Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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Ziel dieser Arbeit war, die Entwicklung von übergangsmetallkatalysierten Kreuzkupplungsreaktionen zur Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsknüpfungen, bei denen Carbonsäuren anstelle der traditionell verwendeten, jedoch ökologisch bedenklichen Organometall-verbindungen (z. B. metallorganische Verbindungen der Elemente Bor, Zinn, Zink, Kupfer oder Magnesium) als Startmaterialien eingesetzt werden. Der wesentlich Schwerpunkt dieser Arbeit bestand darin, die zu diesem Zeitpunkt neu entwickelte decarboxylierende Kreuzkupplungsreaktion von aromatischen Carbonsäuren mit Arylhalogeniden zur synthetischen Reife zu führen.
Charakterisierung der DNA-schädigenden Wirkung von Acrylamid in Lebensmitteln am Modell der Ratte
(2010)
Die alpha,beta-ungesättigte Carbonylverbindung Acrylamid entsteht beim Erhitzen von kohlenhydratreichen Lebensmitteln aus der Reaktion von Aminosäuren (hauptsächlich Asparagin) und reduzierenden Zuckern als Nebenprodukt der Maillard-Reaktion. In Langzeitstudien an Ratten wurde ein kanzerogenes Potential von Acrylamid nachgewiesen, was zu seiner Klassifizierung als „wahrscheinlich kanzerogen am Menschen“ (Kategorie 2a) durch die International Agency for Research on Cancer führte. Als Auslöser der Kanzerogenität von Acrylamid wird ein genotoxischer Mechanismus vermutet, der auf der Reaktion von Glycidamid mit der DNA unter Ausbildung des Hauptadduktes N7-Glycidamid-Guanin (N7-GA-Guanin) basiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der genotoxischen Wirkung von Acrylamid in vivo anhand des modifizierten Comet Assays sowie der massenspektrometrischen Untersuchung von N7-GA-Guanin-Addukten. Die Problematik wurde in zwei Teilprojekten bearbeitet. Zum einen wurde die Auswirkung verschiedener Lebensmittelmatrices auf die genotoxische Wirkung von Acrylamid in der Ratte im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser per Schlundsonde untersucht. Dazu wurden jeweils drei Ratten über maximal neun Tage mit Acrylamid-Dosen von 50 µg/kg KG/d in Trinkwasser oder Brotkruste bzw. 100 µg/kg KG/d in Trinkwasser (Schlundsonde), geschnittenen und rekonstituierten Pommes Frites sowie Lebkuchen behandelt. Zusätzlich wurde jeweils drei Tiere einmalig eine Dosis von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser mittels Schlundsonde verabreicht, was der maximalen Aufnahmemenge über neun Tage entspricht. Außerdem wurde zwei Tieren einmalig 10 mg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser per Schlundsonde gegeben. Die Tötung der Tiere sowie Blut- und Organentnahme erfolgten 24 Stunden nach der letzten Acrylamid-Gabe. Die Untersuchung der Blut- und Leberzellen mittels modifiziertem Comet Assay ließ auf keine signifikante DNA-Schädigung der mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG behandelten Tiere schließen. Auch die einmalige Verabreichung von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser führte zu keiner signifikanten Erhöhung der DNA-Schädigung. Lediglich nach der Gabe von 10 mg Acrylamid/kg KG wurden DNA-Schäden in Blut und Leber detektiert. In den Geweben der für maximal neun Tage mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser oder Lebensmittel behandelten Ratten wurden keine N7-GA-Guanin-Addukte detektiert und lagen somit unterhalb der Nachweisgrenze von 1 Addukt/10E8 Nukleotide. Nach einmaliger Verabreichung von 450 µg Acrylamid/kg KG wurden in allen Organen der behandelten Tiere N7-GA-Guanin-Addukte detektiert, die allerdings unterhalb der Bestimmungsgrenze von 3 Addukten/10E8 Nukleotide lagen. Die einmalige Gabe von 900 µg und 10 mg Acrylamid/kg KG führte zu quantifizierbaren Addukten in allen untersuchten Organen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die zeit- und dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten in der DNA aus Leber, Niere und Lunge weiblicher Sprague-Dawley Ratten untersucht. Dazu wurden die Ratten zunächst einmalig mit 1 mg oder 10 mg Acrylamid/kg KG per Schlundsonde behandelt und die Gewebeproben nach 8, 16 oder 24 Stunden entnommen und untersucht. Nach Ermittlung des Zeitpunktes der maximalen N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurden weitere Ratten einmalig mit 0,1 mg, 0,5 mg, 3 mg oder 6 mg Acrylamid/kg KG behandelt. Neben der N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurde die Bildung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid mittels HPLC-MS/MS untersucht. Die Mercaptursäuren AAMA und GAMA entstehen als Abbauprodukte der Glutathionkonjugate von Acrylamid und Glycidamid und werden über den Urin ausgeschieden. Die dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten wurde 16 Stunden nach Verabreichung von Acrylamiddosen zwischen 0,1 mg und 10 mg/kg KG untersucht. Die N7-GA-Guanin-Addukte konnten erst ab einer Dosis von 1 mg Acrylamid/kg KG in der DNA der Tiere quantifiziert werden. Die Adduktbildung in der 0,1 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe lag unterhalb der Nachweisgrenze, während die Addukte in der 0,5 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe zwar nachweisbar, aber nicht quantifizierbar waren. Im Bereich von 1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein dosisabhängiger Anstieg der N7-GA-Guanin-Addukte beobachtet. Die Ergebnisse der gemessenen Mercaptursäuren zeigen insgesamt, dass 53-55 % der Acrylamid-Dosis von 1 und 10 mg/kg KG innerhalb von 24 Stunden als Mercaptursäuren ausgeschieden werden und dadurch eine effektive Entgiftung von Acrylamid gewährleistet ist. Anhand der ausgeschiedenen GAMA-Menge lässt sich rückschließen, dass 14-18 % der verabreichten 1 und 10 mg Acrylamid/kg KG innerhalb von 24 Stunden zu Glycidamid metabolisiert werden. Die Untersuchung der Mercaptursäuren im 16-Stunden-Sammelurin nach Gabe von 0,1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG zeigte, dass die absolute Ausscheidung von AAMA und GAMA linear mit der Dosis ansteigt.
Zur Entwicklung und Optimierung leistungsfähiger Katalysatoren werden zahlreiche Versuche durchgeführt, die geplant, dokumentiert und ausgewertet werden müssen. Das im Rahmen dieses interdisziplinären Promotionsvorhabens entwickelte elektronische Dokumentationssystem beschleunigt diese Arbeitsschritte deutlich und hilft, Fehler zu vermeiden. Es wurde im Rahmen mehrerer Forschungsprojekte zu innovativen Decarboxylierenden Kreuzkupplungsreaktionen mit Cu/Pd-Katalysatorsystemen erfolgreich eingesetzt. Die neu entwickelten Eintopfsynthesen eröffnen einen neuen Zugangsweg zu unsymmetrischen Arylketonen und Azomethinen in guten bis sehr guten Ausbeuten. Gegenüber herkömmlichen Decarboxylierungsreaktionen konnte die erforderliche Reaktionstemperatur erheblich abgesenkt werden.
Decarboxylierende Kreuzkupplungen verkörpern eine neue Strategie zur C-C-Bindungsknüpfung, bei der Kohlenstoffnucleophile in situ durch übergangsmetallvermittelte Decarboxylierung von ubiquitär vorhandenen Carbonsäuren erzeugt und dann im weiteren Verlauf der Reaktion mit Kohlenstoffelektrophilen gekuppelt werden. Diese Vorgehensweise verbindet zwei Vorteile, nämlich die Regioselektivität, den die traditionellen Kreuzkupplungen gegenüber den Reaktionen haben, die über eine C-H-Aktivierung verlaufen, und den Einsatz von kostengünstigen und einfach zugänglichen, luft- und wasserstabilen Carbonsäuresalzen. Die Vorteile dieser neuen Transformation bestätigten sich durch die Synthese ortho-substituierter Biaryle ausgehend von aktivierten Carbonsäuren und Arylbromiden in der Gegenwart eines kupfer- und palladiumbasierten Katalysatorsystems. Die ursprünglich in Bezug auf das Substitutionsmuster der eingesetzten Carbonsäure beobachtete Substratrestriktion konnte aufgehoben werden. Dies konnte durch die Entwicklung neuer Katalysatorsysteme erreicht werden, die es ermöglichen Kohlenstoffelektrophile mit nicht koordinierenden Abgangsgruppen, wie zum Beispiel Aryltriflate oder -tosylate, in decarboxylierenden Kreuzkupplungen zu verwenden. Dadurch wurde zum ersten Mal das volle Substratspektrum an aromatischen und heteroaromatischen Carbonsäuren für decarboxylierende Kreuzkupplungen erschlossen. Weiterhin führte die separate Untersuchung des Decarboxylierungschritts zu zwei sich ergänzenden Katalysatorsystemen. Das erste, kupferbasierte Katalysatorsystem ermöglicht selbst die Protodecarboxylierung nicht aktivierter Carbonsäuren. Weiterhin wurde ein silberbasiertes Katalysatorsystem entwickelt, welches die Protodecarboxylierung einer Vielzahl von ortho-substituierten aromatischen und heteroaromatischen Carbonsäuren bei Temperaturen von nur 80 °C bis 120 °C ermöglicht. Dies liegt 50 °C unterhalb der Reaktionstemperatur des kupferbasierten Systems. Auf der Grundlage des silberbasierten Tieftemperatur-Decarboxylierungs-Katalysatorsystems wurde ein neues Katalysatorsystem entwickelt, mit dem sich die Reaktionstemperatur decarboxylierender Kreuzkupplungen auf 130 °C verringern lässt. Abschließend kann man sagen, dass das neuartige synthetische Konzept der decarboxylierenden Kreuzkupplung im Rahmen dieser Doktorarbeit zu einer allgemein anwendbaren Methode weiterentwickelt wurde.
Polyphenole sind sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe und werden mit unserer täglichen Nahrung aufgenommen. Um die Relevanz der einzelnen Polyphenole für die positiven Effekte auf die Gesundheit abschätzen zu können, ist es wichtig ihre intestinale Absorption und ihren Metabolismus zu kennen. Äpfel (Malus domestica Borkh.) enthalten eine Vielzahl an Polyphenolen aus den Gruppen der Hydroxyzimtsäuren, Dihydrochalkone, Flavonole und Flavan-3-ole. Es wurden die intestinale Absorption und der Metabolismus dieser Polyphenole in intestinalen Konzentrationen in der Ussing-Kammer anhand verschiedener Modelle (Monolayer der Kolonkarzinomzellline T84, Schweinedarmmukosa und humane Biopsien) untersucht. Parallel wurde der transepitheliale Widerstand (TER) des verwendeten Monolayers gemessen. Er spiegelt die Integrität der intestinalen Barriere wider, die eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen im Körper und bei der Abwehr von Mikroorganismen und pro-inflammatorischen Faktoren spielt. Bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist die Integrität der intestinalen Barriere gegenüber gesunden Personen herabgesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Polyphenole des Apfels einen Einfluss auf die intestinale Barriere haben. Die Analytik der Mediumüberstände aus der Ussing-Kammer auf der apikalen (Darmlumen-) und basolateralen (Blut-) Seite sowie der Zellsuspensionen auf ihre Polyphenolgehalte erfolgte mittels HPLC-ESI-MS/MS und HPLC-DAD. Die transepitheliale Absorption der Polyphenole in den verschiedenen Modellen war strukturabhängig und auch zwischen den Modellen unterschiedlich. Bei den Hydroxyzimtsäuren und ihren Derivaten wurden weniger polare Verbindungen in höherem Maße auf der basolateralen Seite ermittelt als polare. Die untersuchten Flavan-3-ole wurden in beiden Modellen nicht auf die basolaterale Seite absorbiert. Die ausschließlich im Apfel vorkommenden Phloretinglycoside wurden ebenso wie das untersuchte Quercetinglycosid nicht basolateral identifiziert. Das freie Aglykon Phloretin dagegen war auf der basolateralen Seite nachweisbar. Mit den humanen Biopsien erfolgte die Inkubation nur exemplarisch mit den Hydroxyzimtsäuren, auf die basolaterale Seite gelangten nur Mengen unterhalb der Bestimmungsgrenze. Weiterhin wurde untersucht, auf welchem Mechanismus die transepitheliale Absorption der Polyphenole beruht. Die erzielten Ergebnisse weisen darauf hin, dass es sich bei der Aufnahme von Polyphenolen in der Mukosa um eine passive transzelluläre Diffusion handelt. Die Inkubationen von Ferulasäure mit Konzentrationen von bis zu 1000 µM zeigten, dass sowohl Enzyme der T84-Monolayer als auch der Schweinedarmmukosa in der Lage sind, Glucuronide und Sulfate zu bilden, die aber erst bei Inkubationskonzentrationen ab 100 µM nachweisbar waren. Bei der Inkubation von Phloretin und Quercetin in T84-Monolayern wurden außerdem Spuren von Glucuroniden in den Zellsuspensionen nachgewiesen, bei der Inkubation von Phloretin-2‘-O-glucosid wurde das Aglykon Phloretin detektiert. Weiterhin wurde der Einfluss der Polyphenole auf die intestinale Barriere im T84-Modell untersucht, indem der trans¬epitheliale Widerstand (TER) der Monolayer ermittelt wurde. Die intestinale Barriere wird unter anderem durch die sogenannten „Tight junctions“ (TJs) – Verknüpfungen zwischen den Epithelzellen – ausgebildet. Der TER lässt Rückschlüsse auf den Zustand der TJs zu. Die Messung des TER der T84-Monolayer während der Inkubation mit Polyphenolen zeigte, dass es im Gegensatz zur Kontrolle zu einem Anstieg des TER kam, d.h. es kam zu einer Verstärkung der intestinalen Barriere. Als Modell für die intestinale Barriere bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wurden mit Caprinsäure (C10) vorbehandelte T84-Monolayer gewählt. Auch hier kam es bei den Inkubationen mit Polyphenolen im Vergleich zur Kontrolle zu einer Steigerung des TER. Außerdem wurde der Einfluss der Polyphenole auf das TJ-Protein Occludin mittels Immunofluoreszenz¬mikroskopie belegt. Für vier ausgewählte Polyphenole (Ferulasäure, 5 Kaffeoylchinasäure, Phloretin und Phloretin-2‘-O-glucosid) wurde gezeigt, dass sie einen Einfluss auf die Expression von Occludin haben, das einen integralen Bestandteil der intestinalen Barriere darstellt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur intestinalen Absorption und zum Metabolismus von Polyphenolen des Apfels gewonnen. Es wurde gezeigt, dass ein Teil der den Dickdarm erreichenden Apfel¬polyphenole dort absorbiert und metabolisiert werden kann. Weiterhin wurden neue Daten zum Einfluss der Polyphenole auf die intestinale Barriere gewonnen. Die in vitro erzielten Daten weisen darauf hin, dass die Apfelpolyphenole in vivo möglicherweise vor chronisch entzündlichen Darmerkrankungen schützen können. Langfristig wäre eine Nutzung von Lebensmitteln aus Äpfeln oder Apfelpolyphenolen zur Prävention dieser Erkrankungen möglich.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die Synthesen der verschiedenen Liganden vorgestellt. Ausgehend von optisch reiner Weinsäure (natürlich und unnatürlich) ist es möglich zweizähnige C2-symmetrische P,P- und S,S-Liganden zu synthetisieren. Die N,N-Liganden mit Pyrazol als Stickstoffdonor können nicht durch eine SN-2 Reaktion ausgehend von RMOP oder RTfOP und Natriumpyrrazolid synthetisiert werden. Bei den P,P-Liganden können verschiedene Phosphinitliganden und Phosphitliganden mit unterschiedlichen elektronischen und sterischen Eigenschaften hergestellt werden. Die P,N- und P,S-Liganden mit Pyrrolidin als chiralem Rückgrat können über verschiedene Synthesewege hergestellt werden. Eine Trennung der durch die Epoxidöffung entstehenden Enantiomere ist zumindest durch eine CDA-Derivatisierung (Diastereomerenbildung) in einem Fall möglich. Weitere Versuche, andere Alkohole durch enzymatische Racematspaltung oder Kristallisation von Diastereomeren zu trennen, schlugen fehl. Die synthetisierten P,N- und P,S-Liganden und ihre Komplexe lagen somit als Racemat vor. Die Untersuchung ihrer katalytischen Eigenschaften beschränkte sich deshalb nur auf Regioselektivität und Aktivität. Für die mit einem Cyclohexan als chiralem Rückgrat hergestellten P,P‘- und P,N-Liganden wurden die im Arbeitskreis vorhandenen Vorstufen verwendet. Die Katalysatoren mit dem optisch reinem Ligand konnten auf ihre Enantioselektivität in der Katalyse hin untersucht werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden mit den verschiedenen Liganden mit Molybdän(0), Ruthenium(II), Rhodium(I), Iridium(I), Palladium(II), Platin(II), Kupfer(I) und Gold(I) Komplexe hergestellt. Insbesondere Ruthenium(II), Rhodium(I) und Palladium (II) waren wegen ihrer hohen katalytischen Aktivitäten von Interesse. Im dritten Teil der Arbeit wurden erste Katalyseexperimente durchgeführt. Bei der Direkthydrierung der Dehydroaminosäuren α-Acetamidozimtsäure mit Rhodium-, Ruthenium- und Iridium-Katalysatoren liefern die Komplexe [RhI(η4-COD)(κ2-(S,S)-BzOPhPOB)]+BF4- und das Gemisch aus verschiedenen Rutheniumkomplexen mit dem Liganden (S,S)-PhPhPOP die höchste Enantioselektivitäten von OR = 22–24 %. Insgesamt sind bei diesem Substrat die katalytischen Aktivitäten der getesteten Komplexe sehr niedrig. Bei Itaconsäuredimethylsäureester liefern die Rhodiumkomplexe mit den (S,S)-PhPhPOP- und (S,S)-PhTPOP-Liganden nur ein racemischen Produkt bei Aktivitäten von bis zu TOF = 3300 h-1 (T = 40 °C; p = 40 bar). Eine relative hohe Enantioseletivität von ee = 75 % bei der Hydrierung von Itaconsäuremethylester erzielt man mit der Verbindung [RhI(η4-COD)(κ2-(S,S)-BzOPhPOB)]+BF4- bei sehr geringen Aktivitäten (TOF < 20 h-1). Gute optische Reinheiten liefern die Rhodiumsalze mit (S,S)-PhPhPOP- und (S,S)-BzOPhPOB-Liganden bei der Aminosäure N-Acetylalanin (OP = 43–60 %) bei Aktivitäten von bis zu TOF > 400 h-1 bei dem Komplex [RhI(η4-NBD)(κ2-(S,S)-PhPhPOP)]+BF4-. Der Katalysator [RhI(η4-NBD)(κ2-(S,S)-PhPhPOP)]+BF4- ergibt bei dem Produkt N-Acetylalaninmethylester einen Enantiomerenüberschuss von ee = 50 % (TOF = 100 h-1). Der Komplex [RhI(μ1-Cl)(η4-COD)(κ2-(R,R)-PzPhPOC)]/NaBPh4 liefert bei N-Acetylalaninmethylester eine Enantioseletivität von ee = 80 % (TON = 80; TOF = 20 h-1) Die Komplexe mit P,N-, P,S- und S,S-Liganden sind bei den rhodiumkatalysierten Direkthydrierungen gegenüber den P,P-Liganden bei allen getesten Systemen weniger aktiv. Die Transferhydrierungen mit Ruthenium- und Rhodiumkomplexen liefern bei moderaten Aktivitäten nur sehr schlechte Enantiomerenüberschüsse bei allen getesteten Substraten. Höhere Selektivitäten erreicht man bei der rhodiumkatalysierten Hydrosilylierung mit dem PhPhPOP-Liganden (Acetophenon ee = max 50 %). Bei Trost-Tsuji-Allylierungen liefern die verwendeten Komplexen bei den getesteten Systemen bei guten Aktivitäten (TON  66; TOF < 170 h-1) nur sehr geringe Enantioselektivitäten. So ergibt die Verbindung [PdII(η3-Allyl)(κ2-(R,R/S,S)-PhPhPOP)]+PF6- bei dem Produkt Dimethyl-1-(1,3-diphenylprop-2-enyl)malonat eine Enantioseletivität von ee = 11–17 % Die ist nahezu unabhängig vom Lösungsmittel, Temperatur und vom Anion. Im Vergleich dazu ist die Enantioselektivität bei dem Komplex [PdII(η3-Allyl)(κ2-(R,R)-PzPhPOC)]+PF6- mit ee = 9 % nur unwesentlich geringer. Die höchste Enantioselektivität von ee = 48 % liefert der Komplex mit dem Liganden PhPhenphos bei dem Produkt Dimethyl-3-cyclohexenylmalonat. Die Allylierung von (E)-1-Phenyl-2-propen-1-ylacetat mit DMM liefert bei den getesteten Komplexen mit hohen Regioselektivitäten das unerwünschte Linearprodukt (E)-2-(3-Phenyl-allyl)malonsäuredimethylester.
Bei Acrylamid handelt es sich um ein genotoxisches Kanzerogen, welches beim Erhitzen von Lebensmitteln gebildet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit spezifische Lebensmittelmatrices die Bioverfügbarkeit und den Metabolismus von Acrylamid beeinflussen. Lebkuchen als zuckerhaltiges, fettarmes und trockenes Lebensmittel auf Getreidebasis und Pommes frites (fett- und wasserreich; Kartoffelbasis) die entweder direkt aus der Kartoffel geschnitten (mit intakter Gewebestruktur) oder aus Kartoffelerzeugnissen „rekombiniert“ wurden sowie Brotkruste wurden an männliche Sprague Dawley-Ratten über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage verfüttert und mit der Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser (Schlundsondierung)verglichen. Die täglich verabreichte Acrylamid-Dosis lag bei 100 µg/kg KG für Pommes frites und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für Brotkruste. Als Langzeit-Expositionsbiomarker wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin (Val) am Hämoglobin (Hb) herangezogen. Das Ausmaß der AAVal-Bildung in den Tieren, denen Acrylamid über Pommes frites verabreicht wurde, entsprach jener nach Gabe einer entsprechenden Dosis Acrylamid in Trinkwasser mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen), was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Lediglich in den Gruppen, die Acrylamid über Brotkruste erhielten, wurde eine geringfügig verminderte Bildung von AAVal-Hb-Addukten im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen beobachtet. Nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites wurde kein signifikanter Unterschied in der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren im Vergleich zur Gabe in Trinkwasser mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen) beobachtet, was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Bei den mit Brotkruste gefütterten Tieren wurde eine im Vergleich zu AA-TW-Gruppen geringfügig erniedrigte Ausscheidung an AAMA beobachtet, was im Einklang mit der erniedrigten AA-Val-Bildung steht. Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem Organismus wurde auch die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin bestimmt. Die ausgeschiedenen Anteile an der verabreichten Tagesdosis leisten einen im Vergleich zu den Mercaptursäuren verhältnismäßig geringen Beitrag zur Gesamtausscheidung einer verabreichten Acrylamid-Dosis. Zur Untersuchung der Resorptionskinetik von Acrylamid bei Verabreichung über Pommes frites im Vergleich zur Aufnahme in Trinkwasser (Schlundsondierung) wurden über einen Zeitraum von 4 Stunden die Acrylamid- und Glycidamid-Gehalte in Rattenserum bestimmt. Insgesamt deutet der zeitliche Verlauf der Acrylamid-Serumkonzentration in der mit Pommes frites gefütterten Gruppe auf eine im Vergleich zur AA-TW-Gruppe verzögerte Freisetzung bzw. verlangsamte Resorption von Acrylamid im Gastrointestinaltrakt hin. Zur Abschätzung der Hintergrundbelastung mit Acrylamid wurden in 8 humanen Blutproben die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukten (AAVal, GAVal) sowie in 10 humanen Urinproben die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren (AAMA, GAMA) bestimmt. Bei den Rauchern wurden deutlich höhere AAVal-Gehalte im Vergleich zu Nichtrauchern gemessen, wohingegen die Gehalte an GAVal auf vergleichbarem Niveau lagen. Darüber hinaus wurde bei den Rauchern eine im Vergleich zu Nichtrauchern signifikant höhere Ausscheidung von AAMA und GAMA beobachtet, wobei die entsprechenden GAMA/AAMA-Verhältnisse bei Rauchern erniedrigt waren. Im Rahmen einer humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin des Hämoglobin bestimmt. Dabei wurde das Ausmaß der Addukt-Bildung bei 13 Probanden nach Aufnahme von ca. 1 mg Acrylamid über Kartoffel-Chips jeweils bei unbeeinflusster, gehemmter und induzierter CYP450 2E1-Aktivität untersucht. In der Referenzperiode ohne Komedikation wurde bei diesen Probanden ein Anstieg der AAVal-Gehalte um 8 ± 5 pmol/g Hb beobachtet. Ein im Vergleich zur R-Phase signifikant erhöhter AAVal-Anstieg (12 ± 5 pmol/g Hb) zeigte sich in der Testperiode T1, in der CYP450 2E1 durch Disulfiram gehemmt wurde. In der Testperiode T2, in der CYP450 2E1 durch eine Vorbehandlung mit Ethanol induziert wurde, wiesen die AAVal-Gehalte einen mit der R-Phase vergleichbaren Anstieg um 9 ± 5 pmol/g Hb auf. Für GAVal hingegen konnten aufgrund der größeren Messwertschwankungen keine signifikanten Veränderungen in der Testperiode T1 bzw. T2 im Vergleich zur Referenzperiode festgestellt werden. Darüber hinaus wurde bei 3 Probanden der zeitliche Verlauf der AAVal-Bildung in den jeweiligen Testperioden über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die maximale AAVal-Konzentration wurde bei den untersuchten Probanden im Zeitraum von 8-10 Stunden erreicht, wobei anschließend ein Plateau-förmiger Verlauf der Bildungskurven beobachtet wurde.
2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) wurde im Jahr 1997 von der International Agency for Research on Cancer als Gruppe 1 Kanzerogen eingestuft, obwohl die molekularen Mechanismen der kanzerogenen Wirkung von TCDD bislang nicht vollständig geklärt werden konnten. TCDD zeigte im Tierversuch ein erhöhtes hepatokarzinogenes Potential an Ratten, und im Initiations-Promotions-Modell in der Rattenleber konnte TCDD eine starke tumorpromovierende Wirkung zugeschrieben werden. Eine Reihe von Studien zeigten sowohl in vivo als auch in vitro in unterschiedlichen Zellsystemen eine Hemmung des durch verschiedene Stimuli induzierten programmierten Zelltodes, der Apoptose durch TCDD. Diese antiapoptotische Wirkung wird als ein möglicher Mechanismus für die Tumorpromotion von TCDD diskutiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Mechanimus der Apoptose-Hemmung durch TCDD in Leberzellsystemen der Ratte und des Menschen untersucht werden. Außerdem sollte die Frage geklärt werden, ob die anti-apoptotische Wirkung dieses Fremdstoffes über den Arylhydrokarbon-Rezeptor (AhR) vermittelt wird. Die Aufklärung der bislang noch unbekannten molekularen Mechanismen der TCDDvermittelten Kanzerogenese könnte die Risikobewertung einer TCDD-Exposition des Menschen auf eine erheblich solidere Basis stellen als bisher. Es konnte sowohl in primären Rattenhepatozyten als auch in der humanen Hepatomzelllinie Huh-7 bestätigt werden, dass TCDD die durch UVC-Licht induzierte Apoptose hemmt. Dies wurde auf Ebene der DNS-Fragmentierung und an Hand morphologischer Veränderungen des Zellkerns gezeigt. In den Primärhepatozyten war der anti-apoptotische Effekt von TCDD abhängig von einer Aktivierung des AhR. Die Apoptose durch die beiden Proteinbiosynthese-Inhibitoren Ochratoxin A und Cycloheximid wurde im Gegensatz zur UVC-Licht-induzierten Apoptose nicht durch TCDD gehemmt. Dies lässt den Schluss zu, dass eventuell die Neusynthese eines durch den AhR induzierten Proteins für die Hemmung der Apoptose in diesen Zellen nötig ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass entgegen früherer Studien, eine Hemmung der Aktivität des Tumorsuppressors p53 vermutlich nicht für die Apoptosehemmung durch TCDD verantwortlich ist. TCDD-bedingte Änderungen in der Expression von an der Apoptose beteiligten Genen ließen die Vermutung zu, dass diese Substanz zu einer Aktivierung des anti226 apoptotischen Transkriptionsfaktors NF-κB führt. Dies würde letztendlich zu einer Hemmung der Caspase-abhängigen Apoptosewege führen. Es konnte dennoch keine Wirkung des Fremdstoffes auf die Charakteristiken der durch UVC-Licht induzierten Caspasen-abhängigen Apoptose beobachtet werden. Weder wurden die proteolytische Aktivierung, noch die katalytische Aktivität von Caspasen oder die Spaltung von Caspasensubstraten durch TCDD moduliert. Daher wurde angenommen, dass TCDD im Signalweg der Apoptose zwischen der Caspasenaktivität und der apoptotischen DNS-Fragmentierung wirken müsste. Auf Grund dieser Hypothese wurde der Einfluss der Testsubstanz auf die Charakteristiken apoptotischer Nukleasen untersucht. Weder konnte eine verringerte Proteinmenge an Endonuklease G oder Caspase-aktivierter DNase (CAD) festgestellt werden, noch wurde die Aktivität rekombinant exprimierter CAD durch TCDD moduliert. In isolierten Zellkernen primärer Rattenhepatozyten konnte eine intrinsische Nukleaseaktivität identifiziert werden, die Calcium- und Magnesium-abhängig war und vermutlich durch nicht-physiologische Konzentrationen an monovalenten Ionen aktiviert wird. TCDD besaß eine hemmende Wirkung auf diese Nukleaseaktivität. Es erscheint plausibel, dass TCDD die apoptotische DNS-Fragmentierung über einen bisher unbekannten, AhR-abhängigen Mechanismus hemmt, und damit trotz einer Initiation der Apotpose die Integrität der DNS aufrecht erhält, um der Zelle die Möglichkeit zur Entgiftung von Aktivatoren des Fremdstoffmetabolismus zu geben. Diese Zellen könnten sich nach Entzug des pro-apoptotischen Stimulus letztendlich wieder erholen. Da solche Zellen DNS-Schäden tragen können, durch die sie unter normalen Umständen in die Apoptose getrieben worden wären, könnte dieser Mechanismus schließlich eine Rolle in der Tumorpromotion durch TCDD und verwandte Verbindungen spielen.
Wissenschaftliche Studien deuten auf eine gesundheitsförderndes und gewichtsregulierendes Potential des Kaffees hin, welches vor allem mit dem hohen Gehalt an Antioxidantien in Verbindung gebracht wird. In dieser Arbeit wurden Kaffeeextrakte, -inhaltsstoffe sowie Kaffeegetränke hinsichtlich ihrer antioxidativen Wirksamkeit untersucht. In-vitro wurde die präventive Wirkung von Extrakten aus leicht (AB1), mittel (RI, AC, AB) und stark (AB 2) gerösteten Kaffees mit Markern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort in den Kolonkarzinomzelllinien HT-29 und Caco-2 charakterisiert. Vergleichend wurden die ausgewählten originären Kaffeeinhaltstoffe 5-Caffeoylchinasäure (5-CQA) und Trigonellin (TRIG) sowie die Röstprodukte Kaffeesäure (CA), Catechol (Cat), 1,2,4-Trihydroxybenzol (THB), N-Methylpyridinium (NMP) und methylierte NMP-Analoga untersucht. Erfasste Parameter waren zellulärer ROS-Level, (oxidative) DNA-Schädigung und Proteinexpression der ARE-abhängigen Enzyme NQO1, g-GCL und GSR. Zusätzlich wurde die direkte antioxidative Aktivität mittels TEAC- und ORAC-Assay gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine radikalabfangende Eigenschaft aller Kaffeeextrakte mit Werten von 0,9-1,5 mM Trolox (TEAC) bzw. 2,5-2,8 mM Trolox (ORAC). Der zelluläre ROS-Level wurde in HT-29 Zellen durch die Extrakte AB, AC, RI und stark gerösteten AB 2 signifikant verringert. Eine konzentrationsabhängige und signifikante Induktion ARE- abhängiger Enzyme (NQO1, g-GCL und GSR) in HT-29 Zellen wurde durch den CQA-reichen AB 1 beobachtet, der NMP-reiche AB 2 war dagegen unwirksam. Von den untersuchten Kaffeeinhaltsstoffen zeigten nur die phenolischen Verbindungen 5-CQA und CA eine ausgeprägte zellfreie antioxidative Aktivität. Der zelluläre ROS-Level konnte durch 5-CQA verringert werden, dagegen waren methylierte NMP-Analoga in der Lage (oxidative) DNA-Schäden in Caco-2 Zellen zu reduzieren. 5-CQA induzierte wie leicht gerösteter AB 1 die Proteinexpression alle untersuchten Enzyme in HT-29 Zellen. Weiterhin wurde in zwei aufeinander folgenden humanen Interventionsstudien das antioxidative Potential unterschiedlicher Kaffeegetränke mit hohem Anteil an Antioxidantien charakterisiert; in der zweiten Studie wurde zusätzlich auf gewichtsregulierende Wirkung des Studienkaffees geprüft. Im Rahmen der ersten Pilotstudie, durchgeführt durch AG. Somoza (DFA Garching) wurde die Modulation von DNA-Schäden im Blut von Probanden nach Konsum zweier Kaffeegetränke erfasst, die reich an Chlorogensäuren oder an N-Methylpyridinium waren (Kaffeekonsum: 0,5 L pro Tag, 4 Wochen). Beide Kaffeegetränke bewirkten im Blut gesunder Probanden eine deutliche Abnahme oxidativer DNA-Schäden. In der zweiten Interventionsstudie nahmen 35 männliche Probanden nach einer vierwöchigen Wash-out Phase über vier Wochen täglich 750 ml eines Antioxidantien reichen Kaffees (580 mg/l CQAs; 71,7 mg/l NMP) auf, anschließend folgte eine vierwöchige Wash-out Phase. Zu Beginn der Studie und am Ende jeder Phase wurden Blutentnahmen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schäden, Glutathion (Gesamtglutathion tGSH, oxidiertes Glutathion GSSG) sowie Bioimpedanzanalysen zur Bestimmung der Körperzusammensetzung durchgeführt. Zusätzlich wurden Energie und Nährstoffaufnahme der Probanden erfasst. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Abnahme (oxidativer) DNA-Schäden (p < 0,001), Anstieg des tGSH-Spiegels (p<0,05) und des GSH-Status (Trend) und eine Erniedrigung des GSSG-Spiegels. Weiterhin wurde eine signifikante Abnahme von Körpergewicht und Körperfett der Probanden während der Kaffeeintervention im Vergleich zur beiden Wash-out Phasen beobachtet, welche vor allem bei Probanden mit BMI < 25 stärker ausgeprägt war. Die Verringerung der Energie- und Nährstoffaufnahme während der Kaffeephase weist auf eine Kaffeeabhängige beeinflussung der Sättigungsregulation hin. Zusammenfassend besitzt der Antioxidantien reiche Studienkaffee ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung sowie gewichtsregulierende Wirkung in gesunden Probanden. Aufgrund der von uns erhaltenen in vitro Daten kann die antioxidative Wirksamkeit zum Teil auf die untersuchten originären Kaffeeinhaltsstoffen (vor allem CQAs) und Röstprodukte zurückgeführt werden. Andere bisher nicht charakterisierte Sustanzen/Stoffgruppen tragen vermutlich ebenfalls zu der beobachteten Wirkung bei.
Neben dem Verzehr von Obst und Gemüse wird auch Fruchtsäften eine Bedeutung für die Prävention chronisch entzündlicher Darmerkrankungen und Dickdarmkrebs beigemessen. Neben der direkten antioxidativen Kapazität polyphenolischer Inhaltstoffe spielt vermutlich auch deren Einfluss auf die Expression redoxsensitiver Gene, wie z.B. der gamma-Glutamylcystein-Ligase (g-GCL) eine protektive Rolle. Die in-vitro Arbeiten an den Kolontumorzelllinien verfolgten das Ziel die antioxidative Wirksamkeit verschiedener Apfelsaftextrakte zu charakterisieren. Hierbei wurde der Einfluss der Aglyka Quercetin und Phloretin, der Inhaltsstoffe Chlorogensäure und Kaffeesäure, sowie der Apfelsaftextrakte AE02 /03 und AE05 auf die Transkription redoxsensitiver Zielgene in HT-29 und Caco-2 Zellen nach 6- und 24h-Inkubation mittels Real Time TaqMan PCR untersucht. Als Referenzverbindungen wurden Sulforaphan und Menadion eingesetzt. Die für den Glutathion-Redoxstatus relevanten ARE-abhängigen Gene GPX2 und GSR, sowie die Nrf2 Genexpression wurden in die Untersuchungen miteinbezogen. Die Ergebnisse zeigen u.a. charakteristische, zellspezifische Unterschiede in der Modulation der antioxidativen Genexpression, bei der sich die HT-29 Zellen vor allem im Hinblick auf die gewählte Inkubationszeit und Konzentration der untersuchten Testmaterialien als sensitiver erwiesen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines polyphenolreichen Smoothies im Hinblick auf Bioverfügbarkeit und antioxidative Wirksamkeit im menschlichen Darm. Die Interventionsstudie mit Ileostoma-Patienten ermöglichte es, Saftinhaltstoffe und Metabolite eines Smoothiees der Apfelsorte Winesap unmittelbar vor der Dickdarmpassage aus den Inhalten der Ileostomabeutel zu gewinnen und in-vitro auf antioxidative Wirksamkeit hin zu überprüfen. Hierbei konnten sowohl zellfrei (TEAC und ORAC Assay) als auch mit der humanen Kolonkarzinomzellinie HT29 ein antioxidatives Potenzial der Ileostoma-Beutelinhalte nachgewiesen werden. Die TEAC- und ORAC-Werte der Ileostoma-Proben zeigten einen deutlichen Anstieg mit einem Maximum bei 4h nach Saftverzehr. Im Vergleich zu den 0h- Ileostombeutel-Inhalten bewirkten die 2h- und 4h-Ileostoma-Beutelinhalte eine signifikanten Reduktion des TBH-induzierten ROS-Levels (DCF-Assay) nach 24h Inkubation in HT29-Zellen. Die Identifizierung als auch die quantitative Erfassung der in den Ileostoma-Proben enthaltenen polyphenolischen Inhaltsstoffe, sowie deren Abbauprodukte könnte Hinweise auf aktivitätsgeleitete Strukturen einzelner polyphenolischer Verbindungen geben. In einer Interventionsstudie an Ratten wurde der Einfluss unterschiedlich hergestellter Apfelsäfte (klarer/ trüber AS, Smoothie, im Vergleich zu einem polyphenolfreien Kontrollsaft) auf die Modulation ARE abhängiger Genexpression in Kolon und Leber männlicher SD-Ratten mittels duplex RT-PCR untersucht. Die aus der vorliegenden Interventionsstudie an Ratten gewonnen Ergebnisse, weisen auf eine Erhöhung der antioxidativen Abwehr durch polyphenolische Apfelsäfte hin. Die Induktion der redoxsensitiven Genexpression variierte hierbei in ihrer Stärke je nach Zielgewebe (Kolon > Leber) und Art des Saftes (trüber > klarer ~ Smoothie). Ergänzend zu den von Spormann et al. untersuchten Biomarkern wurden Genexpressionsuntersuchungen aus PBMCs von Hämodialyse-Patienten mittels Real Time TaqMan PCR durchgeführt. Hierbei wurde neben der Expression ausgewählter glutathionbezogener Gene (g-GCL, GPX1, GSR) auch die Nrf2 Transkription, sowie die Genexpression des inflammatorischen Enzyms COX-2 erfasst. Im Vergleich zur Woche 1 der run-in Phase zeigt sich nach Intervention mit rotem Mehrfruchtsaft ein deutlicher Anstieg der mRNA Expression in den meisten antioxidativen Zielgenen, die COX-2 Genexpression wurde dagegen während der Saftaufnahme leicht herunterreguliert.