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Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde Knochenmarksmaterial von 110 Leukämiepatienten auf das Vorliegen von p53-Gen-Deletionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Interphasezellkerne als auch Metaphasen der Leukämiezellen mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) mit der p53-Gen-Sonde untersucht. Dabei konnte in keinem der 55 untersuchten Patienten mit lymphatischer Leukämie eine Alleldeletion des p53-Gens nachgewiesen werden. Da die p53-Gen-Deletion nach den Literaturangaben bei etwa 7% der Patienten mit lymphatischer Leukämie vorkommt, widersprechen die eigenen Ergebnisse diesen Angaben. Als Grund kann die zu geringe Anzahl der untersuchten Fälle genannt werden. Bei den 55 hier untersuchten Patienten, die an myeloischer Leukämie erkrankt waren, konnte in 7 Fällen (13%) eine Deletion im p53-Gen mittels FISH nachgewiesen werden. Der Anteil der gefundenen p53-Gen-Deletionen war deutlich höher als aufgrund der Literaturangaben erwartet. Die sieben Patienten, bei denen eine p53-Gen-Deletion nachgewiesen wurde, waren alle an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt. Alle Patienten, die eine p53-Gen-Deletion aufwiesen, zeigten auch einen numerisch und strukturell aberranten Karyotyp. Im zweiten Arbeitsabschnitt wurden Knochenmarkszellen von 21 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen mittels spektraler Karyotypisierung (SKY) untersucht und mit dem zytogenetischen Routinebefund verglichen. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen, die durch die konventionelle zytogenetische Untersuchung nicht identifiziert werden konnten. Bei 17 (81%) der Fälle wurden durch SKY zusätzliche Chromosomenaberrationen festgestellt. Nur bei 4 (19%) der Fälle wurde der zytogenetische Befund bestätigt. Im dritten Arbeitsabschnitt wurden Meningeome untersucht. Bei 22 Meningeomen (17 benigne und 5 atypische Meningeomen) wurde mittels Interphase-FISH nach einer Alleldeletion des p53-Gens gesucht. Es konnte jedoch in keinem Fall eine solche Deletion nachgewiesen werden. Weiterhin wurden bei 24 Meningeomen 96 frische Biopsieproben von verschiedenen Tumorarealen mit G-Bänderungstechnik zytogenetisch analysiert. Zur besseren Aufklärung komplex aberranter Karyotypen wurden zwei Fälle (Nr. 1 und Nr. 7) auch mittels SKY-Analyse untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob zytogenetische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors vorliegen. Es gab bei 13 von 24 Meningeomen (54%) zytogenetische Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen innerhalb eines Tumors. 24 (83%) von 29 Meningeomen wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft und 5 (17%) von 29 Meningeomen in den Tumorgrad II. Die Tumorgradverteilung in dieser Arbeit entspricht den Literaturangaben. 13 von 24 Tumoren wiesen entweder einen normalen Karyotyp oder nur eine Monosomie 22 auf. Alle 13 Tumoren wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft. Vier Meningeome wiesen stark aberrante Karyotypen auf, was vermutlich ein Zeichen für die Tumorprogression darstellt. Es wurde auch untersucht, ob eine Korrelation zwischen dem zytogenetischen und histologischen Befunden vorliegt. In der vorliegenden Arbeit hat bei sechs Fällen der histologische Befund nicht mit dem zytogenetischen Befund übereingestimmt, da die Tumore in den Tumorgrad I eingestuft wurden, der zytogenetische Befund aber einen aberranten Chromosomensatz aufwies, der normalerweise nicht bei niedriggradigen Meningeomen, sondern bei atypischen und anaplastischen Meningeomen vorkommt. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination verschiedener zytogenetischer und molekularzytogenetischer Methoden zur Charakterisierung Chromosomaler Aberrationen bei Meningeomen sinnvoll ist.
Benzene is a natural constituent of crude oil and a product of incomplete combustion of petrol
and has been classified as “carcinogenic to humans” by IARC in 1982 (IARC 1982). (E,E)-
Muconaldehyde has been postulated to be a microsomal metabolite of benzene in vitro
(Latriano et al. 1986). (E,E)-Muconaldehyde is hematotoxic in vivo and its role in the
hematotoxicity of benzene is unclear (Witz et al. 1985).
We intended to ascertain the presence of (E,E)-muconaldehyde in vivo by detection of a
protein conjugate deriving from (E,E)-muconaldehyde.
Therefore we improved the current synthetic access to (E,E)-muconaldehyde. (E,E)-
muconaldehyde was synthesized in three steps starting from with (E,E)-muconic acid in an
overall yield of 60 %.
Reaction of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin resulted in formation of a
conjugate which was converted upon addition of NaBH4 to a new species whose HPLC-
retention time, UV spectra, Q1 mass and MS2 spectra matched those of the crude reaction
product from one pot conversion of Ac-Lys-OMe with (E,E)-muconaldehyde in the presence
of NaBH4 and subsequent cleavage of protection groups.
Synthetic access to the presumed structure (S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-oxohexa-2,4-dien-1-
yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-CHO)) was provided in eleven steps starting from (E,E)-
muconic acid and Lys(Z)-OtBu*HCl in 2 % overall yield. Additionally synthetic access to
(S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-hydroxyhexa-2,4-dien-1-yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-OH))
and (S)-2-ammonio-6-((6-hydroxyhexyl)amino)hexanoate (IS) was provided.
With synthetic reference material at hand, the presumed structure Lys(MUC-OH) could be
identified from incubations of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin via HPLC-ESI+-
MS/MS.
Cytotoxicity analysis of (E,E)-muconaldehyde and Lys(MUC-CHO) in human promyelocytic
NB4 cells resulted in EC50 ≈ 1 μM for (E,E)-muconaldehyde. Lys(MUC-CHO) did not show
any additional cytotoxicity up to 10 μM.
B6C3F1 mice were exposed to 0, 400 and 800 mg/kg b.w. benzene to examine the formation
of Lys(MUC-OH) in vivo. After 24 h mice were sacrificed and serum albumin was isolated.
Analysis for Lys(MUC-OH) has not been performed in this work.
Die cytogenetische Manifestation von Genamplifikation in humanen Zellen wurde in einem Fall von akuter myeloischer Leukämie (AML) sowie an der humanen Cervixcarcinomzelllinie HeLa S3 untersucht. In dem AML-Fall ergab die Karyotypisierung der Leukämiezellen neben dem Verlust eines X-Chromosoms das Vorliegen einer extrachromosomalen Genamplifikation in Form von Double Minutes. Mit Hilfe der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) und der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) wurde die Herkunft der amplifizierten Sequenz aus der chromosomalen Region 8q24 ermittelt und eine Amplifikation des Protoonkogens MYC in den Double Minutes nachgewiesen. Die FISH-Analyse zeigte zudem den Verlust von einem der beiden chromosomalen MYC-Loci an, der auf einen Deletionsmechanismus der Genamplifikationsentwicklung schliessen ließ. Die Induktion der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase-Gens (DHFR) durch Selektion mit Methotrexat (MTX) diente als Modellsystem zur Analyse der frühen Stadien der Genamplifikationsentwicklung. Durch mehrmonatige Mehrschrittselektionen von zwei HeLa-Zellpopulationen wurden unabhängig voneinander zwei HeLa-Sublinien mit jeweils extrachromosomaler DHFR-Amplifikation in Form von Double Minutes erzeugt. Die Veränderungen der 5q-Trägerchromosomen und der intrachromosomalen DHFR-Kopienanzahl, die im Verlauf der MTX-Selektionen in den HeLa-Zellen auftraten, wiesen auf das Zusammenwirken unterschiedlicher Mechanismen zur DHFR-Amplifikation hin. Niedrige MTX-Konzentrationen wirkten in Richtung einer Anreicherung von intrachromosomalen DHFR-Kopien, die hauptsächlich auf den Zugewinn eines Chromosoms 5 zurückzuführen waren. Daneben wies das Auftreten von neuen derivativen DHFR-haltigen Chromosomen auf Bruchereignisse in Chromosom 5 hin. Das Erscheinen eines derivativen Chromosoms mit zwei invertiert angeordneten 5q und drei DHFR-Kopien ließ auf das Ablaufen von Breakage-Fusion-Bridge (BFB)-Zyklen schliessen. Bei höheren MTX-Konzentrationen (ab 0.25 µM) trat dagegen eine Anreicherung von extrachromosomalen DHFR-Kopien in Double Minutes bei gleichzeitigem Rückgang der derivativen DHFR-haltigen Chromosomen in den Vordergrund. Die Sublinien aus Selektion 1 waren in diesem Stadium durch den Verlust eines Chromosoms 5 gekennzeichnet, der auf eine Generierung von extrachromosomalen DHFR-Kopien aus 5q-Bruchstücken hinwies. Im Gegensatz dazu trat bei den Sublinien von Selektion 2 in diesem Stadium zunächst noch eine Zunahme von intrachromosomalen DHFR-Kopien auf, die nachfolgend durch eine sprunghafte Erhöhung von extrachromosomalen DHFR-Kopien in Double Minutes in der Zellpopulation abgelöst wurde. In den Sublinien von Selektion 2 kann daher eine Generierung von extrachromosomalen DHFR-Kopien durch Bruchereignisse an einem zuvor hinzugewonnenen Chromosom 5 angenommen werden. Die letzten Sublinien aus beiden Selektionen wiesen wieder den 5q-Trägerchromosomen- und intrachromosomalen DHFR-Status der Parentallinie auf, der offenbar in den HeLa-Zellen eine besondere Stabilität besitzt. Die unterschiedlichen Veränderungen im 5q- und DHFR-Status in den untersuchten HeLa-Sublinien zeigen, dass eine DHFR-Amplifikation in HeLa-Zellen unter MTX-Selektionsdruck auf verschiedenen Wegen erfolgen kann. In mehrmonatiger Kultivierung ohne Selektionsdruck entwickelte die verwendete HeLa-Zelllinie unter den vorliegenden Kultivierungsbedingungen keine der in den MTX-selektionierten Sublinien beobachteten Veränderungen, so dass diese als selektionsspezifische Prozesse angesehen werden können.