Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Das antioxidative Potenzial eines roten Mehrfruchtsaftes mit hohem Anthocyan-/Polyphenolanteil wurde in zwei humanen Interventionsstudien mit Biomarkern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort charakterisiert. Ergänzend wurden ein Mehrfruchtsaftextrakt (ME) und ausgewählte potentiell antioxidativ wirksame Mehrfruchtsaftinhaltsstoffe (Anthocyane) in in vitro-Experimenten untersucht. In einer Interventionsstudie nahmen 18 männliche Probanden nach einer 3-wöchigen Run-in-Phase über vier Wochen täglich 700 mL eines anthocyanreichen Mischfruchtsaftes (TEAC 19,1 mmol/L Trolox) auf. Anschließend folgte eine 3-wöchige Wash-out-Phase ohne Saftaufnahme. Neun der 18 Probanden nahmen zusätzlich an einer zweiten Interventionsstudie mit identischem Design teil, jedoch unter Verwendung eines Kontrollsaftes, in dem die phenolische Fraktion weitgehend technologisch entfernt wurde. Wöchentliche wurde Blut entnommen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schädigung, Lipidperoxidationsprodukte Malondialdehyd, Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen und Isoprostane (Urin), Glutathionspiegel/-status und DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors NFkappaB. Ergänzend wurden die Konzentrationen der Carotinoide und des alpha-Tocopherols in Plasma bestimmt. In den in vitro-Experimenten kam ein zweistufiges Inkubationsprotokoll in humanen Blut- bzw. Kolonzelllinien (Jurkat, Caco-2) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h bzw. 1 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Untersucht wurde neben der zellfreien Bestimmung der antioxidativen Kapazität (TEAC), die Modulation (oxidativer) DNA-Schädigung und des ROS-Levels in der Zelle. Die Ergebnisse der Interventionsstudie mit Mehrfruchtsaft zeigten eine signifikante Abnahme oxidativer DNA-Schäden (p< 0,0005), Zunahme des tGSH-Spiegels (p< 0,0005) und Anstieg des Glutathionstatus (p< 0,05) während der 4-wöchigen Saftaufnahme im Vergleich zu den 3-wöchigen Run-in-/Wash-out-Phasen. Eine signifikante Abnahme der Lipidperoxidation dagegen wurde nicht beobachtet. Es zeigte sich lediglich eine deutliche Tendenz zu einer Abnahme der Isoprostangehalte während der Saftaufnahme. Eine Verringerung der DNA-Bindungsaktivität von NFkappaB durch Saft war nicht nachweisbar. Die Plasmagehalte der Carotinoide und des alpha-Tocopherols, als mögliche und bekanntermaßen antioxidativ wirksame Substanzen, blieben während aller Interventionsphasen unverändert. Für die beobachteten protektiven Effekte scheinen die phenolischen Substanzen des Mehrfruchtsaftes verantwortlich zu sein, da in der Studie mit Kontrollsaft keine Reduktion von oxidativen Schäden nachgewiesen werden konnte. Der ME zeigte eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (4,64 mM Trolox) im zellfreien Testsystem. Der zelluläre ROS-Level wurde in vitro durch den Extrakt (bei 100-250 µg/mL) signifikant verringert (p< 0,05). Oxidative DNA-Schäden in Jurkat-/Caco-2-Zellen wurden durch den Extrakt nicht signifikant vermindert; es zeigte sich lediglich die Tendenz einer protektiven Wirkung (bei 10 µg/mL). Von den vergleichend in Jurkat-Zellen getesteten Anthocyanidinen zeigten Malvidin und Delphinidin nach 24 h Inkubation kein Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden. Bei einstündiger Antioxidansbehandlung dagegen, konnte ein einheitlicher Trend einer protektiven Modulation (bei 10-100 µM) beobachtet werden. Zusammenfassend besitzt der flavonoid/polyphenolreiche rote Mischfruchtsaft ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung in gesunden Probanden. Dieses geht, begründet aus den Ergebnissen der Saft-/Kontrollsaftstudie, vermutlich auf die phenolische Fraktion des Saftes zurück. Aufgrund der in vitro erhaltenen Daten kann die antioxidative Wirksamkeit jedoch nicht maßgeblich auf die untersuchte Substanzgruppe der Anthocyane zurückgeführt werden. Dies legt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/Stoffgruppen einen Beitrag zu der antioxidativen Wirksamkeit leisten.
In this study, 27 marine bacteria were screened for production of bioactive metabolites. Two strains from the surface of the soft coral Sinularia polydactyla, collected from the Red Sea, and three strains from different habitats in the North Sea were selected as a promising candidates for isolation of antimicrobial substances. A total of 50 compounds were isolated from the selected bacterial strains. From these metabolites 25 substances were known from natural sources, 10 substances were known as synthetic chemical and herein are reported as new natural products, and 13 metabolites are new. Two substances are still under elucidation. All new compounds were chemically and biologically characterized. Pseudoalteromonas sp. T268 produced simple phenol and oxindole derivatives. Production of homogentisic acid and WZ 268S-6 from this bacteria was affected by the salinity stress. WZ 268S-6 shows antimicrobial and cytotoxic activities. Its target is still unclear. Isolation of isatin from this strain points out for the possibility of using this substance as a chemotaxonomical marker for Alteromonas-like bacteria. A large number of nitro-substituted aromatic compounds were isolated from both Salegentibacter sp. T436 and Vibrio sp. WMBA1-4. They may be derived from metabolism of phenylalanine or tyrosine. From Salegentibacter sp. T436, 24 compounds were isolated, of which four compounds are new and six compounds were known as synthetic chemicals. WZ 436S-16 (dinitro-β-styrene) is the most potent antimicrobial and cytotoxic compound. It inhibits the oxygen uptake by N. coryli and causes apoptosis in the human promyelocytic leukaemia (HL-60 cells). From Vibrio sp. WMBA1-4, 13 new alkaloids were isolated, of which four were known as synthetic products and herein are reported as new substances from natural sources. The majority of these compounds show antimicrobial and cytotoxic activities. The cytotoxic activity of WMB4S-11 against the mouse lymphocytic leukaemia (L1210 cells) is due to the inhibition in the protein biosynthesis, while the remaining cytotoxic alkaloids have no effect on the synthesis of macromolecules in this cell line. The antibacterial activity of WMB4S-2, -11, -12, -13 and the antifungal activity of WMB4S-9 are not due to the inhibition in the macromolecules biosynthesis or in the oxygen uptake by the microorganisms. The biological activity of these nitro-aromatic compounds from Salegentibacter sp. T436 and Vibrio sp. WMBA1-4 is influenced by the presence of a nitro group and its position in respect to the hydroxyl group, number of the nitro groups, and the type of substitutions on the side chain. In diaryl-maleimide derivatives, types and position of substitution on the aryl rings, on the maleimide moity, and the hydrophobicity of the aryl ring itself lead to variations in the extent of the bioactivity of these derivatives. This is the first time that vibrindole (WMB4S-14) and turbomycin B or its noncationic form (WMB4S-15), isolated from Vibrio sp., are reported as cytotoxic compounds. WMB4S-15 inhibits the biosynthesis of macromolecules in L1210 cells. The structural similarity between some of the metabolites in this study and previously reported compounds from sponges, ascidians, and bryozoan indicates that the microbial origin of these compounds must be considered.
Durch vorangegangene Arbeiten wurden transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die eine verringerte Aktivität des plastidären ATP/ADP Transporters aufweisen (NTT-antisense). Die Knollen dieser Pflanzen zeigen nicht nur veränderte Gehalte an Primärmetaboliten sondern auch eine erhöhte Pathogen-Resistenz, zum Beispiel gegen den bakteriellen Krankheitserreger Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). In diesem Zusammenhang deuten neuere Veröffentlichungen auf eine Bedeutung von Transportproteinen für Wirt-Pathogen Wechselwirkungen hin. Im Zuge dieser Arbeit konnte durch die Herstellung eines Systems zur gezielten Erzeugung von Eca „K.O.“-Mutanten die Bedeutung von ausgewählten Sequenzen, welche für Transportproteine kodieren, analysiert werden. Hierbei zeigte sich, dass im Bezug auf die Virulenz von Eca, sowohl der Prolin- als auch der d-Galaktonattransport nur von untergeordneter Bedeutung ist. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings der Karbonsäuremetabolismus und -transport von Eca als zentrales Element in der Entfaltung maximaler bakterieller Virulenz erkannt. Hierbei wurde das Cit1-Protein als hoch-affiner Citrattransporter, welcher über die bakterielle pmf energetisiert wird, identifiziert. Dieses Protein ist für ein Wachstum von Eca auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle notwendig und essentiell zur Etablierung einer vollständigen Pathogenese auf Kartoffelknollenscheibchen. So weisen Eca cit1 „K.O.“-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp Zellen nicht nur eine geringere pektolytische Aktivität und Gewebemazeration, sondern auch ein reduziertes in planta Wachstum, auf. Des Weiteren wurde ermittelt, dass sich NTT-antisense Gewebe nicht nur durch eine erhöhte Pathogen-Resistenz auszeichnet, sondern auch erniedrigte Citratgehalte aufweist. Analog führte eine artifizielle Erhöhung des Citratgehaltes durch Infiltration von Knollengewebe zu einer deutlich erhöhten Gewebemazeration durch Eca sowie einer verringerten Akkumulation von Abwehrrelevanten pflanzlichen Gentranskripten (PR-Gene). Weitere untersuchte Eca-Mutanten belegten, dass im gemeinsamen Wirken mit anderen enzymatischen Komponenten, Citrat ein ambivalentes Molekül für pflanzliche Resistenz und bakterielle Virulenz ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Transportproteine nicht nur für die Virulenz von Eca, sondern auch für phytopathogene Pilze wie Magnaporthe grisea, von Bedeutung sind. So konnte durch die Kooperation mit der AG Thines (IBWF) das Genprodukt eines bei Pathogenese induzierten Genes (rig2), biochemisch charakterisiert werden. Hierbei wurde mittels Komplementation einer Hefemutante (22∆8AA) nachgewiesen, dass es sich bei diesem Protein um einen Prolin-Transporter handelt. Diese Arbeit zeigt, dass Transportproteine als ein wichtiges Element in Wirt-Pathogen Beziehungen wirken können und eine Charakterisierung solcher Proteine zum Verständnis dieser Wechselwirkungen unerlässlich ist.
Biological Soil Crusts (BSCs), composed of lichens, mosses, green algae, microfungi and cyanobacteria are an ecological important part of the perennial landcover of many arid and semiarid regions (Belnap et al. 2001a), (Büdel 2002). In many arid and hyperarid areas BSCs form the only perennial "vegetation cover" largely due to their extensive resistance to drought (Lange et al. 1975). For the Central Namib Desert (Namibia), BSCs consisting of extraordinary vast lichen communities were recently mapped and classified into six morphological classes for a coastal area of 350 km x 60 km. Embedded into the project "BIOTA" (www.biota-africa.org) financed by the German Federal Ministry of Education and Research the study was undertaken in the framework of the PhD thesis by Christoph Schultz. Some of these lichen communities grouped together in so called "lichen fields" have already been studied concerning their ecology and diversity in the past (Lange et al. 1994), (Loris & Schieferstein 1992), (Loris et al. 2004), (Ullmann & Büdel 2001a), (Wessels 1989). Multispectral LANDSAT 7 ETM+ and LANDSAT 5 TM satellite imagery was utilized for an unitemporal supervised classification as well as for the establishment of a monitoring based on a combined retrospective supervised classification and change detection approach (Bock 2003), (Weiers et al. 2003). Results comprise the analysis of the mapped distribution of lichen communities for the Central Namib Desert as of 2003 as well as reconstructed distributions for the years 2000, 1999, 1992 and 1991 derived from retrospective supervised classification. This allows a first monitoring of the disturbance, destruction and recovery of the lichen communities in these arid environments including the analysis of the major abiotic processes involved. Further analysis of these abiotic processes is key for understanding the influence of Namib lichen communities on overall aeolian and water induced erosion rates, nutrient cycles, water balance and pedogenic processes (Belnap & Gillette 1998), (Belnap et al. 2001b), (Belnap 2001c), (Evans & Lange 2001), (McKenna Neumann & Maxwell 1999). In order to aid the understanding of these processes SRTM digital elevation model data as well as climate data sets were used as reference. Good correlation between geomorphological form elements as well as hydrological drainage system and the disturbance patterns derived from individual post classification change comparisons between the timeframes could be observed. Conjoined with the climate data sets sporadic foehn-like windstorms as well as extraordinary precipitation events were identified to largely affect the distribution patterns of lichen communities. Therefore the analysis and monitoring of the diversity, distribution and spatiotemporal change of Central Namib BSCs with the means of Remote Sensing and GIS applications proof to be important tools to create further understanding of desertification and degradation processes in these arid regions.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde Knochenmarksmaterial von 110 Leukämiepatienten auf das Vorliegen von p53-Gen-Deletionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Interphasezellkerne als auch Metaphasen der Leukämiezellen mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) mit der p53-Gen-Sonde untersucht. Dabei konnte in keinem der 55 untersuchten Patienten mit lymphatischer Leukämie eine Alleldeletion des p53-Gens nachgewiesen werden. Da die p53-Gen-Deletion nach den Literaturangaben bei etwa 7% der Patienten mit lymphatischer Leukämie vorkommt, widersprechen die eigenen Ergebnisse diesen Angaben. Als Grund kann die zu geringe Anzahl der untersuchten Fälle genannt werden. Bei den 55 hier untersuchten Patienten, die an myeloischer Leukämie erkrankt waren, konnte in 7 Fällen (13%) eine Deletion im p53-Gen mittels FISH nachgewiesen werden. Der Anteil der gefundenen p53-Gen-Deletionen war deutlich höher als aufgrund der Literaturangaben erwartet. Die sieben Patienten, bei denen eine p53-Gen-Deletion nachgewiesen wurde, waren alle an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt. Alle Patienten, die eine p53-Gen-Deletion aufwiesen, zeigten auch einen numerisch und strukturell aberranten Karyotyp. Im zweiten Arbeitsabschnitt wurden Knochenmarkszellen von 21 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen mittels spektraler Karyotypisierung (SKY) untersucht und mit dem zytogenetischen Routinebefund verglichen. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen, die durch die konventionelle zytogenetische Untersuchung nicht identifiziert werden konnten. Bei 17 (81%) der Fälle wurden durch SKY zusätzliche Chromosomenaberrationen festgestellt. Nur bei 4 (19%) der Fälle wurde der zytogenetische Befund bestätigt. Im dritten Arbeitsabschnitt wurden Meningeome untersucht. Bei 22 Meningeomen (17 benigne und 5 atypische Meningeomen) wurde mittels Interphase-FISH nach einer Alleldeletion des p53-Gens gesucht. Es konnte jedoch in keinem Fall eine solche Deletion nachgewiesen werden. Weiterhin wurden bei 24 Meningeomen 96 frische Biopsieproben von verschiedenen Tumorarealen mit G-Bänderungstechnik zytogenetisch analysiert. Zur besseren Aufklärung komplex aberranter Karyotypen wurden zwei Fälle (Nr. 1 und Nr. 7) auch mittels SKY-Analyse untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob zytogenetische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors vorliegen. Es gab bei 13 von 24 Meningeomen (54%) zytogenetische Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen innerhalb eines Tumors. 24 (83%) von 29 Meningeomen wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft und 5 (17%) von 29 Meningeomen in den Tumorgrad II. Die Tumorgradverteilung in dieser Arbeit entspricht den Literaturangaben. 13 von 24 Tumoren wiesen entweder einen normalen Karyotyp oder nur eine Monosomie 22 auf. Alle 13 Tumoren wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft. Vier Meningeome wiesen stark aberrante Karyotypen auf, was vermutlich ein Zeichen für die Tumorprogression darstellt. Es wurde auch untersucht, ob eine Korrelation zwischen dem zytogenetischen und histologischen Befunden vorliegt. In der vorliegenden Arbeit hat bei sechs Fällen der histologische Befund nicht mit dem zytogenetischen Befund übereingestimmt, da die Tumore in den Tumorgrad I eingestuft wurden, der zytogenetische Befund aber einen aberranten Chromosomensatz aufwies, der normalerweise nicht bei niedriggradigen Meningeomen, sondern bei atypischen und anaplastischen Meningeomen vorkommt. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination verschiedener zytogenetischer und molekularzytogenetischer Methoden zur Charakterisierung Chromosomaler Aberrationen bei Meningeomen sinnvoll ist.
Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP.
The study provides insights into the dynamic processes of vascular epiphyte vegetation in two host tree species of lowland forest in Panama. Further, a novel approach is presented to examine the possible role of host tree identity in the structuring of vascular epiphyte communities: For three locally common host tree species (Socratea exorrhiza, Marila laxiflora, Perebea xanthochyma) we created null models of the expected epiphyte assemblages assuming that epiphyte colonization reflected random distribution of epiphytes in the forest. In all three tree species, abundances of the majority of epiphyte species (69 – 81 %) were indistinguishable from random, while the remaining species were about equally over- or underrepresented compared to their occurrence in the entire forest plot. Permutations based on the number of colonized trees (reflecting observed spatial patchiness) yielded similar results. Finally, a Canonical Correspondence Analysis also confirmed host-specific differences in epiphyte assemblages. In spite of pronounced preferences of some epiphytes for particular host trees, no epiphyte species was restricted to a single host. We conclude that the epiphytes on a given tree species are not simply a random sample of the local species pool, but there are no indications of host specificity either. To determine the qualitative and quantitative long-term changes in the vascular epiphyte assemblage of the host tree Socratea exorrhiza, in the lowland forest of the San Lorenzo Crane Plot, we followed the fate of the vascular epiphyte assemblage on 99 individuals of this palm species, in three censuses over the course of five years. The composition of the epiphyte assemblage changed little during the course of the study. While the similarity of epiphyte vegetation decreased on single palm individuals through time, the similarity analyzed over all palms increased. Even well-established epiphyte individuals experienced high mortality with only 46 % of the originally mapped individuals surviving the following five years. We found a positive correlation between host tree size and epiphyte richness and detected higher colonization rates of epiphytes per surface area on larger trees. Epiphyte assemblages on single Socratea exorrhiza trees were highly dynamic while the overall composition of the epiphyte vegetation on the host tree species in the study plot was rather stable. We suggest that higher recruitment rates due to localized seed dispersal by already established epiphytes on larger palms promote the colonization of epiphytes on larger palms. Given the known growth rates and mortality rates of the host tree species, the maximum time available for colonization and reproduction of epiphytes on a given Socratea exorrhiza tree is estimated to be about 60 years. Changes in the epiphyte vegetation of c. 1000 individuals of the host tree species Annona glabra at Barro Colorado Island over the course of eight year were documented by means of repeated censuses. Considerable increase in the abundance of the dominating epiphyte species and ongoing colonization of the host tree species suggests that the epiphyte vegetation has not reached a steady state in the maximal 80 years since the establishment of the host tree. Epiphyte species composition as a whole was rather stable. We disentangled the relationship between epiphyte colonization and tree size/available time for colonization with the finding that tree size explained only a low proportion of colonization while other factors like connectivity to dispersal source and time explain may explain a larger part. Epiphyte populations are patchily distributed and examined species exhibit properties of a metapopulation with asynchronous local population growth, high local population turnover, a positive relationship between regional occurrence and patch population size, and negatively correlated relationship between extinction and patch occupancy. The documented metapopulation processes highlight the importance of not colonized suitable habitat for the conservation of epiphytes.
Die Phagozytose apoptotischer Zellen ist ein essentieller Schritt bei der Embryogenese und dem Erhalt der Gewebehomöostase. Phagozyten beseitigen dabei nicht nur die sterbenden Zellen und verhindern damit eine Freisetzung immunogener zellulärer Bestandteile ins umliegende Gewebe, sondern unterdrücken aktiv pro-inflammatorische Antworten, wie die Sekretion von TNFalpha oder die Produktion von NO. Das Wissen über die zugrunde liegenden Prozesse und Mechanismen ist noch lückenhaft. Auch wenn bereits eine Vielzahl von beteiligten Rezeptoren und Reaktionen der Phagozytenzellen auf apoptotische Zellen (AZ) bekannt sind, sind die verantwortlichen und vermutlich sehr komplexen Signalwege noch relativ wenig erforscht. Die Produktion von kleinen reaktiven Molekülen wie NO oder Sauerstoffradikale (ROS) durch Makrophagen ist ein initialer Schritt zur Bekämpfung von Pathogenen. Zu Beginn meiner Promotion lagen noch keinerlei Daten bezüglich eines Einflusses apoptotischen Materials auf die ROS-Produktion aktivierter Makrophagen vor. Der grundlegende anti-inflammatorische Makrophagenphänotyp nach der Phagozytose von AZ führte zur Hypothese, dass auch diese durch AZ beeinflusst würde. Diese Überlegung bildete den Ausgangspunkt für meine Studien: Zunächst gelang es mir, ein Testsystem zur Untersuchung anti-inflammatorischer Effekte in Makrophagen nach der Phagozytose von AZ zu etablieren. Dabei konnte ich zeigen, dass die von mir verwendeten apoptotischen Jurkat-Zellen von murinen RAW264.7-Makrophagen aufgenommen werden und deren pro-inflammatorische Antwort, gemäß der Literatur, zu hemmen vermögen. In durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte ich mittels eines Redox-sensitiven Farbstoffs zeigen, dass AZ im Gegensatz zu nekrotischen oder vitalen Zellen die TPA-vermittelte ROS-Produktion in Makrophagen inhibieren. Sowohl durch EMSA und Western Blot-Analysen, als auch durch die Verwendung von d/n PPARgamma und PKCalpha-überexprimierenden Makrophagen, konnte ich nachweisen, dass die initiale Hemmung des ‚oxidative burst’ (innerhalb 1 Stunde) über eine PPARgamma-induzierte Inhibition der PKCalpha-vermittelt wird. Für diese reicht eine Bindung von AZ an die Makrophagen aus, während zu späteren Zeitpunkten andere, noch unbekannte Faktoren involviert scheinen. Dieser Mechanismus scheint auch in primären humanen Makrophagen von Bedeutung zu sein. Die Beobachtung, dass es nach der Behandlung aktivierter Makrophagen mit AZ zu einer verminderten IFNgamma-vermittelten NO-Produktion bei stark exprimierter iNOS kommt, ließ die Theorie zu, dass nicht - wie bisher vermutet - TGFbeta für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch hier gelang es mir, neue Erkenntnisse über den zugrunde liegenden Mechanismus der AZ-vermittelten NO-Inhibition zu erlangen: Mittels eines Aktivitäts-Assays und durch Einsatz des spezifischen Arginaseinhibitors nor-NOHA konnte ich zeigen, dass der Einfluss von AZ auf aktivierte Makrophagen nicht etwa deren iNOS-Aktivität verringert, sondern vielmehr aus einer erhöhten Arginaseaktivität resultiert. Diese führt scheinbar zu einer verminderten Substratverfügbarkeit für die iNOS und hemmt so die NO-Produktion. Western Blot- und quantitative PCR-Versuche zeigten eine erhöhte Arginase II-Expression nach Stimulation mit AZ, welches ebenfalls meine Theorie unterstützt. Ferner konnte ich durch den Einsatz von AZ-konditioniertem Medium zeigen, dass ein noch unbekannter, von AZ sekretierter löslicher Faktor für die Hemmung der NO-Produktion verantwortlich ist. Die Beobachtung einer sehr frühen COX-2-Expression nach der Inkubation von Makrophagen mit AZ und das Nichtvorhandensein entsprechender Beobachtungen in der Literatur führten dazu, dass ich mich im letzten Teil meiner Arbeit mit dem hierfür verantwortlichen Mechanismus befasste: Unter Verwendung eines Luziferase-Assays, bei dem das Luziferasegen mit der 3´-UTR oder AREs des COX-2-Gens gekoppelt war, konnte ich zeigen, dass - wie schon bei der Inhibition der NO-Produktion durch die Arginase II - ein von AZ sekretierter löslicher Faktor für eine schnelle, AZ-spezifische und höchstwahrscheinlich durch COX-2-mRNA-Stabilisierung vermittelte Proteinexpression verantwortlich war. Eine schnelle Erhöhung der COX-2-mRNA nach AZ-Stimulus sowie jüngste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, welche eine erhöhte COX-2-mRNA-Halbwertszeit zeigen, unterstützen diese Hypothese. Die von mir gewonnenen neuen Erkenntnisse über die Makrophagenreprogrammierung nach der Erkennung von AZ tragen zu einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Mechanismen bei. Es besteht die hoffnungsvolle Aussicht, dass das Verstehen und die Manipulation der ablaufenden Prozesse bei der Phagozytose von AZ eines Tages einerseits neue Therapiemöglichkeiten zur Behandlung von Infektions- und Autoimmunkrankheiten und andererseits verbesserte Strategien zur Bekämpfung von Krebs ermöglichen werden.
Arealweite Phylogeografie und Populationsgenetik der temperat-montanen Meum athamanticum (Apiaceae)
(2006)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der molekularen Biogeografie und der Populationsgenetik von Meum athamanticum (Apiaceae). Die Untersuchung stellt dabei die erste arealweite Phylogeografie einer europäischen temperat-montanen Pflanzenart dar. Neben der biogeografischen Struktur lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der M. athamanticum-Populationen des mitteleuropäischen Periglazialgebietes. Dadurch sollte ein Beitrag zur aktuell geführten Debatte und Theoriebildung der postglazialen Arealentwicklung temperater Arten geleistet und die Rolle des mitteleuropäischen Mittelgebirgsraums für die historische Entwicklung der Art beleuchtet werden. Auf der Basis populationsgenetischer Analysen sollten außerdem Aussagen zum Schutz der gefährdeten Art M. athamanticum getroffen werden. Für die Arbeit wurden AFLP-Untersuchungen an 173 Individuen aus 23 Populationen aus dem gesamten Verbreitungsgebiet von M. athamanticum durchgeführt. Außerdem wurden von 24 Individuen ITS- und ETS-Sequenzen erzeugt und analysiert, um Hinweise auf die ursprünglichen Evolutionsvorgänge innerhalb der Art zu erhalten. Für die feinere Auflösung des mitteleuropäischen Teilareals wurde in einem zweiten AFLP-Datensatz 210 Individuen aus 14 Populationen untersucht. Innerhalb der Art ist eine deutliche Nord-Süd-Differenzierung nachweisbar, die durch eine intermediäre Populationsgruppe in den Südwest-Alpen, die vermutlich eine sekundäre Kontaktzone repräsentiert, getrennt wird. Die starke genetische Separierung südlicher Populationen und die Existenz distinkter ITS/ETS-Haplotypen liefern Hinweise darauf, dass die Auftrennung innerhalb M. athamanticum relativ alt ist. Das wird gestützt durch die Tatsache, dass in allen drei großen geografischen Regionen Populationen mit hoher genetischer Diversität und genetisch alte Reliktpopulationen, die durch eine hohe Zahl eigener Fragmente gekennzeichnet sind, existieren. Die Ergebnisse der individuellen und populationsbezogenen Diversitätsanalysen zeigen, dass M. athamanticum sich nicht an den großräumigen Rekolonisationsvorgängen der europäischen Flora beteiligte, sondern zumindest das letzte glaziale Maximum im periglazialen Mitteleuropa überdauerte. Ein Refugialgebiet bestand wahrscheinlich im Umfeld des französischen Zentralmassivs, ein weiteres vermutlich im Randbereich von Ardennen/Eifel. Weiter gibt es Hinweise darauf, dass rund um den Gebirgsbogen des Erzgebirges und im Umfeld des Schwarzwaldes Refugien der Art gelegen haben. Und schließlich wird eine glaziale Persistenz im Bereich der Britischen Inseln postuliert. Eine Gruppe mit Populationen aus dem Thüringer Wald und dem Bayerischen Alpenvorland sind als Übergangsgruppe und sekundäre Kontaktzone zwischen den mitteleuropäischen Refugien zu deuten. Die Ergebnisse weisen auf unterschiedliche Migrationsmuster von M. athamanticum hin, die durch die topografischen Gegebenheiten in den geografischen Teilräumen geprägt sind. Im nördlichen Teilareal von M. athamanticum kam es bei einem vergleichbar wenig ausgeprägten Relief (heutige Vorkommen zwischen 200 und 1020 m ü. NN) zu geografisch weiträumigen longitudinalen und latitudinalen Migrationen, was die Bildung intramontaner Populationen und den genetischen Austausch mit benachbarten Populationen ermöglichte. Demgegenüber kam es in Südeuropa während kalter Perioden im Zuge der klimabedingten Absenkung der Vegetationszonen zu geografisch eng begrenzten, altitudinalen Wanderungsbewegungen (heutige Vorkommen zwischen 1400 und 2900 m ü. NN), womit ein genetischer Austausch zwischen benachbarten Populationen auch in den Kaltphasen eingeschränkt war. Die genetischen Merkmale (AMOVA: Differenzierung zwischen den Populationen; NJ: längere Äste; modellbasiertes Clusterverfahren: höhere Likelihood für Differenzierung; hohe Anzahl privater und fixierter privater Fragmente und isolation-by-distance der Populationen des südlichen Arealrandes (rear edge) reflektieren insgesamt Isolationsereignisse, die vermutlich bis in das Tertiär zurückreichen. Aus den Ergebnissen der arealweiten phylogeografischen Studie als auch der mitteleuropäischen populationsgenetischen Studie können Schlussfolgerungen für den Schutz von M. athamanticum gezogen werden können. Dabei werden die rear-edge-Populationen der südeuropäischen Hochgebirge, genetisch rezent verarmte Kleinpopulationen in Mitteleuropa und die genetisch diversen Populationen in allen Teilarealen als prioritär für den Erhalt der Art eingestuft.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem signaltransduzierenden Zwei-Komponenten- System CiaRH aus Streptococcus pneumoniae. Zwei-Komponenten-Systeme sind an der Adaptation der Bakterien an Umweltbedingungen entscheidend beteiligt. Sie bestehen in der Regel aus einer Histidinkinase (hier CiaH) und einem Responseregulator (hier CiaR). Die Histidinkinase dient der Signaldetektion und Aktivierung des Responseregulators, welcher die zelluläre Antwort vermittelt. Das Cia-System wurde als Resistenzdeterminante in spontanresistenten Labormutanten gegen Cefotaxim identifiziert. Weiterhin hat dieses Zwei-Komponenten-System Einfluss auf die Zelllyse, die Virulenz und ist an der Regulation der genetischen Kompetenz beteiligt. Es wird für die Lebensfähigkeit von Zellen mit PBP2x-Punktmutationen benötigt. Inhaltlicher Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war neben der Etablierung der Mikroarray-Technik und globalen Transkriptionsanalysen die funktionelle Charakterisierung des Cia-Systems mit phänotypischen Analysen. Die Etablierung der Mikroarray-Technik befasste sich mit allen Schritten des Mikroarray-Prozesses inklusive Biochip-Herstellung, Datenauswertung und der Validierung des Oligo-Sets. Nach erfolgreicher Etablierung wurde diese Technik benutzt, um Cia-regulierte Gene zu identifizieren. Durch Vergleich des Transkriptoms von verschiedenen Cia-Mutanten mit dem Wildtyp R6 wurden insgesamt 158 Gene unterschiedlich transkribiert. Davon gehörten 73 Gene zum minimalen Cia- und zum Kompetenz-Regulon, welche schon als Cia-reguliert bekannt waren (Sebert et al., 2002; Mascher et al., 2003; Dagkessamanskaia et al., 2004). Überraschenderweise wurden weitere 85 Gene Cia-abhängig transkribiert, deren Genprodukte funktionell in Zucker- und Stickstoffmetabolismus sowie Transport gruppiert werden konnten. Wahrscheinlich wurden die meisten dieser 85 Gene indirekt als Folge der veränderten Zuckerverwertung reguliert. Ähnliche funktionelle Gengruppen konnten in den globalen Transkriptionsanalysen der spontanresistenten Laborfamilie C103 bis C503 aufgestellt werden. In dieser Mutantenfamilie sind Mutationen in CiaH, PBP2x und PBP2a gefunden worden. Besonders auffällig war bei diesen Untersuchungen die kontinuierliche Verstärkung der Transkription der Gene des minimalen Cia-Regulons von C103 bis C503. Deshalb ist von einer Aktivierung des Cia-Systems durch PBP-Mutationen auszugehen. Diese Aktivierung konnte auch in RT-PCR-Versuchen am Beispiel einzelner Gene des minimalen Cia-Regulons bestätigt werden. Da das Cia-System durch PBP-Mutationen aktiviert wird und ein funktionelles Cia-System bei Anwesenheit von bestimmten PBP2x-Mutationen benötigt wird, wurde in dieser Arbeit diese Notwendigkeit des Cia-Systems auch bei anderen PBP-Mutationen durch phänotypische Analysen überprüft. Dabei wurde durch Inaktivierung des Cia-Systems in verschiedenen Stämmen festgestellt, dass nicht nur Zellen mit einzelnen, im Labor selektierten PBP2x-Mutationen, sondern auch ohne ein PBP2a- und ohne ein PBP1a-Protein auf ein Cia-System angewiesen sind. Klinische PBP2x-Allele benötigten ebenfalls – aber in geringeren Maßen – das Cia-System. Wahrscheinlich haben in diesen kompensatorische Mutationen durch Evolution in der freien Natur stattgefunden. Damit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass PBP-Mutationen nicht neutral sind und verschiedene PBP-Mutationen unterschiedliche Auswirkungen haben. Weiterhin wurde untersucht, welche Gene tatsächlich die durch das Cia-System verursachten Phänotypen auslösen. Dazu wurden 6 Cia-regulierte Genregionen bzw. Einzelgene mit einer Erythromycin-Resistenzkassette inaktiviert und auf das Vorhandensein von Cia „OFF“-phänotypischem Verhalten analysiert. Kein Gen konnte für das Resistenz- oder das Lyseverhalten ausfindig gemacht werden. Hingegen waren die Proteine HtrA und Spr0782 an der Reprimierung der Kompetenz durch das Cia-System beteiligt. Bei beiden Proteinen konnte nur eine Reprimierung in CpH8- und nicht in THB-Medium nachgewiesen werden, so dass eventuell noch von weiteren Faktoren ausgegangen werden muss. Die hier vorgelegten Ergebnisse haben die bisher vorliegenden Daten über das Cia-System bestätigt und entscheidende Einblicke nicht nur in die mögliche Funktion, sondern vor allem in das komplexe vernetzte Regulationssystem gegeben. Diese stellen eine wichtige Grundlage für weitere Experimente dar.