Doctoral Thesis
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Polychlorierte Dibenzo-p-dioxine wie 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), die zur Stoffgruppe der polyhalogenierten Kohlenwasserstoffe gehören, sind lipophile und persistente Umweltkontaminanten. Sie entstehen als unerwünschte Verunreinigungen bzw. Begleitstoffe vor allem während Verbrennungsprozessen organischer Materialien wie Holz oder Müll, im Tabakrauch sowie als Nebenprodukt chlororganischer Synthesen. Aufgrund ihrer hohen Lipophile reichern sie sich in der Nahrungskette an. Dioxine wie TCDD verursachen eine Vielzahl von biochemischen und toxischen Effekten wie z.B. Enzym-Induktion, Lebertoxizität, dermale Toxizität, Immuntoxizität und Kanzerogenität. Im Tiermodell konnte eine Beeinträchtigung des Fortpflanzungssystems und des Hormonhaushaltes beobachtet werden. In der Literatur herrscht Einigkeit, dass die meisten wenn nicht sogar alle toxischen Wirkungen der Dioxine über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR) vermittelt werden. Im letzten Jahrzehnt konnten jedoch in mehreren Studien AhR-unabhängige TCDD-Wirkungen beobachtet werden. Nur wenige Studien befassen sich mit der Niere als Zielorgan, wobei belegt werden konnte, dass der AhR auch für die Entwicklung der Niere eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine Tierstudie mit Wildtyp- und AhR-defizienten-Mäusen durchgeführt und dabei auch die Niere als Zielorgan betrachtet. Zunächst wurden weibliche und männliche Wildtyp- und AhR-defiziente-Mäuse einmalig mit TCDD (25 µg/kg KG) oral behandelt. Anschließend wurden Genexpressionsmuster in den Nieren mittels Microarray analysiert. In den Nieren behandelter Wildtyp-Mäuse wiesen 172 Gene, und in den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse wiesen 325 Gene eine veränderte Expression auf. In den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse wurden Gene hochreguliert, die in Prozesse des blutbildenden Systems, der Blutgerinnung sowie der Biosynthese von Sterolen und des Katabolismus von organischen Säuren involviert sind. Herrunterreguliert wurden Gene, die in Prozesse des Lipidmetabolismus, der Biosynthese sowie des Metabolismus kleinerer Moleküle und des Metabolismus von Hormonen involviert sind. Mittels RT-PCR wurde die im Microarray beobachtete erhöhte Expression einiger ausgewählter Gene des blutbildenden Systems (z. B. Hba-a1, Hbb-b1 und Rps14) und der Blutgerinnung (z. B. Fgg und F10) sowie einiger hepatischer Gene wie Lpl, Anxa1, c-Myc, Igfbp1, Esm1 und Cdh1 (Microarray-Analyse der Lebern wurde in einer früheren Studie gemessen) bestätigt. Des Weiteren wurde eine leichte, teilweise signifikant erhöhte Expression einiger pro-bzw. antiinflammatorischer Zytokine (IL-1α, IL-1ß, Il-6, IL-10 und TNF-α) in den Lebern und Milzen behandelter AhR-defizienter-Mäuse beobachtet. Die Induktion fremdstoffemtabolisiernder Enzyme wie Cyp1a1, Cyp1a2 und Cyp1b1 in den Organen Leber, Niere, Lunge und Milz behandelter Wildtyp-Mäuse konnte mittels Western-Blot und RT-PCR bestätigt werden, jedoch mit einer Ausnahme. In den Milzen behandelter Wildtyp-Mäuse konnte keine Induktion dieser Enzyme auf mRNA-Ebene beobachtet werden. In den Lebern behandelter AhR-defizienter-Mäuse war die Cyp1b1-Expression signifikant erhöht sowie die AhR-Expression vermindert. Die Induktion der Vitmain D-Rezeptor (VDR)-regulierten Gene Cyp24a1, Cyp27b1 und VDR in den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse weist auf die Aktivierung des VDR hin. Des Weiteren stellt die verminderte Expression von c-Myc in den Nieren TCDD-behandelter Knockout-Mäuse ein Hinweis für die Aktivierung des VDR dar. Durch HPLC/MS-MS-gestützte Untersuchung des Vollblutes von AhR-Wildtyp- und AhR-Knockout-Mäusen konnten Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den Genotypen bestimmt werden. So war es möglich Unterschiede im Aminosäuremetabolismus sowie im Tryptophan-Metabolismus zu identifizieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sowohl im unbehandelten wie auch im TCDD-behandelten Zustand, Unterschiede zwischen den Genotypen bestanden.
Methyleugenol (ME), (\(\it E \))-Methylisoeugenol (MIE), alpha-Asaron (aA), beta-Asaron (bA) und gamma-Asaron (gA) sind natürlich vorkommende Pflanzeninhaltsstoffe aus der Klasse der Phenylpropene (PP) und Bestandteil der menschlichen Ernährung. ME, aA und bA erwiesen sich im Tierversuch als hepatokanzerogen. MIE und gA wurden bislang nicht untersucht. Die allylischen Hepatokanzerogene Estragol und Safrol werden im Verlauf des Fremdstoff-metabolismus durch Cytochrom P450-Enzyme (CYP) in 1‘-Position hydroxyliert und anschließend durch Sulfotransferasen sulfoniert. Der reaktive Schwefelsäureester kann DNA-Addukte bilden, wodurch in der Folge Mutationen und Tumoren ausgelöst werden können. Für ME wurde der gleiche Mechanismus der Aktivierung postuliert, obgleich definitive Beweise bislang fehlten. Im Gegensatz dazu war die Mehrheit der bislang untersuchten propenylischen PP nicht kanzerogen. aA und bA stellen insofern eine Ausnahme dar. Tierexperimentelle Untersuchungen legen einen alternativen Mechanismus für die Aktivierung von aA und bA nahe. Untersuchungen zum Metabolismus der Asarone liegen bisher nicht vor. Ziel der Arbeit war es daher, den hepatischen Metabolismus dieser fünf PP zu untersuchen, um Einblicke in die potentiellen gentoxischen Mechanismen zu erhalten. Die Metabolitenbildung der fünf Substanzen wurde zeit- und konzentrationsabhängig in humanen und tierischen Lebermikrosomen (LM) sowie verschiedenen humanen CYP-Enzymen (Supersomes\(^{TM}\)) untersucht. Die Metaboliten wurden charakterisiert, identifiziert und synthetisiert, um als Referenzverbindungen für die Quantifizierung sowie für weitere mechanistische in vitro Untersuchungen zu dienen. Ferner wurden enzymkinetische Parameter bestimmt, um eine Extrapolation der Metabolitenbildung hin zu kleinen Substratkonzentrationen sowie die Beteiligung humaner CYPs an der Metabolitenbildung in humanen LM zu ermöglichen. Außerdem wurde die Bildung von DNA-Addukten in primären Rattenhepatozyten nach Inkubation mit ME, MIE sowie deren Metaboliten untersucht. Für alle Verbindungen konnten die folgenden fünf enzymatischen Reaktionen identifiziert werden: Hydroxylierung der Seitenkette, Oxidation dieser Alkohole, Epoxidierung der Seitenkette und Hydrolyse zu Diolen sowie \(\it O \)-Demethylierung. Als Hauptmetaboliten von ME, MIE, aA und gA wurden die jeweiligen Seitenkettenalkohole identifiziert, während bA hauptsächlich über Epoxide zu Diolen metabolisiert wurde. Die Ergebnisse belegen, dass ME, im Gegensatz zu MIE, über den gleichen Mechanismus wie Safrol und Estragol, auch in geringen, humanrelevanten Konzentrationen aktiviert werden kann. Für aA und vor allem bA scheint eine Aktivierung über Epoxide wahrscheinlicher, während es für gA keine Hinweise auf potentiell gentoxische Metaboliten gibt.