimieren sollte ohne dass zuvor eine das Studienergebnis möglicherweise verfälschende Behandlung mit einem AhR-Agonisten (z.B. TCDD) stattgefunden hat. Erstes Ziel war die Etablierung eines geeigneten in-vivo Systems, nämlich die Erzeugung einer transgenen, humanes CYP1A1 überexprimierenden Maus. Das humane CYP1A1 Transgen wurde in den generierten, transgenen Mauslinien nicht wie erwartet exprimiert, obwohl die Integration in das Genom der Mäuse zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Zwar konnte eine Induktion von hCYP1A1 in verschiedenen Organen der Mäuse auf mRNA Ebene nachgewiesen werden, allerdings wurde im Vergleich zu Wildtyp Tieren weder eine Steigerung der CYP1A1 Proteinmenge noch deren katalytischer Aktivität erzielt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden in-vivo Untersuchungen hinsichtlich oxidativem Stress und DNA-Schädigung an TCDD behandelten C57B6 Mäusen und Sprague-Dawley Ratten bzw. an deren entsprechenden Kontrollen, sowie an transgenen Mäusen mit konstitutiv aktivem AhR (CA-AhR) durchgeführt. Die CA-AhR Linie bot eine weitere Möglichkeit, die Auswirkungen der AhR-vermittelten Genexpression ohne Verwendung eines AhR-Liganden in-vivo zu untersuchen. Als Messparameter für oxidativen Stress wurde der auf Fluoreszenz basierende H2DCFDA Assay im 96 Well Format etabliert. Als Marker für oxidative DNA-Schäden wurde der Gehalt an 8-oxo dG in genomischer DNA individueller Proben mittels HPLC-MS quantifiziert. Ob evtl. erhöhte ROS Gehalte bzw. DNA Schäden nach TCDD Expostition in einen direkten Zusammenhang mit AhR-regulierten CYP1A Induktion stehen wurde durch die Analyse der katalytischen CYP1A Aktivität mittels EROD-Assay überprüft. Die gefundenen Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die ROS Bildung möglicherweise auch im in-vivo Experiment davon abhängt, wie stark TCDD als Induktor von CYP1A Enzymen wirkt. Die Daten zeigten aber auch, dass es sich in-vivo bei der TCDD vermittelten Induktion von oxidativen DNA-Schäden vermutlich um einen chronischen Langzeiteffekt handelt, der nicht ausschließlich von TCDD Leberlast oder CYP1A Enzyminduktion abzuhängen scheint. Mit Hilfe von Mikrosomen (SupersomesTM) aus stabil transfizierten Insektenzellen wurde des weiteren das individuelle ROS-Bildungspotenzial einzelner, AhR-regulierter CYP-Enzyme mittels H2DCFDA Assay untersucht. Die SupersomesTM Experimente bestätigten generell die Hypothese, dass TCDD induzierte CYPs eine potenzielle Quelle für ROS darstellen. Generell konnte die Hypothese bestärkt werden, dass die ROS Bildung nach TCDD Exposition eine Konsequenz der AhR vermittelten CYP Induktion darstellt. Isolierte RNA aus den Lebern von Mäusen wurde mit Hilfe von Microarrays auf Veränderungen der Genexpressionsmuster untersucht, die Hinweise auf gentoxischen bzw. oxidativen Stress und andere prokarzinogene Veränderungen als Konsequenz einer TCDD Exposition bzw. der konstitutiven Aktivität des AhR geben sollten. Die (permanente) Aktivierung des AhR führte einerseits in der Leber von Mäusen generell zu einem erhöhten oxidativen Stress. Andererseits konnte gezeigt werden, dass pro- und antiapoptotische Signalwege an diesem Prozess beteiligt zu sein scheinen, möglicherweise als Konsequenz des induzierten oxidativen Stresses.
• The carcinogenicity of dioxins is mostly investigated based on the “prototype” compound 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). In 1997 TCDD was classified as a group 1 carcinogen by the International Agency for Research on Caner (IARC) though the the mechanisms of TCDDs carcinogenic effects are to a great extent still unknown. In this thesis it was hypothetised that TCDD causes increased levels of reactive oxygen species (ROS) via the arylhydrocarbon receptor (AhR) mediated induction of phase I enzymes, especially of CYP1A1. This may lead to DNA damage, mutations and cancer. A transgenic mouse model was developed. The desired effect was the overexpression of a recombinant human CYP1A1 enzyme in various organs of transgenic mice. The CYP1A1 transgene was not expressed as expected in the genereted mouse lines, though the integration of the transgene into the mouse genome was unequivocally shown. Compared to wild type mice, induction of human CYP1A1 mRNA levels was measured in the transgenic animals. No inreased CYP1A protein or activity amounts were measured in the transgenic mice compared to wild type. In the second chapter of the thesis C57/B6 wild type mice, transgenic mice expressing a constitutively active AhR (CA-AhR) and Sprague Dawley rats were applied to investigate if AhR mediated induction of CYP1A enzymes causes increased ROS formation and DNA damage in the liver of the animals. The fluorescence-based H2DCFDA assay was utilized to dertermine hepatic ROS levels. The amount of 8-oxo dG as a marker of oxidative DNA damage was quantified in genomic liver DNA of the animals. EROD assay was used to measure the catalytic activity of CYP1A enzymes and to investigate if increased CYP1A catalytic activity corresponds with ROS formation and DNA damage in the liver of the animals. Thr results showed that ROS formation in-vivo possibly depends on the potency of TCDD as inducer of CYP1A enzymes. Additionally, the data showed that induction of oxidative DNA damage is presumably a chronical long-term effect which is not solely dependent on TCDD body burden and CYP1A enzyme induction. Using SupersomesTM (microsomes prepared from insect cells, expressing various single recombinant CYP enzymes) the relative ROS formation potencies of single CYP enzymes as well as the influence of selected test substances on ROS formation was investigated using the H2DCFDA assay. In general the hypothesis was confirmed that AhR regulated CYPs are a potential source for ROS formation. Microarrays representing genes involved in stress and toxicity were performed with hepatic RNA isolated from TCDD-treated, and from CA-AhR mice and were compared to wild type and vehicle controls, respectively. The microarray data indicated, among others, differential expression of hepatic genes involved in apoptotic processes for both the TCDD treated and the transgenic mice. Additionally it was shown that a (permanent) activation causes increased hepatic oxidative DNA damage.