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α-, β- und γ-Asaron gehören zur Gruppe der Phenylpropanoide und kommen überwiegend in Pflanzen der Familien Aristolochiaceae, Acoraceae und Lauraceae vor. Asarone sind im etherischen Öl dieser Pflanzen enthalten, welches hauptsächlich als Aromastoff in
alkoholischen Getränken wie Bitterlikören oder in der traditionellen Pflanzenmedizin
eingesetzt wird. α- und β-Asaron besitzen pharmakologische Eigenschaften und könnten potentiell in der Therapie von verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden, jedoch haben Studien gezeigt, dass diese Verbindungen sowie indisches Kalmusöl im Tierversuch im Nager
krebserregend sind (Dünndarm und Leber). Der Mechanismus dieser kanzerogenen Wirkung ist derzeit noch unklar, wobei ein gentoxischer Weg nicht ausgeschlossen werden kann. Studien zur Gentoxizität der propenylischen Verbindungen α- und β-Asaron sind bislang uneinheitlich. Daten zur Kanzerogenität und Gentoxizität des allylischen γ-Asarons fehlen
gänzlich. Basierend auf der aktuellen Datenlage ist eine Risikobewertung für Zubereitungen, die Asarone enthalten, nicht möglich. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte daher
mithilfe von verschiedenen in vitro Testsystemen ein Beitrag zur Aufklärung des Wirkmechanismus der Kanzerogenität geleistet und die Frage nach der Gentoxizität der Asarone geklärt werden. Dazu wurde zunächst ein bakterieller Mutagenitätstest (Ames-Fluktuationstest) mit und ohne exogene metabolische Aktivierung (S9-Mix) in den Salmonella
typhimurium-Stämmen TA97a, TA98, TA100 und TA102 eingesetzt. Zusätzlich wurden Untersuchungen zur Zytotoxizität und Gentoxizität in Säugerzellen durchgeführt. Zur Überprüfung der Mutagenität diente der Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Test in V79-Zellen und gentechnisch veränderten V79-Zellen (V79-hCYP1A2-hSULT1A1*1 und V79-
rCYP1A2-rSULT1C1) und zur Bestimmung des gentoxischen Potentials wurde der
Mikrokerntest in V79-Zellen und metabolisch kompetenten HepG2-Zellen herangezogen. α- und β-Asaron zeigten im Ames-Fluktuationstest nur nach metabolischer Aktivierung ein mutagenes Potential. Diese Ergebnisse deuten auf die wichtige Rolle des Metabolismus in der
Toxizität der propenylischen Asarone hin. Deshalb wurden neben den drei Asaron-Isomeren auch ausgewählte oxidative Metaboliten ((E/Z)-Asaron-1',2'-epoxid, γ-Asaron-2',3'-epoxid, erythro- und threo-1',2'-Dihydro-1',2'-dihydroxyasaron, (E/Z)-3'-Oxoasaron und 2,4,5-Trimethoxyphenyl-2-propanon) auf Mutagenität getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass die mutagene Wirkung von α- und β-Asaron auf die Epoxidierung der Seitenkette
zurückzuführen ist, da die entsprechenden Epoxide im Ames-Fluktuationstest ebenfalls mutagen waren. Außerdem führte der HPRT-Test in den gentechnisch veränderten V79-hCYP1A2-hSULT1A1*1-Zellen zu einer leichten Erhöhung der Mutationsfrequenz nach Inkubation mit den Asaronen, während der Test in den Standard-V79- und V79-rCYP1A2-rSULT1C1-Zellen für diese Verbindungen keine Veränderung im Vergleich zur Negativkontrolle zeigte. Im Mikrokerntest in HepG2-Zellen konnte ebenfalls ein gentoxisches Potential für die
propenylischen Asarone nachgewiesen werden. Welchen Einfluss dabei der Metabolismus der Substanzen hat, wurde mithilfe einer Vorinkubation mit TCDD überprüft, welches vor allem zur Induktion von CYP1A-Enzymen in HepG2-Zellen führt. Bei allen drei Asaron-Isomeren
wurde dadurch eine Erhöhung der relativen Mikrokernrate erreicht, insbesondere jedoch bei α-Asaron. Die Inkubation mit den oxidativen Metaboliten gab Hinweise darauf, dass die gentoxische Wirkung hier vermutlich auf die Bildung von (E/Z)-3'-Oxoasaron zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass nicht nur zwischen allylischen und propenylischen Asaronen Unterschiede in der Gentoxizität vorliegen, sondern auch zwischen dem trans(α)- und cis(β)-Isomer. Dieser Befund geht mit den neuesten Untersuchungen zum Metabolismus dieser Substanzen einher, der sich ebenfalls zwischen den propenylischen Asaronen unterscheidet. Dem allylischen γ-Asaron liegt wiederum ein anderer Wirkmechanismus zugrunde. Der postulierte Metabolismusweg für vergleichbare allylische Alkenylbenzene basiert auf einer CYP-Hydroxylierung der Seitenkette und einer weiteren Sulfonierung durch Sulfotransferasen. Durch eine spontane Abspaltung der Sulfat-Gruppe entsteht ein reaktives Carbokation, das mit nukleophilen Zentren (z.B. Proteinen oder DNA) reagieren und somit letztlich zu Mutationen und der Entstehung von Krebs beitragen
kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben jedoch keinen Hinweis darauf, dass es bei γ-Asaron analog zu anderen allylischen Propenylbenzenen zu einer Bildung eines ultimaten Kanzerogens kommt, da keine mutagene Wirkung in den hier verwendeten Testsystemen zu
beobachten war, die zum Großteil eine Aktivierung über Sulfotransferasen ermöglichten.
It was recently reported that imatinib causes cell death in neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVCM) by triggering endoplasmic reticulum (ER) stress and collapsed mitochondrial membrane potential. Retroviral gene transfer of an imatinib-resistant mutant c-Abl into NRVCM appeared to alleviate imatinib-induced cell death and it was concluded that the observed imatinib-induced cytotoxicity is mediated through direct interactions of imatinib with c-Abl. The imatinib effects were described as being specific for cardiomyocytes only, which are relevant also for the in vivo situation in man. [Kerkelä et al. 2006] The goal of the present study was to reproduce the published experiments and to further explore the dose-response relationship of imatinib-induced cell death in cardiomyocytes. Additional markers of toxicity were investigated. The following biochemical assays were applied: LDH release (membrane leakage marker), MTS-reduction (marker of mitochondrial integrity), ATP cellular contents (energy homoeostasis) and caspase 3/7 activity (apoptosis). The endoplasmatic reticulum (ER) stress markers eIF2α (elongation initiation factor 2α), XBP1 (X Box binding Protein 1), and CHOP (cAMP response element-binding transcription factor (C/EBP) homologous protein) were determined at the transcriptional and protein level. Online monitoring of cell attachment of, oxygen consumption and acidification of the medium by rat heart cells (H9c2) seated on chips (Bionas) allowed the determination of the onset and reversibility of cellular functions. Image analysis measured the spontaneous beating rates after imatinib treatment. The role of imatinib-induced reactive oxygen species was evaluated directly by 2’,7’-Dichlorofluorescein fluorescence and indirectly by means of interference experiments with antioxidants. The specificity of imatinib-induced effects were specific to cardiomyocytes was evaluated in fibroblasts derived from rat heart, lung and skin. The specific role of c-Abl in the imatinib-induced cellular toxicity was investigated by specific gene silencing of c-Abl in NRVCM. The results demonstrated that imatinib caused concentration-dependent cytotoxicity, apoptosis, and ER stress in heart, skin and lung fibroblasts, similar or stronger to those observed in cardiomyocytes. Similar to the results from cardiomyocytes, ER stress markers in fibroblasts were only increased at cytotoxic concentrations of imatinib. This effect was not reversible; also, reactive oxygen species did not participate in the mechanism of the imatinib-induced cytotoxicity in NRVCM. Small interfering RNA (siRNA)-mediated reduction of c-Abl mRNA levels by 51 % and c-Abl protein levels by 70 % had neither an effect on the spontaneous beating frequency of cardiomyocytes nor did it induce cytotoxicity, apoptosis, mitochondrial dysfunction or ER stress in NRVCM. Incubation of imatinib with c-Abl siRNA-transfected NRVCM suggested that reduced c-Abl protein levels did not rescue cardiomyocytes from imatinib-induced cytotoxicity. In conclusion, results from this study do not support a specific c-Abl-mediated mechanism of cytotoxicity in NRVCM.