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Microsystem technology has been a fast evolving field over the last few years. Its ability to handle volumes in the sub-microliter range makes it very interesting for potential application in fields such as biology, medicine and pharmaceutical research. However, the use of micro-fabricated devices for the analysis of liquid biological samples still has to prove its applicability for many particular demands of basic research. This is particularly true for samples consisting of complex protein mixtures. The presented study therefore aimed at evaluating if a commonly used glass-coating technique from the field of micro-fluidic technology can be used to fabricate an analysis system for molecular biology. It was ultimately motivated by the demand to develop a technique that allows the analysis of biological samples at the single-cell level. Gene expression at the transcription level is initiated and regulated by DNA-binding proteins. To fully understand these regulatory processes, it is necessary to monitor the interaction of specific transcription factors with other elements - proteins as well as DNA sites - in living cells. One well-established method to perform such analysis is the Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) assay. To map protein-DNA interactions, living cells are treated with formaldehyde in vivo to cross-link DNA-binding proteins to their resident sites. The chromatin is then broken into small fragments, and specific antibodies against the protein of interest are used to immunopurify the chromatin fragments to which those factors are bound. After purification, the associated DNA can be detected and analyzed using Polymerase Chain Reaction (PCR). Current CHIP technology is limited as it needs a relatively large number of cells while there is increasing interest in monitoring DNA-protein interactions in very few, if not single cells. Most notably this is the case in research on early organism development (embryogenesis). To investigate if microsystem technology can be used to analyze DNA-protein complexes from samples containing chromatin from only few cells, a new setup for fluid transport in glass capillaries of 75 µm inner diameter has been developed, forming an array of micro-columns for parallel affinity chromatography. The inner capillary walls were antibody-coated using a silane-based protocol. The remaining surface was made chemically inert by saturating free binding sites with suitable biomolecules. Variations of this protocol have been tested. Furthermore, the sensitivity of the PCR method to detect immunoprecipitated protein-DNA complexes was improved, resulting in the reliable detection of about 100 DNA fragments from chromatin. The aim of the study was to successively decrease the amount of analyzed chromatin in order to investigate the lower limits of this technology in regard to sensitivity and specificity of detection. The Drosophila GAGA transcription factor was used as an established model system. The protein has already been analyzed in several large-scale CHIP experiments and antibodies of excellent specificity are available. The results of the study revealed that this approach is not easily applicable to "real-world" biological samples in regard to volume reduction and specificity. Particularly, material that non-specifically adsorbed to capillary surfaces outweighed the specific antibody-antigen interaction, the system was designed for. It became clear that complex biological structures, such as chromatin-protein compositions, are not as easily accessible by techniques based on chemically modified glass surfaces as pre-purified samples. In the case of the investigated system, it became evident that there is a need for more research that goes beyond the scope of this work. It is necessary to develop novel coatings and materials to prevent non-specific adsorption. In addition to improving existing techniques, fundamentally new concepts, such as microstructures in biocompatible polymers or liquid transport on hydrophobic stripes on planar substrates to minimize surface contact, may also help to advance the miniaturization of biological experiments.
Der Glucocorticoid-Rezeptor (GR), der zu den Steroidhormon-Rezeptoren zählt, reguliert physiologische Prozesse durch Aktivierung und Repression spezifischer Zielgene. Der ligandengebundene Rezeptor aktiviert die Genexpression, indem er als Dimer an spezifische DNA-Sequenzen (glucocorticoid response element, GRE) bindet. Der GR reprimiert seine Zielgene entweder durch Bindung an negative GREs (nGREs, Cis-Repression) oder durch DNA-unabhängige Bindung an andere Transkriptionsfaktoren wie AP-1 oder NF-(kappa)B (Trans-Repression). Glucocorticoide sind sehr effektive Medikamente für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen. Langzeittherapie mit Glucocorticoiden ist jedoch problematisch wegen der auftretenden Nebenwirkungen. Bisher ging man davon aus, dass die anti-inflammatorischen Wirkungen der Glucocorticoide weitgehend über den Mechanismus der Trans-Repression reguliert werden, wohingegen die Nebenwirkungen vor allem durch DNA-bindungsabhängige Aktivierung (GRE) und Repression (nGRE) von Zielgenen vermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die DNA-bindungsabhängige Cis-Repression untersucht. Dabei wurden sowohl neue nGRE-Bindungselemente identifiziert, als auch bereits bekannte Elemente hinsichtlich der involvierten Kofaktoren näher charakterisiert. Es wurde mit Hilfe des ABCD-Bindungstests die Affinität des GR zum DNA-Element in Abhängigkeit vom Ligandenbindungsstatus (Agonist, Antagonist, ohne Ligand) des Rezeptors untersucht. Der Rezeptor bindet das Konsensus-DNA-Element in vitro weitgehend unabhängig von dem eingesetzten Liganden. Der ABCD-Bindungstest wurde außerdem eingesetzt, um GR-Kofaktoren mittels Western Blot und Massenspektrometrie zu identifizieren. Der Korepressor N-CoR (nuclear receptor corepressor) bindet den GR-DNA-Komplex in vitro in Abhängigkeit vom Ligandenbindungsstatus. Massenspektrometrisch konnten mit dieser Methode Proteine wie Hsp90, Hsp70 und (beta)-Tubulin identifiziert werden. Die Konsensussequenz von nGREs weist erhebliche Unterschiede zu der klassischen GRE-Sequenz auf. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass der GR zu nGREs eine deutlich niedrigere Bindungsaffinität hat als zu GREs. Derzeit geht man davon aus, dass die DNA die Konformation des Rezeptors durch allosterische Effekte moduliert. Mit Hilfe des partiellen Proteaseverdaus konnte ein Hinweis dafür erbracht werden, dass der Glucocorticoid-Rezeptor auf einem positive GRE in einer anderen Konformation vorliegt als auf einem negativen GRE, was in einem unterschiedlichen Bandenmuster resultiert. Die mRNA-Expressionsanalyse (Affimetrix) von T-Zellen aus GRwt- bzw. GRdim/dim-Mäusen ergab eine bisher unerwartete Rolle der DNA-abhängigen GR-Genregulation in der inflammatorischen Immunantwort (G. Schütz und P. Krammer, DKFZ). In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene FasLigand (CD95L) und SOCS-3 bezüglich vorhandener nGREs sowohl in silico als auch in vitro analysiert. Die GR-vermittelte Repression des FasL spielt bei dem aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) eine Rolle. SOCS-3 blockiert die Wirkung von Zytokinen durch Inhibierung des JAK/STAT-Signaltransduktionsweges und ist in die Regulation der HPA-(hypothalamic-pituitary-adrenal) Achse eingebunden. Um die Hinweise der mRNA-Expressionsanalyse zu bestätigen, wurden Luciferase-Reportergentests mit FasL- bzw. SOCS-3-Promotorkonstrukten bei Kotransfektion von GRwt oder GRdim durchgeführt. Im Vergleich mit bereits charakterisierten Promotoren konnte sowohl für FasL als auch für SOCS-3 der Mechanismus der Cis-Repression nachgewiesen werden. Negative GREs zeigen im Gegensatz zu positiven GREs keine gute Konservierung der DNA-Sequenz. Um potenzielle nGREs in den neuen Zielgenen in silico zu charakterisieren, wurde durch Analyse bereits charakterisierter nGREs ein Suchmuster entwickelt. Die ermittelten DNA-Bereiche wurden im ABCD-Bindungstest auf ihre Affinität zum GR überprüft. Für den FasL-Promotor konnten drei potenzielle GR-Bindungselemente ermittelt werden. Zwei dieser Bindungsstellen binden den GR im Kontext der Zelle (Chromatin-Immunpräzipitation, N. Novac, AG Heinzel). Für den SOCS-3-Promotor wurden zwei GR-Bindungsstellen charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit konnte durch die Ermittlung neuer negativer Bindungselemente des GR ein Hinweis dafür erbracht werden, dass nGREs auch im Kontext der Immunsuppression eine Rolle spielen, und dass der Korepressor N-CoR möglicherweise bei der Cis-Repression von Bedeutung ist.