Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
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Untersuchung der spektroskopischen und kinetischen Eigenschaften von Dihydroxysäure-Dehydratasen
(2019)
Eisen-Schwefel-Cluster sind wichtige Cofaktoren, die an der Redox- und Nicht-Redox-Katalyse beteiligt sind. Enzyme der Lyase-Familie wie Aconitase, Fumarase und DihydroxysäureDehydratase enthalten Cluster, die an drei Cystein-Liganden koordiniert sind. Das Eisenion, das an einen Nicht-Cysteinyl-Liganden koordiniert ist, wirkt als Lewis-Säure und interagiert mit dem Substrat über die Hydroxygruppe des dritten Kohlenstoffatoms und der Carboxygruppe. Das in dieser Arbeit untersuchte Enzym ist die Dihydroxysäure-Dehydratase (DHAD), welche an der Biosynthese der Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin beteiligt ist. In dieser Arbeit wurden die kinetischen und spektroskopischen Eigenschaften von DHAD aus Streptococcus mutans, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli untersucht. Zu diesem Zweck wurden ihre Gene kloniert und die Proteine in E. coli Zellen exprimiert. Nach der Proteinreinigung zeigten die UV-Vis-, ESR- und Mössbauer-Spektroskopie die Anwesenheit eines [2Fe-2S]2+-Clusters in der S. mutans DHAD, eines [4Fe-4S]2+-Cluster in E. coli DHAD und einer Mischung von [2Fe-2S]2+- und [4Fe-4S]2+ -Cluster in der S. cerevisiae DHAD. Darüber hinaus unterstützten die Ergebnisse der Sauerstoffstabilitätstests und des Eisen- und säurelabilen Sulfidgehalts die spektroskopischen Analysen. MössbauerSpektroskopie lieferte zusätzlich Information für das Vorhandensein eines nicht-cysteinyl-koordinierten Eisenions in den Clustern der S. mutans und in E. coli DHAD. Enzymaktivitätsmessungen mit dem Dinitrophenylhydrazin-Assay und den hier etablierten gekoppelten Assays mit NADH-abhängigen Ketoisovalerat-reduzierenden Dehydrogenasen wurden durchgeführt, um die spezifischen Aktivitäten und die kinetischen Parameter der DHAD zu bestimmen. Interaktionsstudien der S. mutans DHAD mit dem Substrat, dem Produkt, den substrat- und produktähnlichen Verbindungen mittels UV-Vis-, ESR-, Mössbauer- und FT-IR-Spektroskopie zeigten, dass nur das (2R)-Isomer des Substrats und 2-Ketosäuren (KIV, Kbut) mit dem Cluster der S. mutans DHAD interagierten. Das DHAD-Produkt (2-Ketoisovalerat) interagiert vermutlich über seine Enolform mit dem Cluster. Interessanterweise wurde starke Interaktion des Clusters mit der β-Mercaptogruppe von 3-Mercaptopropionat beobachtet. Diese Wechselwirkung wurde unabhängig durch Inhibitionsstudien verifiziert. Anschließend zeigte eine Gelfiltrationsanalyse die Reversibilität der Interaktionen. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit unser Wissen über die biotechnologisch wichtigen DHAD-Enzyme erweitert.
Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand in der Entwicklung effizienter und nachhaltiger Verfahren zur Addition von N-H Nukleophilen an terminale Alkine und für die Insertion von CO2 in die C-H Bindung terminaler Alkine.
Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Mechanismus der Ruthenium-katalysierten Addition von Amiden an terminale Alkine eingehend durch eine Kombination von Kontrollexperimenten, kinetischen Studien, spektroskopischen Untersuchungen und theoretischen Berechnungen untersucht. Zunächst wurden vier literaturbekannte Katalysezyklen identifiziert, die plausible Mechanismen für die Hydroamidierung terminaler Alkine darstellen. Aufbauend auf nachgewiesenen Elementarschritten chemisch verwandter Reaktionen wurde zusätzlich ein weiterer Mechanismus für die Hydroamidierung abgeleitet. Anschließend wurde eine Reihe von Kontrollexperimenten durchgeführt, mit deren Hilfe einzelne Elementarschritte der Katalysezyklen falsifiziert und somit Mechanismen ausgeschlossen werden konnten. Um herauszufinden, ob die Hydroamidierung mit dem einzig verbliebenen Mechanismus zutreffend beschrieben werden kann, wurden spektroskopische Studien durchgeführt. Diese Untersuchungen wurden vor, während und nach Hydroamidierungstestreaktionen durchgeführt, und auf diese Weise konnten zahlreiche postulierte Intermediate nachgewiesen und der verbleibende Katalysezyklus bekräftigt werden. Die in diesen mechanistischen Studien gewonnenen Erkenntnisse wurden zur Entwicklung einer neuen Katalysatorgeneration mit ausgesprochen hoher Selektivität für die Bildung wertvoller Z-Enamide und Z-Enimide genutzt. Das synthetische Potential wurde zudem durch die Darstellung der biologisch aktiven Naturstoffe Lansiumamid A und B, Lansamid I sowie Botryllamid C und E demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit gelang es, hocheffiziente Silber(I)/DMSO-katalysierte Methoden zur Carboxylierung terminaler Alkine mit CO2 bei Normaldruck zu entwickeln.
Nachhaltige Chemie beinhaltet die Nutzung stofflicher Ressourcen und deren Umwandlung ohne Schaden für zukünftige Generationen. Dabei hat sich insbesondere die Katalyse als nützliche Technologie etabliert, durch die Syntheserouten zu hochwertigen Produkten abgekürzt und dabei die CO2-Bilanz des Gesamtprozesses verbessert wird. Im Rahmen dieser Dissertation wurden nachhaltige, homogen-katalytische Prozesse zur Einbindung nachwachsender Rohstoffe in die chemische Wertschöpfungskette und zur abfallminimierten Synthese von Amiden und Peptiden entwickelt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die isomerisierende Metathese als Methode zur Valorisierung nachwachsender Rohstoffe etabliert. Mit einem bimetallischen Katalysatorsystem, bestehend aus dem Isomerisierungskatalysator [Pd(µ-Br)(tBu3P)]2 und NHC-basierten Ruthenium-Metathesekatalysatoren, werden Doppelbindungen ungesättigter Verbindungen kontinuierlich entlang der Kohlenwasserstoffkette verschoben und können gleichzeitig, ungeachtet ihrer Position, eine Metathese durchlaufen. Dies erlaubt die Umwandlung von zwei unterschiedlichen Olefinen in ein Gemisch mit homogener Produktverteilung und einstellbarer mittlerer Kettenlänge. Das synthetische Potential dieser Transformation wurde anhand der Darstellung von Dieselersatzkraftstoffen demonstriert, die vollständig auf erneuerbaren Ressourcen basieren und aufgrund ihres Siedeverhaltens in modernen Motoren in unverdünnter Form eingesetzt werden können. Der neu entwickelte Tandemprozess ermöglicht weiterhin die gezielte Kürzung olefinischer Seitenketten in Gegenwart von Ethen. Die isomerisierende Ethenolyse der natürlich vorkommenden Allylbenzole Eugenol, Allylanisol, Safrol und Methyleugenol wurde zur Synthese wertvoller Styrole mit komplexen Substitutionsmustern eingesetzt. Die isomerisierende Ethenolyse stellt außerdem die Schlüsseltechnologie zur Valorisierung von Cashew-Nussschalenöl dar. Ausgehend von dem bisher ungenutzten Abfallstoff wurde die Synthese der Tsetsefliegen-Lockstoffe 3-Ethyl- und 3-Propylphenol sowie des Polymervorläufers 3,3’-Hydroxystilben demonstriert.
Der zweite Teil dieser Doktorarbeit umfasste die rationale Entwicklung einer abfallminimierten und umweltfreundlichen Methode zur Synthese von Amiden aus Carbonsäuren und Aminen. Dazu wurde ein hocheffektives, luft- und wasserstabiles Ru(IV)-Katalysatorsystem identifiziert, das die Addition von Carbonsäuren an Alkine unter Bildung von Enolestern sowie die weitere Umsetzung dieser Aktivester mit Aminen zu Amiden vermittelt. Ein einstufiges Eintopf-Verfahren zur Synthese von Amiden, bei dem alle Reagenzien zu Beginn der Reaktion zugegeben werden, wurde unter Verwendung von Ethoxyacetylen als Aktivierungsreagenz entwickelt. Hierbei werden die Carbonsäuren in Gegenwart eines Amins intermediär in hochreaktive Ketenacetale überführt, die nach Aminolyse die entsprechenden Amide in sehr guten Ausbeuten liefern. Die Anwendungsbreite dieses milden Reaktionsprotokolls umfasst aliphatische und aromatische Carbonsäuren sowie N- und C terminal geschützten Aminosäuren.
Wissenschaftliche Studien deuten auf eine gesundheitsförderndes und gewichtsregulierendes Potential des Kaffees hin, welches vor allem mit dem hohen Gehalt an Antioxidantien in Verbindung gebracht wird. In dieser Arbeit wurden Kaffeeextrakte, -inhaltsstoffe sowie Kaffeegetränke hinsichtlich ihrer antioxidativen Wirksamkeit untersucht. In-vitro wurde die präventive Wirkung von Extrakten aus leicht (AB1), mittel (RI, AC, AB) und stark (AB 2) gerösteten Kaffees mit Markern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort in den Kolonkarzinomzelllinien HT-29 und Caco-2 charakterisiert. Vergleichend wurden die ausgewählten originären Kaffeeinhaltstoffe 5-Caffeoylchinasäure (5-CQA) und Trigonellin (TRIG) sowie die Röstprodukte Kaffeesäure (CA), Catechol (Cat), 1,2,4-Trihydroxybenzol (THB), N-Methylpyridinium (NMP) und methylierte NMP-Analoga untersucht. Erfasste Parameter waren zellulärer ROS-Level, (oxidative) DNA-Schädigung und Proteinexpression der ARE-abhängigen Enzyme NQO1, g-GCL und GSR. Zusätzlich wurde die direkte antioxidative Aktivität mittels TEAC- und ORAC-Assay gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine radikalabfangende Eigenschaft aller Kaffeeextrakte mit Werten von 0,9-1,5 mM Trolox (TEAC) bzw. 2,5-2,8 mM Trolox (ORAC). Der zelluläre ROS-Level wurde in HT-29 Zellen durch die Extrakte AB, AC, RI und stark gerösteten AB 2 signifikant verringert. Eine konzentrationsabhängige und signifikante Induktion ARE- abhängiger Enzyme (NQO1, g-GCL und GSR) in HT-29 Zellen wurde durch den CQA-reichen AB 1 beobachtet, der NMP-reiche AB 2 war dagegen unwirksam. Von den untersuchten Kaffeeinhaltsstoffen zeigten nur die phenolischen Verbindungen 5-CQA und CA eine ausgeprägte zellfreie antioxidative Aktivität. Der zelluläre ROS-Level konnte durch 5-CQA verringert werden, dagegen waren methylierte NMP-Analoga in der Lage (oxidative) DNA-Schäden in Caco-2 Zellen zu reduzieren. 5-CQA induzierte wie leicht gerösteter AB 1 die Proteinexpression alle untersuchten Enzyme in HT-29 Zellen. Weiterhin wurde in zwei aufeinander folgenden humanen Interventionsstudien das antioxidative Potential unterschiedlicher Kaffeegetränke mit hohem Anteil an Antioxidantien charakterisiert; in der zweiten Studie wurde zusätzlich auf gewichtsregulierende Wirkung des Studienkaffees geprüft. Im Rahmen der ersten Pilotstudie, durchgeführt durch AG. Somoza (DFA Garching) wurde die Modulation von DNA-Schäden im Blut von Probanden nach Konsum zweier Kaffeegetränke erfasst, die reich an Chlorogensäuren oder an N-Methylpyridinium waren (Kaffeekonsum: 0,5 L pro Tag, 4 Wochen). Beide Kaffeegetränke bewirkten im Blut gesunder Probanden eine deutliche Abnahme oxidativer DNA-Schäden. In der zweiten Interventionsstudie nahmen 35 männliche Probanden nach einer vierwöchigen Wash-out Phase über vier Wochen täglich 750 ml eines Antioxidantien reichen Kaffees (580 mg/l CQAs; 71,7 mg/l NMP) auf, anschließend folgte eine vierwöchige Wash-out Phase. Zu Beginn der Studie und am Ende jeder Phase wurden Blutentnahmen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schäden, Glutathion (Gesamtglutathion tGSH, oxidiertes Glutathion GSSG) sowie Bioimpedanzanalysen zur Bestimmung der Körperzusammensetzung durchgeführt. Zusätzlich wurden Energie und Nährstoffaufnahme der Probanden erfasst. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Abnahme (oxidativer) DNA-Schäden (p < 0,001), Anstieg des tGSH-Spiegels (p<0,05) und des GSH-Status (Trend) und eine Erniedrigung des GSSG-Spiegels. Weiterhin wurde eine signifikante Abnahme von Körpergewicht und Körperfett der Probanden während der Kaffeeintervention im Vergleich zur beiden Wash-out Phasen beobachtet, welche vor allem bei Probanden mit BMI < 25 stärker ausgeprägt war. Die Verringerung der Energie- und Nährstoffaufnahme während der Kaffeephase weist auf eine Kaffeeabhängige beeinflussung der Sättigungsregulation hin. Zusammenfassend besitzt der Antioxidantien reiche Studienkaffee ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung sowie gewichtsregulierende Wirkung in gesunden Probanden. Aufgrund der von uns erhaltenen in vitro Daten kann die antioxidative Wirksamkeit zum Teil auf die untersuchten originären Kaffeeinhaltsstoffen (vor allem CQAs) und Röstprodukte zurückgeführt werden. Andere bisher nicht charakterisierte Sustanzen/Stoffgruppen tragen vermutlich ebenfalls zu der beobachteten Wirkung bei.
Das homotetramere, cytosolische Chaperon SecB spielt eine entscheidende Rolle in der Proteintranslokation von Escherichia coli beim Transport von Proteinen über die Cytoplasmamembran in den periplasmatischen Raum der Zelle. Es bindet währenddessen naszierende Polypeptide, hält diese in einem entfalteten, translokationskompeteten Zustand und transportiert sie zur Translokationsmaschinerie an die Cytoplasmamembran. In vitro wechselwirkt SecB mit einer Reihe von entfalteten Proteinen, beispielsweise dem Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor (BPTI) oder in vivo mit dem Vorläuferprotein des Maltosebindungsproteins (preMBP). Frühere Untersuchungen lieferten Hinweise auf eine Konformationsänderung des Chaperons hervorgerufen durch eine Substratbindung des Modellsubstrats BPTI. Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf Untersuchungen zur Komplexbildung zwischen dem natürlichen Substrat preMBP und SecB sowie auf weiteren Untersuchungen zur Konformationsänderung hervorgerufen durch die Substratbindung.
Um die Aufreinigung der Chaperone zeiteffizienter zu gestalten und die Reinheit weiter zu steigern, erfolgte eine Umklonierung der verschiedenen SecB-Gene in pET20b(+)-Expressionsvektoren. Im Zuge dieser Einklonierung wurden die SecB-Sequenzen mit einer Thrombinschnittstelle und einem His-Tag fusioniert. Weiterhin wurden zwei neue SecB-Mutanten (C109 und C113) generiert.
Die Untersuchung des preMBP-SecB-Komplexes mit Hilfe der HPLC zeigte, dass 2 M GdnHCl ausreichend ist, um das preMBP zu entfalten und entfaltetes preMBP schneller von der Säule eluiert als rückgefaltetes. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Rückfaltung von preMBP durch Verringerung der GdnHCl-Konzentration von 3 M auf 0,1 M innerhalb weniger Sekunden abgeschlossen ist. Die Komplexbildung erfolgte nur, wenn das Chaperon vorlegt wurde und preMBP anschließend hinzugegeben wurde. Die anschließende Analyse zeigte eine Koelution beider Proteine.
Für die EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurden die SecB-Mutanten mit den Spinlabeln MTS und IOPI gelabelt. Die cw-EPR-Messungen bei Raumtemperatur zeigten, dass die Beweglichkeit des Spinlabels am Wildtyp-Protein deutlich stärker eingeschränkt ist als an Aminosäureposition 90. Die cw-EPR-Messungen am Wildtyp-Chaperon bei 180 K gaben erste Hinweise darauf, dass sich benachbarte Spinlabel in einem Abstand von weniger als 20 Å befinden. Der Vergleich mit den berechneten Abstandsdaten aus dem Molecular Modeling zeigte, dass es sich bei den gemessenen Entfernungen um die kurzen Abstände zwischen den Cysteinen benachbarter Untereinheiten handeln muss. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass sich das Spinlabel an Aminosäureposition 312 des preMBPs in einer Entfernung von maximal 20 Å befindet.
Die DEER-Messungen ergaben Abstände zwischen den Aminosäurepositionen 97 am SecB von 19,3 Å für die kurzen Entfernungen zwischen direkt benachbarten Untereinheiten und 51,2 Å für die langen Entfernungen. Durch die Substratbindung von BPTI an das Chaperon konnte eine doppelscherenartige Aufweitung zwischen den Dimeren im Bereich der Substratbindungstasche belegt werden. Auch die Abstandsdaten von Aminosäureposition 90 bestätigten die Aufweitung der Bindungstasche.
Cyclo-(PhAs)6 als Edukt für Übergangsmetallcyclopentadienyl-Komplexe mit Asn- und (PhAs)n-Liganden
(2002)
In der Chemie der (RAs)n-Heterocyclen, R = Alkyl, Aryl, hat sich cyclo-(PhAs)6 als besonders wertvolles Ausgangsmaterial für Komplexe mit Asn- bzw. (PhAs)n-Liganden bewährt. Die Cothermolyse von Hexaphenylcyclohexaarsan mit verschiedenen Übergangsmetallcyclopentadienyl-Komplexen liefert eine Reihe von neuartigen Verbindungen mit substituentenfreien As-Liganden und substituentenhaltigen As-Liganden, welche zum Teil in guten Ausbeuten hergestellt und in einigen Fällen durch eine Röntgenstrukturanalyse charakterisiert wurden. Bei den Komplexen mit As1- und As2-Liganden verdienen besondere Beachtung das dreiecksdodekaedrische [{Cp=Fe}4As4] sowie das aus der trigonalen Bipyramide bestehende [{CpRCo}3(µ3-As)2], dessen Spitzen von jeweils einem dreibindigen Arsenatom besetzt sind. Bei [{Cp-Co}3(µ3-As)2] ist das freie Elektronenpaar am Arsen noch zusätzlich durch ein {M(CO)5}-Fragment (M = Mo, W) komplexierbar ([{Cp-Co}3{(µ4-As)M(CO)5}2]). Verbindungen mit substituentenhaltigen As-Liganden sind in der Literatur nur vereinzelt beschrieben. Bei [{Cp=Rh}3(µ-CO)(AsPh2)As] wurde offensichtlich eine PhAs-Gruppe unter Ph-Wanderung in einen Ph2As-Liganden umgewandelt. Bemerkenswert ist der PhAs-Ligand in [{Cp=Rh(CO)}2(AsPh)W(CO)5], dessen freies Elektronenpaar noch zusätzlich an ein {W(CO)5}-Fragment koordiniert ist. In [{Cp=Rh}3(Rh(CO)2)(AsPh)(AsO)] sind ein PhAs- und AsO-Ligand realisiert.
Im Rahmen der Promotion wurden zwei Projekte bearbeitet, die sich mit der Darstellung und Untersuchung Cyclopeptid-basierter Derivate zur Erkennung von Anionen beschäftigten.
Dabei wurde im ersten Projekt der Arbeit eine neue, modulare Synthesestrategie zur Darstellung von dreifach verbrückten Bis(cyclopeptiden) entwickelt, die auf der Verwendung eines Templats und der Ausbildung von Amidbindungen zwischen den Untereinheiten basiert. Mit Hilfe dieser Methode gelang es ein Käfig-artiges Bis(cyclopeptid) mit Diglycolsäure als Linker zwischen den beiden Cyclopeptidringen darzustellen und dieses hinsichtlich seiner Anionenaffinität zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass Sulfat von diesem Rezeptor mit der höchsten bisher gemessenen Bindungskonstante Amid-verbrückter Bis(cyclopeptide) in kompetitiven, wässrigen Lösungsmittelgemischen gebunden wird. Ein Vergleich mit dem ebenfalls synthetisierten einfach verbrückten Analogon und weiteren, bekannten Vertretern dieser Rezeptorklasse erlaubte darüber hinaus eine Korrelation zwischen der Anzahl und Struktur der Linker und der daraus resultierenden Anionenaffinität. Dabei wurde deutlich, dass eine Erhöhung der Linkeranzahl einen signifikanten Anstieg der Anionenaffinität bewirkte, wenngleich diese durch weitere Optimierung der Linkerstruktur potenziell noch weiter verbessert werden kann. Dies sollte im Fokus zukünftiger Arbeiten stehen, wobei auf Basis der erarbeiteten Synthesestrategie weitere Derivate dreifach verbrückter Bis(cyclopeptide) einfach zugänglich sein sollten.
Im zweiten Projekt der Arbeit wurde eine optische Sonde entwickelt, die einen einfachen Nachweis von Anionen in Wasser ermöglicht. Dazu wurde mittels eines zweistufigen Verfahrens ein gemischt-funktionalisierter Goldnanopartikel dargestellt, auf dessen Oberfläche solubilisierende Triethylengycol-haltige Liganden und funktionelle Cyclopeptid-haltige Liganden immobilisiert wurden. Die so erhaltenen Goldnanopartikel waren homogen und in Wasser löslich, aggregierten aber, sobald der Lösung Natriumsulfat zugesetzt wurde. Sie erlaubten entsprechend den Sulfat-Nachweis mit bloßem Auge, da die Nanopartikel-Aggregation zu einer Entfärbung der ursprünglich roten Lösung und der Bildung eines Niederschlags führte. Keines von acht weiteren getesteten Anionen hatte einen analogen Effekt, sodass sich der Nachweis von Sulfat als überaus selektiv erwies. Somit wurde ein vielversprechendes Konzept für die Entwicklung optischer Sonden für Anionen entwickelt, das in zukünftigen Arbeiten auf den Nachweis anderer Anionen übertragen werden sollte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Eignung funktionalisierter acyclischer Cucurbiturile (aCB) als niedermolekulare Scavenger für V-Stoffe evaluiert. Hierfür wurden Synthesen erarbeitet, die drei funktionalisierbare Naphthalin-basierte aCB-Diazide zugänglich machen. Diese wurden mithilfe von CuAAC-Reaktionen in dreizehn neue potentielle V-Stoff-Scavenger überführt, deren Hydroxamsäuregruppen die Entgiftung eines im Hohlraum des betreffenden aCB gebundenen V-Stoffs induzieren sollen, wobei das aktivste aCB Derivat den Kampfstoff VX mit einer Halbwertszeit von t1/2 = 31 min entgiftet und damit eine 10fach geringere Aktivität als der bisher aktivste VX-Scavenger besitzt. Untersuchungen deuten darauf hin, dass eine unvorteilhafte Einlagerungsgeometrie der V Stoffe im Hohlraum der aCB maßgeblich für die geringen Entgiftungsaktivitäten verantwortlich sein könnte. Diese führt dazu, dass das in der Kavität befindliche Phosphoratom des V-Stoffs nicht gut mit der Hydroxamsäuregruppe reagieren kann.
Außerdem wurde die Synthese Triptycen-basierter aCB verfolgt, die vier Sulfonatgruppen und eine näher am Hohlraum angeordnete funktionelle Gruppe enthalten. In diesem Zusammenhang wurden vier neue, in 9-Position funktionalisierte Triptycenderivate ausgehend von substituierten Anthracenderivaten dargestellt. Versuche, ausgehend von diesen Triptycenen aCB darzustellen, blieben erfolglos. Das Ausbleiben der Reaktion ist wahrscheinlich auf den sterischen Anspruch und die Reaktivität der Substituenten an den Brückenkopfatomen zurückzuführen. Unter den für die Kupplung benötigten Reaktionsbedingungen wurde außerdem die Acylierung in den für die aCB-Bildung benötigten Positionen beobachtet, die die Bildung des gewünschten Produkts verhindert.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cucurbiturile wahrscheinlich keine geeignete Basis für V-Stoff-Scavenger darstellen. Neben den Schwierigkeiten bei der Synthese Triptycen-basierter potentieller Scavenger zeigt sich, dass die Komplexbildung durch aCB den gebundenen V-Stoff eher schützt als ihn für die Reaktion mit einer nucleophilen Gruppe vorzuorganisieren. Die Resultate dieser Arbeiten verdeutlichen, wie wichtig die richtige Positionierung des Phosphorrests des OPs für eine effektive Entgiftung ist.
Lithiumphenylacetylid führte zu einem Halbsandwichkomplex unter Austausch der beiden verbrückenden Bromide gegen Phenylacetylide. Diese neue Halbsandwichverbindung wurde mit Röntgenabsorptionsspektroskopie untersucht und charakterisiert.
Um substituierte Cyclopentadienylliganden anhand ihrer Sperrigkeit charakterisieren zu können, wurden als Maß für den sterischen Anspruch die beiden Kegelwinkel Θ und Ω in Anlehnung an Tolman eingeführt. Als Modellsystem wurden in einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Tamm (TU Braunschweig) Cycloheptatrienyl-Zirconium-Komplexe des Typs \([(η^7-C_7H_7)Zr(C_5R_5)]\) ausgewählt, da diese die an ein Modellsystem gestellten Anforderungen erfüllen. Dadurch konnten etwa 20 neue Cycloheptatrienyl-Cyclopentadienyl-Zirconium-Komplexe erhalten werden, bei welchen anhand von Festkörperstrukturen oder DFT-Berechnungen der sterische Anspruch der substituierten Cyclopentadienylliganden ermittelt wurde.
Basierend auf sehr reaktiven Cyclopentadienyl-Eisen-σ-Arylkomplexen konnten zwei unterschiedliche Reaktionen untersucht werden. Zum einen wurde die von Wallasch beobachtete Oxidation von \(Cp'''Fe(II)(σ-Mes)\) \((Cp''' = C_5H_2tBu_3; Mes = C_6H_3-2,4,6-Me_3)\) mit \(PdCl_2\) zu dem neuartigen Komplex \(Cp'''Fe(III)(σ-Mes)Cl\) weiter untersucht, um diese Substanzklasse kennenzulernen. Dabei erwies sich Hexachlorethan als wesentlich günstigeres Oxidationsmittel, mit dessen Hilfe die Verbindungen \(^4CpFe(III)(σ-Mes)Cl,\) \(^4CpFe(III)(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)Cl\) und \(^5CpFe(III)(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)Cl\) synthetisiert und charakterisiert werden konnten.
Auch die von Weismann beobachtete σ/π-Umlagerungsreaktion von \(^5CpFe(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)\) mit Trimethylaluminium zu \(^5CpFe(π-C_6H_3-2,6-iPr_2-AlMe_3)\) wurde näher untersucht. Dazu wurde \(^4CpFe(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)\) mit \(AlR_3\) (R = Me, Et, Pr) umgesetzt, um die entsprechenden Umlagerungsprodukte herzustellen. Diese konnten bei der Umsetzung mit \(AlMe_3\) auch erhalten werden, allerdings zeigten sich bei der Reaktion mit \(AlEt_3\) und \(AlPr_3\) unerwartete Reaktionsprodukte. Durch einen Bromid-Alkyl-Austausch wurden die Komplexe \(^4CpFe(π-C_6H_3-2,6-iPr_2-AlEt_2Br)\) und \(^4CpFe(π-C_6H_3-2,6-iPr_2-AlPr_2Br)\) gebildet. Zusätzlich konnten bei der Umlagerung mit \(AlEt_3\) vier weitere Neben- bzw. Folgeprodukte beobachtet werden. Eines der Folgeprodukte ist der Butinkomplex \((^4CpFe)_2(μ,η^2:η^2-but-2-in)\), der vermutlich durch eine Kupplung zweier Ethylgruppen und Dehydrierung gebildet wird. Reaktionen von \([^4CpFe(μ-Br)]_2\) oder \(^4CpFe(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)\) mit Ethylmagnesiumbromid ergaben den gleichen Komplex. Für die Entstehung der unterschiedlichen Produkte bei der Reaktion von \(^4CpFe(σ-C_6H_3-2,6-iPr_2)\) mit \(AlEt_3\) wurde ein Mechanismus entwickelt und dieser anhand der gewonnenen Erkenntnisse belegt.
Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) stellen eine Gruppe von möglichen Kanzerogenen dar, die ihre mutagene und kanzerogene Wirkung erst nach einer zweistufigen biologischen Aktivierung zum Dihydrodiolepoxid entfalten. Der ubiquitär in der Umwelt vorkommende PAK Benzo[c]phenanthren ist in Nagersystemen in vitro und in vivo nur schwach biologisch aktiv, während die korrespondierenden Fjord-Region-B[c]PH-3,4-Dihydrodiol-1,2-Epoxide zu den am stärksten kanzerogenen PAK-Dihydrodiolepoxiden gehören. Die geringe Bildung von B[c]PH-3,4-DH als Vorstufe der B[c]PH-3,4-DH-1,2-Epoxide im Nager wird für die geringe biologische Aktivität von B[c]PH verantwortlich gemacht. Bisher waren nur wenige Daten zur Beurteilung der Aktivierungskapazität in menschlichem Gewebe verfügbar. In dieser Studie konnte erstmals eindeutig gezeigt werden, daß Gewebepräparationen aus Humanleber B[c]PH effizient zu genotoxischen und mutagenen Metaboliten aktivieren. Im Gegensatz zu Leberpräparationen von Ratte und Schwein, in denen mit der bevorzugten Bildung des B[c]PH-5,6-DH detoxifizierende Metabolismuswege dominieren, wird in humanen Leberpräparationen bevorzugt B[c]PH-3,4-DH als Vorläuferverbindung der ultimal kanzerogenen B[c]PH-3,4-DH-1,2-Epoxide gebildet. Von den in der menschlichen Leber vorhandenen Cytochrom P450-Enzymen erwies sich CYP 1A2 als hauptverantwortlich für die metabolische Aktivierung von B[c]PH. CYP 3A4 scheint für die Bildung von B[c]PH-5,6-DH mitverantwortlich zu sein. Beide Isoenzyme werden in der Leber stark exprimiert und besitzen eine Schlüsselfunktion bei der PAK-Aktivierung. Im Gegensatz zu humanen Lebermikrosomen erwiesen sich humane Lungenmikrosomen im wesentlichen als inaktiv. Die einzige aktive humane Lungenprobe generierte neben dem überwiegenden Metaboliten B[c]PH-5,6-DH auch bedeutende Anteile B[c]PH-3,4-DH. Studien mit CYP 450-Inhibitoren belegen eine Bedeutung von CYP 1A1 für die Aktivierung in der menschlichen Lunge, welches durch Zigarettenrauch induzierbar ist. Auch das extrahepatisch vorkommende CYP 1B1, welches vor allem in der Niere, dem Uterus und der Brustdrüse vorkommt, metabolisierte B[c]PH effektiv. Auch der zweite Schritt der Aktivierungskaskade wurde untersucht. B[c]PH-3,4-DH konnte durch humane Lebergewebepräparationen zu genotoxischen Metaboliten aktiviert werden. Die induzierte Genotoxizität war vergleichbar mit der des kanzerogenen B[a]P-7,8-DH. CYP 3A4 konnte als hauptverantwortlich für die Aktivierung identifiziert werden. Auch für humanes CYP 1B1 ist B[c]PH-3,4-DH ein gutes Substrat. Im Gegensatz dazu induzierte B[c]PH-5,6-DH nur geringe Genotoxizität. Nach Aktivierung in V79-Säugerzellen, die humanes CYP 3A4 exprimieren, wirkte B[c]PH-3,4-DH mutagen, vergleichbar mit B[a]P-7,8-DH. Schwache Mutagenität konnte auch für B[c]PH-5,6-DH nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden die Fjord-Region-Verbindung Dibenzo[a,l]pyren-11,12-Dihydrodiol (DB[a,l]P-11,12-DH), Benzo[j]fluoranthen-9,10-Dihydrodiol (B[j]F-9,10-DH), und Fluoranthen-2,3-Dihydrodiol (FLU-2,3-DH) untersucht. DB[a,l]P-11,12-DH war im Genotoxizitäts- sowie Mutagenitätstest am stärksten aktiv und induzierte 10-fach mehr HPRT-Mutationen als B[c]PH-3,4-DH und B[a]P-7,8-DH. B[j]F-9,10-DH zeigte nur im Genotoxizitätstest schwache Aktivität, während FLU-2,3-DH in beiden Systemen inaktiv war. Humanes CYP 3A4 und zu geringerem Ausmaß CYP 1A2 konnten als hauptverantwortlich für die Aktivierung von DB[a,l]P-11,12-DH identifiziert werden. Somit konnte diese Studie zeigen, daß B[c]PH durch CYP 450-Enzyme in humanem Gewebe zu genotoxischen und mutagenen Verbindungen aktiviert werden kann. Im Tierexperiment ermittelte Daten haben dagegen eine vorrangige Metabolisierung zu wenig mutagenen Metaboliten ergeben. Sie korrelieren mit dem Befund des geringen kanzerogenen Potentials im Tierexperiment. Im Gegensatz dazu wird B[c]PH in humanen Gewebepräparationen effizient zu mutagenen Endprodukten aktiviert. Die Ergebnisse zeigen, daß für die Risikobewertung wesentliche Unterschiede beim B[c]PH-Metabolismus zwischen Mensch und Nager bestehen und die Ratte im Falle von B[c]PH kein prädiktives Modell für die Biotransformation beim Menschen darstellt. Es konnte gezeigt werden, daß für die Aktivierung von B[c]PH in menschlichem Lebergewebe eine Kombination des induzierbaren CYP 1A2 (1. Aktivierungsschritt) und des Hauptenzyms der Humanleber CYP 3A4 (2. Aktivierungsschritt) für eine effiziente Aktivierung verantwortlich ist. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, daß B[c]PH eine Bedeutung für die Entstehung von Krebs beim Menschen besitzt.