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Die Kanzerogenität von Dioxinen ist bisher am besten an der Prototyp“-Verbindung 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) untersucht worden. TCDD wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als Klasse I Kanzerogen eingestuft, obwohl bislang die Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD noch nicht hinreichend geklärt werden konnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde von der Arbeitshypothese ausgegangen, dass TCDD über die durch den Arylhydrocarbon Rezeptor (AhR) massiv vermittelte Induktion von fremdstoffmetabolisierenden Phase I Enzymen, vor allem von CYP1A1, eine erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verursacht, welche die DNA schädigen können und potenziell mutagen sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein System entwickelt, das ausreichend große Mengen an CYP1A1 exprimieren sollte ohne dass zuvor eine das Studienergebnis möglicherweise verfälschende Behandlung mit einem AhR-Agonisten (z.B. TCDD) stattgefunden hat. Erstes Ziel war die Etablierung eines geeigneten in-vivo Systems, nämlich die Erzeugung einer transgenen, humanes CYP1A1 überexprimierenden Maus. Das humane CYP1A1 Transgen wurde in den generierten, transgenen Mauslinien nicht wie erwartet exprimiert, obwohl die Integration in das Genom der Mäuse zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Zwar konnte eine Induktion von hCYP1A1 in verschiedenen Organen der Mäuse auf mRNA Ebene nachgewiesen werden, allerdings wurde im Vergleich zu Wildtyp Tieren weder eine Steigerung der CYP1A1 Proteinmenge noch deren katalytischer Aktivität erzielt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden in-vivo Untersuchungen hinsichtlich oxidativem Stress und DNA-Schädigung an TCDD behandelten C57B6 Mäusen und Sprague-Dawley Ratten bzw. an deren entsprechenden Kontrollen, sowie an transgenen Mäusen mit konstitutiv aktivem AhR (CA-AhR) durchgeführt. Die CA-AhR Linie bot eine weitere Möglichkeit, die Auswirkungen der AhR-vermittelten Genexpression ohne Verwendung eines AhR-Liganden in-vivo zu untersuchen. Als Messparameter für oxidativen Stress wurde der auf Fluoreszenz basierende H2DCFDA Assay im 96 Well Format etabliert. Als Marker für oxidative DNA-Schäden wurde der Gehalt an 8-oxo dG in genomischer DNA individueller Proben mittels HPLC-MS quantifiziert. Ob evtl. erhöhte ROS Gehalte bzw. DNA Schäden nach TCDD Expostition in einen direkten Zusammenhang mit AhR-regulierten CYP1A Induktion stehen wurde durch die Analyse der katalytischen CYP1A Aktivität mittels EROD-Assay überprüft. Die gefundenen Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die ROS Bildung möglicherweise auch im in-vivo Experiment davon abhängt, wie stark TCDD als Induktor von CYP1A Enzymen wirkt. Die Daten zeigten aber auch, dass es sich in-vivo bei der TCDD vermittelten Induktion von oxidativen DNA-Schäden vermutlich um einen chronischen Langzeiteffekt handelt, der nicht ausschließlich von TCDD Leberlast oder CYP1A Enzyminduktion abzuhängen scheint. Mit Hilfe von Mikrosomen (SupersomesTM) aus stabil transfizierten Insektenzellen wurde des weiteren das individuelle ROS-Bildungspotenzial einzelner, AhR-regulierter CYP-Enzyme mittels H2DCFDA Assay untersucht. Die SupersomesTM Experimente bestätigten generell die Hypothese, dass TCDD induzierte CYPs eine potenzielle Quelle für ROS darstellen. Generell konnte die Hypothese bestärkt werden, dass die ROS Bildung nach TCDD Exposition eine Konsequenz der AhR vermittelten CYP Induktion darstellt. Isolierte RNA aus den Lebern von Mäusen wurde mit Hilfe von Microarrays auf Veränderungen der Genexpressionsmuster untersucht, die Hinweise auf gentoxischen bzw. oxidativen Stress und andere prokarzinogene Veränderungen als Konsequenz einer TCDD Exposition bzw. der konstitutiven Aktivität des AhR geben sollten. Die (permanente) Aktivierung des AhR führte einerseits in der Leber von Mäusen generell zu einem erhöhten oxidativen Stress. Andererseits konnte gezeigt werden, dass pro- und antiapoptotische Signalwege an diesem Prozess beteiligt zu sein scheinen, möglicherweise als Konsequenz des induzierten oxidativen Stresses.
2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is a highly toxic and persistent organic pollutant, which is ubiquitously found in the environment. The prototype dioxin compound was classified as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. TCDD acts as a potent liver tumor promoter in rats, which is one of the major concerns related to TCDD exposure. There is extensive evidence, that TCDD exerts anti-estrogenic effects via arylhydrocarbon receptor (AhR)-mediated induction of cytochromes P450 and interferes with the estrogen receptor alpha (ERalpha)-mediated signaling pathway. The present work was conducted to shed light on the hypothesis that enhanced activation of estradiol metabolism by TCDD-induced enzymes, mainly CYP1A1 and CYP1B1, leads to oxidative DNA damage in liver cells. Furthermore, the possible modulation by 17beta-estradiol (E2) was investigated. The effects were examined using four different AhR-responsive species- and sex-specific liver cell models, rat H4II2 and human HepG2 hepatoma cell lines as well as rat primary hepatocytes from male and female Wistar rats. The effective induction of CYP1A1 and CYP1B1 by TCDD was demonstrated in all liver cell models. Basal and TCDD-induced expression of CYP1B1, which is a key enzyme in stimulating E2 metabolism via the more reactive formation of the genotoxic 4-hydroxyestradiol, was most pronounced in rat primary hepatocytes. CYP-dependent induction of reactive oxygen species (ROS) was only observed in rodent cells. E2 induced ROS only in primary rat hepatocytes, which was associated with a weak CYP1B1 mRNA induction. Thus, E2 itself was suggested to induce its own metabolism in primary rat hepatocytes, resulting in the redox cycling of catechol estradiol metabolites leading to ROS formation. In this study the role of TCDD and E2 on oxidative DNA damage was investigated for the first time in vitro in the comet assay using liver cells. Both TCDD and E2 were shown to induce oxidative DNA base modifications only in rat hepatocytes. Additionally, direct oxidative DNA-damaging effects of the two main E2 metabolites, 4-hydroxyestradiol and 2-hydroxyestradiol, were only observed in rat hepatocytes and revealed that E2 damaged the DNA to the same extent. However, the induction of oxidative DNA damage by E2 could not completely be explained by the metabolic conversion of E2 via CYP1A1 and CYP1B1 and has to be further investigated. The expression of low levels of endogenous ERalpha mRNA in primary rat hepatocytes and the lack of ERalpha in hepatoma cell lines were identified as crucial. Therefore, the effects of interference of ERalpha with AhR were examined in HepG2 cells, which were transiently transfected with ERalpha. The over-expression of ERalpha led to enhanced AhR-mediated transcriptional activity by E2, suggesting a possible regulation of E2 levels. In turn, TCDD reduced E2-mediated ERalpha signaling, confirming the anti-estrogenic action of TCDD. Such a modulation of the combined effects of TCDD with E2 was not observed in any of the other experiments. Thus, the role of low endogenous ERalpha levels has to be further investigated in transfection experiments using rat primary hepatocytes. Overall, rat primary hepatocyte culture turned out to be the more adaptive cell model to investigate metabolism in the liver, reflecting a more realistic situation of the liver tissue. Nevertheless, during this work a crosstalk between ERalpha and AhR was shown for the first time using human hepatoma cell line HepG2 by transiently transfecting ERalpha.
2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer als Gruppe 1 Kanzerogen eingestuft, obwohl die molekularen Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD bislang nicht vollständig geklärt werden konnten. TCDD zeigte im Tierversuch ein erhöhtes hepatokarzinogenes Potential an Ratten, und im Initiations-Promotions-Modell in der Rattenleber konnte TCDD eine starke tumorpromovierende Wirkung zugeschrieben werden. Eine Reihe von Studien zeigten sowohl in vivo als auch in vitro in unterschiedlichen Zellsystemen eine Hemmung des durch verschiedene Stimuli induzierten programmierten Zelltodes, der Apoptose durch TCDD. Diese antiapoptotische Wirkung wird als ein möglicher Mechanismus für die Tumorpromotion von TCDD diskutiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Mechanimus der Apoptose-Hemmung durch TCDD in Leberzellsystemen der Ratte und des Menschen untersucht werden. Außerdem sollte die Frage geklärt werden, ob die anti-apoptotische Wirkung dieses Fremdstoffes über den Arylhydrokarbon-Rezeptor (AhR) vermittelt wird. Die Aufklärung der bislang noch unbekannten molekularen Mechanismen der TCDDvermittelten Kanzerogenese könnte die Risikobewertung einer TCDD-Exposition des Menschen auf eine erheblich solidere Basis stellen als bisher. Es konnte sowohl in primären Rattenhepatozyten als auch in der humanen Hepatomzelllinie Huh-7 bestätigt werden, dass TCDD die durch UVC-Licht induzierte Apoptose hemmt. Dies wurde auf Ebene der DNS-Fragmentierung und an Hand morphologischer Veränderungen des Zellkerns gezeigt. In den Primärhepatozyten war der anti-apoptotische Effekt von TCDD abhängig von einer Aktivierung des AhR. Die Apoptose durch die beiden Proteinbiosynthese-Inhibitoren Ochratoxin A und Cycloheximid wurde im Gegensatz zur UVC-Licht-induzierten Apoptose nicht durch TCDD gehemmt. Dies lässt den Schluss zu, dass eventuell die Neusynthese eines durch den AhR induzierten Proteins für die Hemmung der Apoptose in diesen Zellen nötig ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass entgegen früherer Studien, eine Hemmung der Aktivität des Tumorsuppressors p53 vermutlich nicht für die Apoptosehemmung durch TCDD verantwortlich ist. TCDD-bedingte Änderungen in der Expression von an der Apoptose beteiligten Genen ließen die Vermutung zu, dass diese Substanz zu einer Aktivierung des anti226 apoptotischen Transkriptionsfaktors NF-κB führt. Dies würde letztendlich zu einer Hemmung der Caspase-abhängigen Apoptosewege führen. Es konnte dennoch keine Wirkung des Fremdstoffes auf die Charakteristiken der durch UVC-Licht induzierten Caspasen-abhängigen Apoptose beobachtet werden. Weder wurden die proteolytische Aktivierung, noch die katalytische Aktivität von Caspasen oder die Spaltung von Caspasensubstraten durch TCDD moduliert. Daher wurde angenommen, dass TCDD im Signalweg der Apoptose zwischen der Caspasenaktivität und der apoptotischen DNS-Fragmentierung wirken müsste. Auf Grund dieser Hypothese wurde der Einfluss der Testsubstanz auf die Charakteristiken apoptotischer Nukleasen untersucht. Weder konnte eine verringerte Proteinmenge an Endonuklease G oder Caspase-aktivierter DNase (CAD) festgestellt werden, noch wurde die Aktivität rekombinant exprimierter CAD durch TCDD moduliert. In isolierten Zellkernen primärer Rattenhepatozyten konnte eine intrinsische Nukleaseaktivität identifiziert werden, die Calcium- und Magnesium-abhängig war und vermutlich durch nicht-physiologische Konzentrationen an monovalenten Ionen aktiviert wird. TCDD besaß eine hemmende Wirkung auf diese Nukleaseaktivität. Es erscheint plausibel, dass TCDD die apoptotische DNS-Fragmentierung über einen bisher unbekannten, AhR-abhängigen Mechanismus hemmt, und damit trotz einer Initiation der Apotpose die Integrität der DNS aufrecht erhält, um der Zelle die Möglichkeit zur Entgiftung von Aktivatoren des Fremdstoffmetabolismus zu geben. Diese Zellen könnten sich nach Entzug des pro-apoptotischen Stimulus letztendlich wieder erholen. Da solche Zellen DNS-Schäden tragen können, durch die sie unter normalen Umständen in die Apoptose getrieben worden wären, könnte dieser Mechanismus schließlich eine Rolle in der Tumorpromotion durch TCDD und verwandte Verbindungen spielen.