Tobias Schmid

• The hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), a heterodimer composed of HIF-1alpha and HIF-1beta, is activated in response to low oxygen tension and serves as the master regulator for cells to adapt to hypoxia. HIF-1 is usually considered to be regulated via degradation of its a-subunit. Recent findings, however, point to the existence of alternative mechanisms of HIF-1 regulation which appear to be important for down-regulating HIF-1 under prolonged and severe oxygen depletion. The aims of my Ph.D. thesis, therefore, were to further elucidate mechanisms involved in such down-regulation of HIF-1. The first part of the thesis addresses the impact of the severity and duration of oxygen depletion on HIF-1alpha protein accumulation and HIF-1 transcriptional activity. A special focus was put on the influence of the transcription factor p53 on HIF-1. I found that p53 only accumulates under prolonged anoxia (but not hypoxia), thus limiting its influence on HIF-1 to severe hypoxic conditions. At low expression levels, p53 inhibits HIF-1 transactivity. I attributed this effect to a competition between p53 and HIF-1alpha for binding to the transcriptional co-factor p300, since p300 overexpression reverses this inhibition. This assumption is corroborated by competitive binding of IVTT-generated p53 and HIF-1alpha to the CH1-domain of p300 in vitro. High p53 expression, on the other hand, affects HIF-1alpha protein negatively, i.e., p53 provokes pVHL-independent degradation of HIF-1alpha. Therefore, I conclude that low p53 expression attenuates HIF-1 transactivation by competing for p300, while high p53 expression negatively affects HIF-1alpha protein, thereby eliminating HIF-1 transactivity. Thus, once p53 becomes activated under prolonged anoxia, it contributes to terminating HIF-1 responses. In the second part of my study, I intended to further characterize the effects induced by prolonged periods of low oxygen, i.e., hypoxia, as compared to anoxia, with respect to alterations in HIF-1alpha mRNA. Prolonged anoxia, but not hypoxia, showed pronounced effects on HIF-1alpha mRNA. Long-term anoxia induced destabilization of HIF-1alpha mRNA, which manifests itself in a dramatic reduction of the half-life. The mechanistic background points to natural anti-sense HIF-1alpha mRNA, which is induced in a HIF-1-dependent manner, and additional factors, which most likely influence HIF-1alpha mRNA indirectly via anti-sense HIF-1alpha mRNA mediated trans-effects. In summary, the data provide new information concerning the impact of p53 on HIF-1, which might be of importance for the decision between pro- and anti-apoptotic mechanisms depending upon the severity and duration of hypoxia. Furthermore, the results of this project give further insights into a novel mechanism of HIF-1 regulation, namely mRNA down-regulation under prolonged anoxic incubations. These mechanisms appear to be activated only in response to prolonged anoxia, but not to hypoxia. These considerations regarding HIF-1 regulation should be taken into account when prolonged incubations to hypoxic or anoxic conditions are analyzed at the level of HIF-1 stability regulation.
• Der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1), ein Heterodimer bestehend aus HIF-1alpha und HIF-1beta, wird durch verminderten Sauerstoffpartialdruck induziert und wirkt als Hauptregulator für die Anpassung von Zellen an Hypoxie. Nach gängiger Meinung wird HIF-1 hauptsächlich über den Abbau seiner a-Untereinheit reguliert. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch alternative HIF-1 Regulationsmechanismen auf, die wichtig für die Herunterregulation von HIF-1 unter lange andauerndem und starkem Sauerstoffmangel zu sein scheinen. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es daher, Mechanismen die in der Herunterregulation von HIF-1 eine Rolle spielen, genauer zu charakterisieren. Im ersten Teil meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit den Auswirkungen des Grades und der Dauer des Sauerstoffentzugs auf die Akkumulation von HIF-1alpha und die transkriptionelle Aktivität von HIF-1. Dabei habe ich einen Schwerpunkt auf den Einfluss des Transkriptionsfaktors p53 auf HIF-1 gelegt. Ich konnte zeigen, dass p53 nur unter lange andauernder Anoxie, nicht jedoch unter Hypoxie, akkumuliert. Sein Einfluss auf HIF-1 beschränkt sich also auf stark hypoxische Bedingungen. Wenn p53 nur zu einem geringen Maße exprimiert wird, bedingt es eine Hemmung der HIF-1 Transaktivität. Dies kann auf eine Kompetition zwischen p53 und HIF-1alpha um die Bindung des transkriptionellen Ko-Faktors p300 zurückgeführt werden, da die Überexpression von p300 die Hemmung antagonisierte. Dies wird durch die Beobachtung untermauert, dass in einem Bindungsassay in vitro generiertes p53 und HIF-1alpha um die Bindung an der CH1-Domäne von p300 konkurrieren. Wenn p53 jedoch verstärkt exprimiert wird, beeinflusst es das HIF-1alpha-Protein negativ, d.h. p53 führt zum pVHL-unabhängigen Abbau von HIF-1alpha. Daher schliesse ich, dass eine geringe p53 Expression über eine Kompetition um p300 zu einer verminderten HIF-1 Transaktivität führt, während höhere p53 Konzentrationen durch den abbauendend Einfluss auf das HIF-1alpha Protein zu einer Termination der HIF-1 Transaktivität führen. Daraus folgt, dass p53, wenn es durch andauernde Anoxie aktiviert wird, zur Antagonisierung der HIF-1-Antwort führt. Im zweiten Teil meiner Arbeit, beschäftigte ich mich mit den Effekten lange andauernder Hypoxie im Vergleich zu Anoxie, wobei das Hauptaugenmerk auf Veränderungen der HIF-1alpha mRNA lag. Dabei stellte sich heraus, dass andauernde Anoxie, im Gegensatz zu Hypoxie, einen deutlichen Einfluss auf die HIF-1alpha mRNA hat. Langzeitinkubationen unter Anoxie verursachten eine Destabilisierung der HIF-1alpha mRNA, was sich in einer massiven Verringerung der Halbwertszeit zeigte. Die Daten deuten auf einen Mechanismus hin, der zum einen die natürliche anti-sense HIF-1alpha mRNA, die HIF-1-abhängig reguliert wird, involviert, zum anderen aber weiterer Faktoren bedarf, welche HIF-1alpha mRNA wahrscheinlich indirekt über anti-sense HIF-1alpha mRNA in Form eines trans-Effekts beeinflussen. Zusammenfassend liefern die präsentierten Daten neue Informationen über den Einfluss von p53 auf HIF-1. Dieser könnte bei der Entscheidung zwischen pro- und anti-apoptotischen Mechanismen, die in Abhängigkeit von Intensität und Dauer des hypoxischen Stimulus induziert werden, eine Rolle spielen. Darüber hinaus bieten die Ergebnisse dieser Studie weitergehende Einblicke in einen neuen HIF-1-Regulationsmechanismus, nämlich den der mRNA-Herunterregulation unter lange andauernder Anoxie. Dieser Mechanismus scheint nur durch Anoxie, jedoch nicht durch Hypoxie, aktiviert zu werden. Die beschriebenen Unterschiede zwischen Anoxie und Hypoxie sowohl in Bezug auf p53-vermittelte Effekte auf HIF-1alpha-Protein und HIF-1-Transaktivität, als auch in Bezug auf mRNA-destabilisierende Einflüsse sollten bei zukünftigen Arbeiten, bei denen hypoxische oder anoxische Bedingungen auf ihren Einfluss auf die HIF-1-Stabilitätsregulation hin untersucht werden, in betracht gezogen werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden.