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Das antioxidative Potenzial eines roten Mehrfruchtsaftes mit hohem Anthocyan-/Polyphenolanteil wurde in zwei humanen Interventionsstudien mit Biomarkern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort charakterisiert. Ergänzend wurden ein Mehrfruchtsaftextrakt (ME) und ausgewählte potentiell antioxidativ wirksame Mehrfruchtsaftinhaltsstoffe (Anthocyane) in in vitro-Experimenten untersucht. In einer Interventionsstudie nahmen 18 männliche Probanden nach einer 3-wöchigen Run-in-Phase über vier Wochen täglich 700 mL eines anthocyanreichen Mischfruchtsaftes (TEAC 19,1 mmol/L Trolox) auf. Anschließend folgte eine 3-wöchige Wash-out-Phase ohne Saftaufnahme. Neun der 18 Probanden nahmen zusätzlich an einer zweiten Interventionsstudie mit identischem Design teil, jedoch unter Verwendung eines Kontrollsaftes, in dem die phenolische Fraktion weitgehend technologisch entfernt wurde. Wöchentliche wurde Blut entnommen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schädigung, Lipidperoxidationsprodukte Malondialdehyd, Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen und Isoprostane (Urin), Glutathionspiegel/-status und DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors NFkappaB. Ergänzend wurden die Konzentrationen der Carotinoide und des alpha-Tocopherols in Plasma bestimmt. In den in vitro-Experimenten kam ein zweistufiges Inkubationsprotokoll in humanen Blut- bzw. Kolonzelllinien (Jurkat, Caco-2) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h bzw. 1 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Untersucht wurde neben der zellfreien Bestimmung der antioxidativen Kapazität (TEAC), die Modulation (oxidativer) DNA-Schädigung und des ROS-Levels in der Zelle. Die Ergebnisse der Interventionsstudie mit Mehrfruchtsaft zeigten eine signifikante Abnahme oxidativer DNA-Schäden (p< 0,0005), Zunahme des tGSH-Spiegels (p< 0,0005) und Anstieg des Glutathionstatus (p< 0,05) während der 4-wöchigen Saftaufnahme im Vergleich zu den 3-wöchigen Run-in-/Wash-out-Phasen. Eine signifikante Abnahme der Lipidperoxidation dagegen wurde nicht beobachtet. Es zeigte sich lediglich eine deutliche Tendenz zu einer Abnahme der Isoprostangehalte während der Saftaufnahme. Eine Verringerung der DNA-Bindungsaktivität von NFkappaB durch Saft war nicht nachweisbar. Die Plasmagehalte der Carotinoide und des alpha-Tocopherols, als mögliche und bekanntermaßen antioxidativ wirksame Substanzen, blieben während aller Interventionsphasen unverändert. Für die beobachteten protektiven Effekte scheinen die phenolischen Substanzen des Mehrfruchtsaftes verantwortlich zu sein, da in der Studie mit Kontrollsaft keine Reduktion von oxidativen Schäden nachgewiesen werden konnte. Der ME zeigte eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (4,64 mM Trolox) im zellfreien Testsystem. Der zelluläre ROS-Level wurde in vitro durch den Extrakt (bei 100-250 µg/mL) signifikant verringert (p< 0,05). Oxidative DNA-Schäden in Jurkat-/Caco-2-Zellen wurden durch den Extrakt nicht signifikant vermindert; es zeigte sich lediglich die Tendenz einer protektiven Wirkung (bei 10 µg/mL). Von den vergleichend in Jurkat-Zellen getesteten Anthocyanidinen zeigten Malvidin und Delphinidin nach 24 h Inkubation kein Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden. Bei einstündiger Antioxidansbehandlung dagegen, konnte ein einheitlicher Trend einer protektiven Modulation (bei 10-100 µM) beobachtet werden. Zusammenfassend besitzt der flavonoid/polyphenolreiche rote Mischfruchtsaft ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung in gesunden Probanden. Dieses geht, begründet aus den Ergebnissen der Saft-/Kontrollsaftstudie, vermutlich auf die phenolische Fraktion des Saftes zurück. Aufgrund der in vitro erhaltenen Daten kann die antioxidative Wirksamkeit jedoch nicht maßgeblich auf die untersuchte Substanzgruppe der Anthocyane zurückgeführt werden. Dies legt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/Stoffgruppen einen Beitrag zu der antioxidativen Wirksamkeit leisten.
Anthocyane, eine Untergruppe der Flavonoide, sind als natürliche Farbpigmente weit verbreitet in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft. Ihnen werden eine Reihe von gesundheitlich positiven Wirkungen zugeschrieben, was dazu geführt hat, dass auf dem Markt für Nahrungsergänzungsmittel immer mehr Produkte auf Anthocyanbasis auftauchen. Als ein möglicher nachteiliger Faktor für eine potentielle genotoxische Wirkung von Flavonoiden wird die Interaktion mit humanen Topoisomerasen diskutiert. Bezüglich einer möglichen Risiko/Nutzen-Evaluierung ist es nicht nur von Bedeutung, ob Flavonoide/Anthocyane mit diesen Enzymen interagieren, sondern auch die Art dieser Interaktion und sich möglicherweise daraus ergebende Konsequenzen, besonders im Hinblick auf die Integrität der DNA. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Anthocyanidine Delphinidin (Del), Cyanidin (Cy), Pelargonidin (Pg), Paeonidin (Pn) und Malvidin (Mv) hinsichtlich ihrer Beeinflussung humaner Topoisomerase I und II zu untersuchen. Ein Schwerpunkt lag bei der Aufklärung des Wirkmechanismus dieser Verbindungen bezüglich einer Stabilisierung des Cleavable Complex, möglichen Interaktionen mit der DNA und die Relevanz dieser Effekte für die Integrität zellulärer DNA. Es konnte gezeigt werden, dass nur die Verbindungen mit vicinalen Hydroxygruppen im B-Ring des Anthocyangrundgerüstes, Del und Cy, effektiv die katalytische Aktivität isolierter humaner Topoisomerase I und Topoisomerase IIalpha + IIbeta hemmen. Sie wirken jedoch nicht wie die klassischen Topoisomerasegifte Camptothecin oder Etoposid über die Stabilisierung des kovalenten Topoisomerase-DNA-Komplexes, sondern stellen rein katalytische Inhibitoren dar. Del und Cy könnten sogar die DNA vor Topoisomerase I-Giften schützen, da sie zumindest am isolierten Enzym die Stabilisierung des Cleavable Complex der Topoisomerase I durch Camptothecin effektiv verhindern. Für alle getesteten Anthocyanidine konnte gezeigt werden, dass sie im niedrigen mikromolaren Bereich, zwischen 15 µM und 50 µM, sowohl an die kleine Furche der DNA binden, als auch in die DNA interkalieren können und das diese DNA-interagierenden Eigenschaften keinen wesentlichen Beitrag zur Hemmung der Topoisomerasen liefern. Auch wenn im Falle der Anthocyanidine die direkte DNA-Interaktion im Hinblick auf die Topoisomerasehemmung nur von geringer Bedeutung ist, so scheint sie jedoch relevant bezüglich der Integrität zellulärer DNA zu sein. Die einstündige Inkubation von HT29 Kolonkarzinomzellen zeigte, dass bei Inkubation mit den Anthocyanidinen in Konzentrationen >50 µM, signifikant DNA-Schäden induziert werden. Im Hinblick auf die Integrität der DNA lebender Zellen scheint der jeweilige Konzentrationsbereich von entscheidender Bedeutung zu sein. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Überexpression der Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1) nach Inkubation mit Topoisomerasegiften zu untersuchen. Im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Boege, Universitätsklinikum Düsseldorf, wurden uns verschiedene Zellklone zur Verfügung gestellt, die ein Fusionsprotein aus TDP1 und GFP überexprimierten, sowie eine katalytisch inaktive Variante des Enzymes (TDP1-H263A). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen an diesen Zelllinien zur Zytotoxizität von Topoisomerasegiften durchgeführt, sowie Untersuchungen zum Einfluss der TDP1 auf die Induktion von DNA-Schäden durch Topoisomerasegifte. Untersuchungen zum Zellwachstum der verschiedenen Zelllinien mittels MTT-Zytotoxiziätsassay zeigten nach 72 stündiger Inkubation mit den Topoisomerasegiften Camptothecin (Topo I) und Etoposid (Topo II) keinen signifikanten Wachstumsvorteil bei Überexpression der TDP1. Betrachtet man jedoch die Induktion von DNA-Schäden bei Kurzzeitinkubationen (1h) von Camptothecin im Comet-Assay, so erkennt man eine signifikante Reduktion der DNA-Schäden bei Überexpression der TDP1. Ist bei der TDP1 das katalytische Histidin 263 gegen Alanin ausgetauscht, steigen die DNA-Schäden auf das gleiche Niveau wie bei nicht TDP1-überexprimierenden Zellen, d.h. es findet keine Reparatur statt. Erstaunlicherweise zeigte sich auch bei der Inkubation mit dem Topoisomerase II-Gift Etoposid, welches ursprünglich als Negativkontrolle gedacht war, der gleiche Reparatureffekt. Eine Hochregulation DNA-reparierender Enzyme ist unwahrscheinlich, da bei Inkubation mit dem DNA-methylierenden Agens N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) alle Zelllinien eine vergleichbare Menge an DNA-Schäden aufwiesen. Die nunmehr erzielten Ergebnisse eröffnen erstmals die Möglichkeit den Comet-Assay, unter Verwendung der unterschiedlichen TDP1-Klone, zum Auffinden von TDP1-Hemmstoffen einzusetzen.