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The number of sequenced genomes increases rapidly due to the development of faster, better and new technologies. Thus, there is a great interest in automation, and standardization of the subsequent processing and analysis stages of the generated enormous amount of data. In the current work, genomes of clones, strains and species of Streptococcus were compared, which were sequenced, annotated and analysed with several technologies and methods. For sequencing, the 454- and Illumina-technology were used. The assembly of the genomes mainly was performed by the gsAssembler (Newbler) of Roche, the annotation was performed by the annotation pipeline RAST, the transfer tool RATT or manually. Concerning analysis, sets of deduced proteins of several genomes were compared to each other and common components, the so-called core-genome, of the used genomes of one or closely related species determined. Detailed comparative analysis was performed for the genomes of isolates of two clones to gather single nucleotide variants (SNV) within genes.
This work focusses on the pathogenic organism Streptococcus pneumoniae. This species is a paradigm for transformability, virulence and pathogenicity as well as resistance mechanisms against antibiotics. Its close relatives S. mitis, S. pseudopneumoniae and S. oralis have no pathogenicity potential as high as S. pneumoniae available and are thus of high interest to understand the evolution of S. pneumoniae. Strains of two S. pneumoniae clones were chosen. One is the ST10523 clone, which is associated with patients with cystic fibrosis and is characterized by long-term persistence. This clone is lacking an active hyaluronidase, which is one of the main virulence factors. The lack of two phage clusters possibly contributed to the long persistence in the human host. The clone ST226 shows a high penicillin resistance but interestingly one strain is sensitive against penicillin. Here it could be seen that the penicillin resistance mainly arose from the presence of mosaic-PBPs, while special alleles of MurM and CiaH - both genes are associated with penicillin-resistance – were present in resistant and sensitive strains as well. Penicillin resistance of S. pneumoniae is the result of horizontal gene transfer, where DNA of closely related species, mainly S. mitis or S. oralis, served as donor. The transfer of DNA from the high-level penicillin-resistant strain S. oralis Uo5 to the sensitive strain S. pneumoniae R6 was intentioned to reveal the amount of transferred DNA and whether it is possible to reach the high resistance level of S. oralis Uo5. Altogether, about 19kb of S. oralis DNA were transferred after three successive transformation steps, about 10-fold less than during transfer from S. mitis, which is more closely related to S. pneumoniae, as donor. MurE was identified as new resistance determinant. Since the resistance level of the donor strain could not be reached, it is assumed, that further unknown factors are present which contribute to penicillin resistance. The comparison of S. pneumoniae and its close relatives was performed using deduced protein sequences. 1.041 homologous proteins are common to the four complete genomes of S. pneumoniae R6, S. pseudopneumoniae IS7493, S. mitis B6 and S. oralis Uo5. Most of the virulence and pathogenicity factors described for S. pneumoniae could also be found in commensal species. These observations were confirmed by further investigations by Kilian et al. (Kilian, et al., 2019). After adding 26 complete S. pneumoniae genomes to the analysis, only 104 gene products could be identified as specific for this species. Investigations of a larger number of related streptococci, which were isolated from human and several primates, confirmed the presence of most of the virulence factors of human pneumococci in S. oralis and S. mitis strains from primates. While NanBC is common among S. pneumoniae and is missing in all S. oralis, all S. oralis contain a ß-N-acetyl-hexosaminidase which vice versa is missing in S. pneumoniae. The occurrence of S. oralis also in free-living chimpanzees suggests the assumption, that this species is part of the commensal flora of these Old-World monkeys unlike S. pneumoniae which has evolved with its human host. Compared to S. pneumoniae, S. oralis shows an amazing variability in factors important for biosynthesis of peptidoglycan and teichoic acid (PBP, MurMN, lic-cluster). Some streptococci contain a second PGP3 homologue. Additional analyses with further isolates, especially of wild animals, are necessary to determine host-specific components.
Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.