Doctoral Thesis
Refine
Year of publication
- 2002 (2) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (2) (remove)
Has Fulltext
- yes (2)
Keywords
- Genregulation (2) (remove)
Faculty / Organisational entity
Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Verbindungen aus imperfekten Pilzen zu selektieren und zu isolieren, die ueber die Hemmung des JAK2-STAT-1alpha-Signalweges die Induktion der iNOS-Expression in humanen A549/8-Zellen, humanen Lungen-Alveolarepithel-Karzinom-Zellen, negativ beeinflussen. Es konnten drei Verbindungen aus unterschiedlichen Penicillium-Staemmen isoliert werden, die durch Reportergen-Analysen betreffend der Wirkung der Rohfermentationsprodukte auf die iNOS-, eNOS-Promotor-Aktivitaet sowie der STAT-1alpha-abhaengigen Promotor-Aktivitaet selektiert wurden. Die Substanzen Sporogen-A01, S-Curvularin sowie S14-95 zeigten in den Reportergen-Analysen aehnliche Aktivitaeten, die sich nur in der Potenz unterschieden. Waehrend Sporogen-A01 und S-Curvularin eine, wenn auch konzentrationsunabhaengige, Hemmung auf die NF-kappaB-abhaengige Promotor-Aktivitaet in HeLa-S3-Zellen zeigten, so ergab sich fuer S14-95 kein Einfluss auf diesen Signaltransduktionsweg. Bei S14-95 scheint es sich um eine spezifisch die IFN-gamma-abhaengigen Wege der transkriptionellen Aktivierung der iNOS hemmende Verbindung zu handeln. Die Effekte dieser Substanz auf den humanen TNF-alpha-Promotor liegen wie auch fuer S-Curvularin bei 80% Hemmung und auch der humane COX-2-Promotor wurde durch alle drei Substanzen in Reportergen-Analysen stark gehemmt. In A549/8-Zellen zeigten die Substanzen keine (S14-95 und S-Curvularin) oder lediglich geringe (Sporogen-A01) Wirkung auf die Zellproliferation. Die Verbindungen stellen wichtige Strukturen dar, die bei der pharmakologischen Unterdrueckung der NO-Produktion in pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen koennten. Im zweiten Teil wurde in humanen DLD1-Zellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen, und A549/8-Zellen die Regulation der iNOS-Expression durch kleine G-Proteine der Rho-Familie, die bekanntermassen in den Signaltransduktionsweg von Cytokinen involviert sind, untersucht. Atorvastatin und Lovastatin (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer), die Ras- und Rho-Proteine gleichermassen indirekt hemmen, indem sie ihre essentielle Membranverankerung verhindern, erhoehten die Cytokin-induzierte NO-Produktion und iNOS-mRNA-Expression in den untersuchten humanen Zellen auf das 2 bis 4-fache, ohne jedoch selbst die Expression der iNOS induzieren zu koennen. DLD1- und AKN1-Zellen, die stabil mit einem 16kb-Fragment des humanen iNOS-Promotors vor einem Luziferase-Reportergen transfiziert worden waren, zeigten in Gegenwart von Atorvastatin oder Lovastatin eine mehr als 2,5-fache Steigerung der Cytokin-induzierten Luziferaseaktivitaet, was fuer eine erhoehte Transkriptionsrate als Ursache der erhoehten iNOS-mRNA-Spiegel spricht. In A549/8piNOS(16)Luc-Zellen erhoehten die beiden Statine die Luziferaseaktivitaet dagegen in einem weitaus geringerem Masse, so dass in diesen Zellen eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen, im Sinne einer erhoehten iNOS-mRNA-Stabilitaet, anzunehmen ist. Die beobachtete Statin-vermittelte Verstaerkung der Cytokin-induzierten iNOS-mRNA-Expression und iNOS-Promotoraktivitaet konnte durch Substitution von Mevalonat und Geranylgeranylpyrophosphat wieder vollstaendig aufgehoben werden, waehrend die Koinkubation mit FPP nur eine geringfuegige Reduktion zur Folge hatte. Die Superinduktion war somit das Ergebnis einer spezifischen Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und beruhte auf der Hemmung posttranslational geranylgeranylierter Proteine. Vor dem Hintergrund, dass die kleinen G-Proteine der Rho-Familie vorwiegend geranylgeranyliert und die der Ras-Familie hauptsaechlich farnesyliert werden, scheint die Cytokin-induzierte iNOS-Expression durch Rho-Proteine negativ reguliert zu werden. Diese Hypothese konnte dadurch verifiziert werden, dass auch Clostridium difficile Toxin B - das durch UDP-Glucosylierung saemtliche Rho-Proteine (Rho, Rac, Cdc42) direkt inaktiviert, Ras-Proteine jedoch unbeeinflusst laesst - die Cytokin-induzierte iNOS-mRNA-Expression in den humanen Zellen auf mehr als das Dreifache zu steigern vermochte.
Microsystem technology has been a fast evolving field over the last few years. Its ability to handle volumes in the sub-microliter range makes it very interesting for potential application in fields such as biology, medicine and pharmaceutical research. However, the use of micro-fabricated devices for the analysis of liquid biological samples still has to prove its applicability for many particular demands of basic research. This is particularly true for samples consisting of complex protein mixtures. The presented study therefore aimed at evaluating if a commonly used glass-coating technique from the field of micro-fluidic technology can be used to fabricate an analysis system for molecular biology. It was ultimately motivated by the demand to develop a technique that allows the analysis of biological samples at the single-cell level. Gene expression at the transcription level is initiated and regulated by DNA-binding proteins. To fully understand these regulatory processes, it is necessary to monitor the interaction of specific transcription factors with other elements - proteins as well as DNA sites - in living cells. One well-established method to perform such analysis is the Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) assay. To map protein-DNA interactions, living cells are treated with formaldehyde in vivo to cross-link DNA-binding proteins to their resident sites. The chromatin is then broken into small fragments, and specific antibodies against the protein of interest are used to immunopurify the chromatin fragments to which those factors are bound. After purification, the associated DNA can be detected and analyzed using Polymerase Chain Reaction (PCR). Current CHIP technology is limited as it needs a relatively large number of cells while there is increasing interest in monitoring DNA-protein interactions in very few, if not single cells. Most notably this is the case in research on early organism development (embryogenesis). To investigate if microsystem technology can be used to analyze DNA-protein complexes from samples containing chromatin from only few cells, a new setup for fluid transport in glass capillaries of 75 µm inner diameter has been developed, forming an array of micro-columns for parallel affinity chromatography. The inner capillary walls were antibody-coated using a silane-based protocol. The remaining surface was made chemically inert by saturating free binding sites with suitable biomolecules. Variations of this protocol have been tested. Furthermore, the sensitivity of the PCR method to detect immunoprecipitated protein-DNA complexes was improved, resulting in the reliable detection of about 100 DNA fragments from chromatin. The aim of the study was to successively decrease the amount of analyzed chromatin in order to investigate the lower limits of this technology in regard to sensitivity and specificity of detection. The Drosophila GAGA transcription factor was used as an established model system. The protein has already been analyzed in several large-scale CHIP experiments and antibodies of excellent specificity are available. The results of the study revealed that this approach is not easily applicable to "real-world" biological samples in regard to volume reduction and specificity. Particularly, material that non-specifically adsorbed to capillary surfaces outweighed the specific antibody-antigen interaction, the system was designed for. It became clear that complex biological structures, such as chromatin-protein compositions, are not as easily accessible by techniques based on chemically modified glass surfaces as pre-purified samples. In the case of the investigated system, it became evident that there is a need for more research that goes beyond the scope of this work. It is necessary to develop novel coatings and materials to prevent non-specific adsorption. In addition to improving existing techniques, fundamentally new concepts, such as microstructures in biocompatible polymers or liquid transport on hydrophobic stripes on planar substrates to minimize surface contact, may also help to advance the miniaturization of biological experiments.