Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Die Entwicklung von beta-Laktam-Resistenz in dem Pathogen Streptococcus pneumoniae (S. pneu-moniae) stellt einen komplexen Prozess dar, welcher auf einer Modifikation der Penicillin-Bindeproteine (PBP), der Targetstrukturen von beta-Laktam-Antibiotika beruht. PBP sind Membran-gebundene Enzyme, welche essentielle Reaktionen bei der bakteriellen Zellwand-Synthese katalysieren. Diese Proteine werden im Zuge der Resistenzentstehung so verändert, dass beta-Laktame nicht mehr oder nur noch mit geringer Affinität gebunden werden, das physiologische Substrat aber noch erkannt werden muß. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem PBP2x von S. pneumoniae, das als essentielles PBP und wichtigste primäre Resistenzdeterminante einen hohen Stellenwert bei der Entstehung von beta-Laktam-Resistenz in diesem Organismus einnimmt. Obwohl dieses PBP zu den am besten untersuchten PBP gehört, bleiben die Resistenzrelevanz einzelner Punktmutationen und die mit der Veränderung des Proteins einhergehenden physiologischen Folgen für die Zelle weitgehend unklar. Zentraler Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des Effekts von PBP2x-Mutationen auf die Resistenz, Funktionalität von PBP2x und Zellphysiologie im Kontext mit der sekundären Resistenzdeterminante PBP1a und den beiden Zwei-Komponenten-Systemen CiaRH, welches in die Cefotaxim-Resistenz, genetische Kompetenz und Virulenz involviert ist und ComDE, das die genetische Kompetenz reguliert. Besonderes Interesse galt dabei der Position Thr338, welche sich unmittelbar benachbart zum aktiven Serin befindet und in den meisten resistenten klinischen Isolaten zu Alanin, Prolin oder Glycin mutiert ist. Durch eine gerichtete Mutagenese dieser Position im Wildtyp R6 konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Thr338-Punktmutation einen selektionierbaren Resistenz-Phänotyp in vivo vermittelt, wobei abhängig von dem jeweiligen Austausch unterschiedliche Resistenzniveaus und Kreuzresistenzspektren zu beobachten waren. Abgesehen von einem nur moderaten Beitrag zur Resistenz, betraf eine solche Substitution offenbar auch die Funktionalität von PBP2x, was sich auf dramatische Art und Weise in Abwesenheit eines intakten CiaRH-Regulationssystems äußerte: Es kam zu Wachstumsdefekten, insbesondere einer verfrühten und verstärkten Autolyse, morphologischen Aberrationen und einer verminderten Lebensfähigkeit. Entgegen aller Erwartungen führte die Präsens eines Mosaik-PBP1a in dem genetischen Hintergrund der Thr338-Mutation nicht zu einem weiteren Anstieg der Resistenz, sondern bewirkte sogar einen leichten Abfall. Dennoch komplementierte das Mosaik-PBP1a die durch das Fehlen eines funktionsfähigen CiaRH-Systems hervorgerufenen Wachstumsdefizienzen. Der Vergleich zwischen dem PBP2x mit Thr338-Punktmutation und einem Mosaik-PBP2x deckte gravierende Unterschiede im Hinblick auf das Resistenzpotential und die physiologischen Auswirkungen auf. Anders als bei der PBP2x-Punktmutation waren bei dem Mosaik-PBP2x fast keine Wachstumseinbußen zu verzeichnen, wenn es mit einem inaktiven Zwei-Komponenten-System CiaRH kombiniert wurde, und die Anwesenheit eines Mosaik-PBP1a brachte eine starke Erhöhung der Cefotaxim-Resistenz mit sich. Beiden pbp2x-Allelen war jedoch gemeinsam, dass die Abwesenheit eines PBP1a massive Defekte im Wachstum zur Folge hatte. Alle diese Beobachtungen deuteten auf eine mögliche Interaktion zwischen PBP2x und PBP1a hin. Die Analyse der Zellwand einer Mutante mit zwei PBP2x-Aminosäureaustauschen, von denen einer in resistenten klinischen Stämmen anzutreffen ist, ergab eine biochemisch modifizierte Zellwand, in der bei einem fast gleichbleibenden Anteil an verzweigten Dimeren, Monomere erhöht, und lineare Dimere und Trimere reduziert waren. Diese Befunde ließen auf eine enzymatische Beeinträchtigung dieses PBP2x schließen. Ein von CiaRH ausgehender Effekt konnte nicht festgestellt werden. Eine Inaktivierung des für den Export des Kompetenz-stimulierenden Peptids CSP verantwortlichen ABC-Transporters ComAB in Kombination mit einem nicht-funktionellen CiaRH-System bewirkte im Wildtyp eine vollständige, in PBP2x-Punktmutanten eine nur teilweise Aufhebung der vorzeitigen stationären Phase-Autolyse. Darüber hinaus machte sich bei einem der PBP2x-Derivate, welches zusätzlich über eine Cefotaxim-Resistenz-vermittelnde Aminosäuresubstitution in CiaH verfügte, bei ciaR-Inaktivierung sowohl ein Verlust der CiaH- als auch eine partielle Einbuße der PBP2x-Resistenz bemerkbar, bei comAB-Inaktivierung hingegen aber ausschließlich ersteres. Hieraus konnte zum einen auf einen direkten Bezug des Lyse-Phänotyps zu der Kompetenz und der CiaRH-Resistenz zu ComAB geschlossen werden, zum anderen auf einen CiaRH-unabhängigen Einfluss von PBP2x auf die Kompetenz und Autolyse. Tatsächlich bestätigte eine Bestimmung der Transformationseffizienz von Mutanten mit verschiedenen Konstellationen aus niederaffinen und unmodifizierten PBP, dass das Kompetenzmuster bzw. -ausmaß von der jeweiligen PBP-Ausstattung moduliert wird. Auch eine Microarray-basierte globale Transkriptomanalyse dieser Mutanten sowie spontan resistenter Labormutanten mit PBP2x- und CiaH-Mutationen suggerierte eine von CiaRH-entkoppelte Einflussnahme der PBP auf die Kompetenz. Zudem zeugten die Transkriptionsmuster von einem vielschichtigen Regulationsnetzwerk der Resistenzentwicklung unter Beteiligung von Kompetenz, Bakteriocinproduktion, Virulenz, Metabolismus, Transportprozessen und Energiestatus, was möglicherweise eine indirekte Folge einer gestörten Zellwand- und Membranintegrität darstellt. Durch die Extraktion von intergenen Bereichen, sowie potentiellen neuen Resistenzdeterminanten bzw. Resistenz-unterstützenden Genen, wie den Gen-Clustern spr1545-spr1549 und spr0096-spr0110 oder den Genen des Purinstoffwechsels wurde die Basis für weiterführende Untersuchungen geschaffen. Die hier vorgestellten Daten demonstrieren, dass der Erwerb von beta-Laktam-Resistenz nicht nur von Vorteil ist, sondern auch physiologische Konsequenzen für die Zelle hat, die sie kompensiert, um ein möglichst stabiles Wachstum zu gewährleisten. Über die Zellwand-Zusammensetzung und Kompetenz konnte erstmalig eine Verbindung von PBP2x zu CiaRH hergestellt werden. Eine konkrete kompensatorische Wirkung dieses Regulons hinsichtlich PBP2x-Mutationen wurde mit der Repression der Kompetenzlyse ausfindig gemacht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde basierend auf einer früheren Veröffentlichung, in der eine Inaktivierung des Gens für das PBP2b von S. pneumoniae erfolglos blieb, erneut versucht, eine solche Mutante herzustellen. Obwohl lebensfähige Transformanten generiert werden konnten, war es nicht möglich eine pbp2b-Inaktivierungs- bzw. Deletionsmutante zu isolieren, sodass PBP2b in diesem Organismus weiterhin als essentielles Protein angesehen werden kann.
I) Die Untersuchungen zum vakuolären Malat-Carrier AtTDT unterstützen die Annahme, dass seine Aktivität in den Schließzellen zum Öffnen und Schließen der Stomata beiträgt. Zudem erhöht wahrscheinlich die Aktivität von TDT in den Mesophyllzellen die Stomata-Dichte und den Stomata-Index. Im Rahmen einer osmotischen Anpassung vermittelt der Transporter eine Malat-Akkumulation, die in den TDT-Knockout-Mutanten beeinträchtigt ist und durch erhöhte Citrat-Gehalte kompensiert wird. Darüber hinaus beschleunigt TDT unter Kurztag-Bedingungen den Eintritt in die generative Phase. Eine Funktion von TDT in der Salztoleranz kann nach metabolischen und phänotypischen Analysen ausgeschlossen werden. II) Die tonoplastidären Monosaccharid-Transporter regulieren bei Kälte in Blättern nicht nur die Monosaccharid-Gehalte, sondern wirken auch positiv auf Photosynthese und Stärkegehalte. Das Ausschalten der TMT-Gene führt unter den gewählten Kältebedingungen zu einer erhöhten Synthese von Saccharose und zu einer gesteigerten Respirationsrate. Insbesondere unter Wassermangel wirkt sich die Aktivität der tonoplastidären Monosaccharid-Transporter positiv auf die Keimungsrate aus. III) Die Bestimmung von Zuckergehalten in Blättern indiziert, dass die tonoplastidären Transportproteine AtERD6.7 und BvIMP Glukose aus der Vakuole transportieren, während AtERD6.5 womöglich Fruktose aus der Vakuole transportiert. Als Transportmechanismus wird aufgrund der Homologie zu den GLUT-Proteinen eine erleichterte Diffusion angenommen. Die Aktivität der Carrier scheint insbesondere nach Kältephasen von Bedeutung zu sein, wenn vakuolär gespeicherte Zucker mobilisiert werden. ERD6.7 fördert gemäß den durchgeführten Keimungstests die Samen-Dormanz.
Das antioxidative Potenzial eines roten Mehrfruchtsaftes mit hohem Anthocyan-/Polyphenolanteil wurde in zwei humanen Interventionsstudien mit Biomarkern oxidativer Zellschädigung und Zellantwort charakterisiert. Ergänzend wurden ein Mehrfruchtsaftextrakt (ME) und ausgewählte potentiell antioxidativ wirksame Mehrfruchtsaftinhaltsstoffe (Anthocyane) in in vitro-Experimenten untersucht. In einer Interventionsstudie nahmen 18 männliche Probanden nach einer 3-wöchigen Run-in-Phase über vier Wochen täglich 700 mL eines anthocyanreichen Mischfruchtsaftes (TEAC 19,1 mmol/L Trolox) auf. Anschließend folgte eine 3-wöchige Wash-out-Phase ohne Saftaufnahme. Neun der 18 Probanden nahmen zusätzlich an einer zweiten Interventionsstudie mit identischem Design teil, jedoch unter Verwendung eines Kontrollsaftes, in dem die phenolische Fraktion weitgehend technologisch entfernt wurde. Wöchentliche wurde Blut entnommen zur Bestimmung der Biomarker (oxidative) DNA-Schädigung, Lipidperoxidationsprodukte Malondialdehyd, Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen und Isoprostane (Urin), Glutathionspiegel/-status und DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors NFkappaB. Ergänzend wurden die Konzentrationen der Carotinoide und des alpha-Tocopherols in Plasma bestimmt. In den in vitro-Experimenten kam ein zweistufiges Inkubationsprotokoll in humanen Blut- bzw. Kolonzelllinien (Jurkat, Caco-2) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h bzw. 1 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Untersucht wurde neben der zellfreien Bestimmung der antioxidativen Kapazität (TEAC), die Modulation (oxidativer) DNA-Schädigung und des ROS-Levels in der Zelle. Die Ergebnisse der Interventionsstudie mit Mehrfruchtsaft zeigten eine signifikante Abnahme oxidativer DNA-Schäden (p< 0,0005), Zunahme des tGSH-Spiegels (p< 0,0005) und Anstieg des Glutathionstatus (p< 0,05) während der 4-wöchigen Saftaufnahme im Vergleich zu den 3-wöchigen Run-in-/Wash-out-Phasen. Eine signifikante Abnahme der Lipidperoxidation dagegen wurde nicht beobachtet. Es zeigte sich lediglich eine deutliche Tendenz zu einer Abnahme der Isoprostangehalte während der Saftaufnahme. Eine Verringerung der DNA-Bindungsaktivität von NFkappaB durch Saft war nicht nachweisbar. Die Plasmagehalte der Carotinoide und des alpha-Tocopherols, als mögliche und bekanntermaßen antioxidativ wirksame Substanzen, blieben während aller Interventionsphasen unverändert. Für die beobachteten protektiven Effekte scheinen die phenolischen Substanzen des Mehrfruchtsaftes verantwortlich zu sein, da in der Studie mit Kontrollsaft keine Reduktion von oxidativen Schäden nachgewiesen werden konnte. Der ME zeigte eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (4,64 mM Trolox) im zellfreien Testsystem. Der zelluläre ROS-Level wurde in vitro durch den Extrakt (bei 100-250 µg/mL) signifikant verringert (p< 0,05). Oxidative DNA-Schäden in Jurkat-/Caco-2-Zellen wurden durch den Extrakt nicht signifikant vermindert; es zeigte sich lediglich die Tendenz einer protektiven Wirkung (bei 10 µg/mL). Von den vergleichend in Jurkat-Zellen getesteten Anthocyanidinen zeigten Malvidin und Delphinidin nach 24 h Inkubation kein Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden. Bei einstündiger Antioxidansbehandlung dagegen, konnte ein einheitlicher Trend einer protektiven Modulation (bei 10-100 µM) beobachtet werden. Zusammenfassend besitzt der flavonoid/polyphenolreiche rote Mischfruchtsaft ein eindeutiges Potential zur Verringerung oxidativer Zellschädigung in gesunden Probanden. Dieses geht, begründet aus den Ergebnissen der Saft-/Kontrollsaftstudie, vermutlich auf die phenolische Fraktion des Saftes zurück. Aufgrund der in vitro erhaltenen Daten kann die antioxidative Wirksamkeit jedoch nicht maßgeblich auf die untersuchte Substanzgruppe der Anthocyane zurückgeführt werden. Dies legt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/Stoffgruppen einen Beitrag zu der antioxidativen Wirksamkeit leisten.
Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse genetischer Veränderungen in der Familie P006 von Piperacillin-resistenten Mutanten von S. pneumoniae R6. Jede der fünf Mutanten P106 bis P506 dieser Familie wurde aus dem jeweiligen Parentalstamm auf ansteigender Konzentration des lytischen ß-Lactams Piperacillin isoliert und zeichnete sich durch eine jeweils höhere minimale Hemmkonzentration (MHK) für Piperacillin aus (Laible et al., 1987). In Mutante P106 konnte mit CpoA bereits eine Resistenzdeterminante für Piperacillin identifiziert werden, welche nicht zu den klassischen Targets der ß-Lactamantibiotika, den Penicillin-Bindeproteinen (Pbp), zählt (Grebe et al., 1997). Die Mutanten P206 und P306 zeigten aufgrund von Mutationen in Pbp2b und Pbp2x eine höhere Resistenz gegen Piperacillin (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). In dieser Arbeit standen die Identifizierung und Charakterisierung der bisher unbekannten Resistenzdeterminante für Piperacillin in Mutante P406 und die Charakterisierung der bisher nur unzulänglich untersuchten Nicht-Pbp-Resistenzdeterminante CpoA in Mutante P106 im Mittelpunkt der Analysen. Im Fall der bereits identifizierten Resistenzdeterminante in Mutante P106 handelt es sich um das für eine Glykosyltransferase kodierende Gen cpoA. Die Herstellung einer cpoA-Deletionsmutante, sowie deren Charakterisierung, sollten zur Aufklärung des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus in P106 und der Funktion von CpoA beitragen. Durch die Herstellung der cpoA-Deletionsmutante und die Bestimmung der MHK für Piperacillin konnte gezeigt werden, daß ein Ausfall der durch CpoA katalysierten Reaktion einen Anstieg der MHK für Piperacillin in S. pneumoniae R6 bewirkt. Die eingehende phänotypische Charakterisierung zeigte, daß die cpoA-Deletionsmutante zudem eine reduzierte genetische Kompetenz, eine reduzierte Säuretoleranz, einen höheren Bedarf an zweiwertigen Mg-Ionen, eine längere Generationszeit und eine verlangsamte Autolyse im Vergleich zu S. pneumoniae R6 besitzt. Diese Beobachtungen, sowie die Ergebnisse einer Microarray-basierten, globalen Transkriptomanalyse lassen es unter Berücksichtigung der biochemischen Charakterisierung von CpoA (Edman et al., 2003) als wahrscheinlich erscheinen, daß CpoA an der Synthese von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, einem der Hauptglycolipide der Cytoplasmamembran von S. pneumoniae beteiligt ist. Die Deletion von cpoA könnte demzufolge auch einen Effekt auf die Menge der Lipoteichonsäuren in der Zellwand von S. pneumoniae besitzen, da der Precursor von α-Galactosyl-Glucosyl-Diacylglycerin, das α-Monoglucosyl-Diacylglycerin vermutlich den Lipidanker der Lipoteichonsäuren darstellt. Basierend auf dieser Annahme konnte ein Modell zur Funktion von CpoA erstellt werden, welches eine Erklärung des Resistenzmechanismus für Piperacillin in Mutante P106, bzw. in der cpoA-Deletionsmutante ermöglichen würde. In Mutante P406 konnten weitere Veränderungen der Pbps bereits ausgeschlossen werden (Hakenbeck et al., 1994; Grebe & Hakenbeck, 1996). Durch eine Microarray-basierte, globale Transkriptomanalyse aller fünf Mutanten der Familie P006 konnten Gene identifiziert werden, deren Transkripte im Vergleich zu S. pneumoniae R6 nur in P406 signifikant veränderte Mengen aufwiesen: Unter diesen Genen befanden sich sechs Gene, welche aufgrund ihrer geclusterten Anordnung im Genom von S. pneumoniae als putative funktionelle Einheit (TCS11-Cluster) angesehen wurden. Diese Gene zeigten eine bis zu 22-fach erhöhte Transkriptmenge in Mutante P406. Zudem konnten nur in Mutante P406 von Genen des an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten lic1-Operons eine bis zu 7,9-fach höhere Transkriptmenge beobachtet werden. Keines der Genprodukte des TCS11-Clusters wurde bisher charakterisiert. Aufgrund von Blast- und Domänen-Analysen konnten den Genprodukten putative Funktionen zugeschrieben werden. Die Gene smp11A und smp11B kodieren für zwei putative Membranproteine von 63 und 64 Aminosäuren. Die Gene nbp11 und msp11 kodieren für die ATPase- und die Permease-Komponente eines putativen ABC-Transporters. kin11 und reg11 kodieren für die Histidin-Kinase und den Response-Regulator des bisher uncharakterisierten Zweikomponentensystems 11 (TCS11) in S. pneumoniae. Die Gene sind in der Reihenfolge smp11A, smp11B, nbp11, msp11, kin11 und reg11 auf dem Minus-Strang im Genom von S. pneumoniae lokalisiert. Die Deletion der Gene kin11 und reg11 des TCS11 in P406 führte zum Abfall der MHK für Piperacillin auf die MHK des Parentalstamms P306. Somit konnte die Beteiligung des TCS11 in S. pneumoniae an einem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin nachgewiesen werden. Die Deletion von nbp11 in P406 führte ebenfalls zum Abfall der MHK für Piperacillin, womit einerseits auch für Nbp11 eine Beteiligung an dem unbekannten Resistenzmechanismus gegen Piperacillin gezeigt werden konnte und andererseits eine transkriptionelle Regulation der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 durch das TCS11 vermutet werden konnte. Durch eine konstitutive, gemeinsame Überexpression der Gene smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 in S. pneumoniae R6 wurde gezeigt, daß die Überexpression dieser Gene hinreichend für eine Erhöhung der Resistenz gegen Piperacillin ist. Durch 5´-RACE-Analysen konnten die beiden Transkriptionsstartpunkte P11.1 und P11.2 im Bereich des TCS11-Clusters kartiert werden. P11.1 befindet sich 20bp upstream von smp11A und P11.2 befindet sich 441bp upstream von kin11 innerhalb von msp11. Eine Northern-Analyse und die Durchführung von PCR auf cDNA zeigte, daß die Gene des TCS11-Clusters in zwei überlappenden Transkriptionseinheiten transkribiert werden. Die Gene kin11 und reg11 sind zusammen mit einer downstream von reg11 liegenden Kopie des repetetiven Elements rupA im 11-2-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.2 inklusive des ungewöhnlich langen Leaders von 441bp transkribiert. smp11A, smp11B, nbp11 und msp11 sind im 11-1-Operon organisiert und werden ausgehend von Promotor P11.1 transkribiert. Die Zugehörigkeit von kin11 und reg11 zum 11-1-Operon konnte hingegegen bei den verwendeten Wachstumsbedingungen nicht gezeigt werden. Es konnte bereits gezeigt werden, daß phosphoryliertes Reg11 (Reg11-P) an die Promotor-Region von P11.1 bindet (Marciszewski, Diplomarbeit 2007). Die Bestimmung der Aktivität von P11.1 in S. pneumoniae R6, sowie in kin11-, reg11- und kin11reg11-Deletionsmutanten zeigte, daß P11.1 einer direkten, positiven Regulation durch das TCS11 unterliegt. Durch Sequenzvergleiche der Promotor-Region von P11.1 mit den DNA-Regionen putativer Promotoren von zum TCS11-Cluster ähnlich organisierten Clustern homologer Proteine in Genomen anderer Gram-positiver Bakterien konnten drei hoch konservierte Sequenzabschnitte identifiziert werden, von welchen gezeigt werden konnte, daß sie für die Bindung von Reg11-P in S. pneumoniae essentiell sind. Vermutlich stellt die Konsensus-Sequenz ATGACA(2)TGTCAT(8-9)GTGACA die DNA-Bindestelle von Reg11-P dar. Es konnten keine weiteren, zu 100 % konservierten Sequenzen dieser Art im Genom von S. pneumoniae gefunden werden. In EMSA-Assays mit weniger konservierten Sequenzen dieser Art konnte keine Bindung von Reg11-P beobachtet werden. Somit handelt es sich bei der Bindestelle an P11.1 vermutlich um die einzige Bindestelle von Reg11-P im Genom von S. pneumoniae. Von P11.2 konnte durch die Bestimmung der Promotor-Aktivität in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters gezeigt werden, daß auch dieser Promotor einer Regulation unterliegt, welche jedoch nicht durch die Bindung von Reg11-P, oder von unphosphoryliertem Reg11 vermittelt wird. Die Aktivität von P11.2 ist hierbei jedoch einerseits Abhängig von der Anwesenheit von Kin11 und andererseits entweder von der Funktion der Membranproteine Smp11A und Smp11B, oder von der durch Nbp11/Msp11 transportierten unbekannten Substanz. Die Bestimmung der Promotor-Aktivität von P11.2 in Deletionsmutanten einzelner Gene des TCS11-Clusters und die unterschiedlichen phänotypischen Effekte einer kin11-, reg11- und einer kin11reg11-Deletionsmutante zeigten, daß unphosphoryliertes Reg11 ebenfalls in der Lage sein muß, die Transkription von noch unbekannten Zielgenen durch Bindung an eine weitere, unbekannte DNA-Bindestelle zu regulieren. Sowohl durch die Deletion eines Großteils des 441nt langen Leaders des Transkripts des 11-2-Operons, als auch durch die Deletion zweier verschiedener Abschnitte des 3´-untranslatierten Bereichs dieses Transkripts konnte gezeigt werden, daß der 5´- und der 3´-untranslatierte Bereich an noch unbekannten regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die Deletion einzelner Gene des TCS11-Clusters, sowie die gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 bewirkten die gleichen phänotypischen Effekte wie die charakterisierte cpoA-Deletionsmutante. So konnte in Wachstumsexperimenten der gleiche Einfluß auf die Generationszeit, die maximale Zelldichte und die Autolyse, wie in der cpoA-Deletionsmutante, gezeigt werden. Die Microarray-basierte Transkriptomanalyse zweier Deletionsmutanten von Genen des TCS11-Clusters zeigte zudem, daß sich infolge dieser Deletionen größtenteils die Transkriptmengen solcher Gene ändern, welche auch auf eine Deletion von cpoA reagieren. Hierzu zählen neben zahlreichen Genen für Proteine unbekannter Funktion die Gene des Kompetenzregulons, des blp-Clusters, sowie des Cholinbindeproteins PcpA und der Subtilisin-artigen Proteinase PrtA. Die in Mutante P406 beobachteten höheren Transkriptmengen von an der Teichonsäurebiosynthese beteiligten Genen des lic1-Operons konnten durch die Deletion von kin11reg11 revidiert werden. Die konstitutive gemeinsame Überexpression von Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11, sowie die Bestimmung der Aktivität des Promotors P1spr1149 des lic1-Operons zeigte, daß die Transkription der Gene des lic1-Operons indirekt von der Menge an Smp11A, Smp11B, Nbp11 und Msp11 abhängt. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß das TCS11-Cluster und die Glykosyltransferase CpoA an den gleichen, oder zumindest an sich beeinflussenden, Membran-assoziierten Vorgängen beteiligt sind. Folglich konnte durch die molekulargenetische Charakterisierung des in ähnlicher genetischer Organisation in Gram-positiven Bakterien weit verbreiteten TCS11-Clusters erstmals ein Hinweis auf die putative physiologische Funktion des TCS11-Clusters in S. pneumoniae erhalten werden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der PDE1C-Isoform in ZNS-Zellen zu untersuchen. Es sollte vor allem die Bedeutung der PDE1C als mögliches Target für die anti-neoplastische Therapie von ZNS-Tumoren näher beleuchtet werden. Die humanen Glioblastomzellinien SNB75, SF295, SF539 und SF268 wurden bezüglich ihrer PDE1- und PDE4-Isoenzymausstattung näher charakterisiert. Es zeigte sich, daß die Zellinien SNB75 und SF295 in ihrem PDE-Expressionsmuster sehr unterschiedlich sind: In der Zellinie SNB75 liegt die cAMP-hydrolytische Aktivität deutlich über jener in SF295-Zellen. Darüber hinaus weisen die SNB75-Zellen einen hohen Anteil Ca2+/CaM-stimulierbarer PDE1-Aktivität bei niedriger PDE4-Aktivität auf. Im Gegensatz dazu zeigt die Zellinie SF295, welche keine Ca2+/CaM-stimulierbare PDE-Aktivität besitzt, einen hohen prozentualen Anteil an Rolipram-hemmbarer PDE4-Aktivität. Darüber hinaus verhalten sich die beiden Zellinien auch bezüglich ihrer Gehalte an den „second messengern“ cAMP und cGMP komplementär. In den SNB75-Zellen ist der cAMP-Spiegel etwa um 2/3 niedriger als in den SF295-Zellen; der cGMP-Spiegel ist etwa doppelt so hoch wie der cAMP-Gehalt. In SF295-Zellen hingegen liegt der Gehalt an cGMP um etwa die Hälfte niedriger als der cAMP-Spiegel und ist somit vergleichbar mit dem cGMP-Gehalt der SNB75-Zellen. Auch die intrazelluläre Konzentration von Ca2+ ist in der Zellinie SNB75 höher als in SF295-Zellen. Die Untersuchung ausgelöster Ca2+-Transienten – mit besonderem Augenmerk auf den capacitativen Ca2+-Einstrom (CCE) – ergab, daß in SNB75-Zellen die Kapazität der intrazellulären Ca2+-Speicher und die Geschwindigkeit der Speicherentleerung größer sind als in SF295-Zellen. Auch der CCE ist in SNB75-Zellen größer als in der Zellinie SF295. An den beiden humanen Glioblastomzellinien SNB75 und SF295 wurden mittels Cytotoxizitätstests verschiedene PDE-Hemmstoffe auf ihr wachstumshemmendes Potential untersucht. Für den PDE4-Inhibitor DC-TA-46 konnte ein IC50-Bereich von 3-4.5 µM für die Hemmung des Zellwachstums ermittelt werden. Der als PDE1-Hemmstoff eingesetzte CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wies einen IC50-Wert für die Wachstumshemmung von 2-3 µM auf. Ein Zusammenhang zwischen PDE1 bzw. PDE4-Expression der Zellinien und dem wachstumshemmenden Potential der eingesetzten Substanzen war nicht erkennbar. Zur weiteren Charakterisierung der Zellinie SNB75 wurden der Karyotyp und die Verdopplungszeit der Zellinie bestimmt. Weiterhin wurde die cDNA der PDE1C aus der humanen Biopsieprobe TB1365 (anaplastisches Astrocytom) kloniert und das rekombinante Protein transient überexprimiert. An der rekombinanten PDE1C wurden – neben der Stimulierbarkeit des Proteins durch Ca2+/CaM (+ 130 %) – die beiden PDE-Hemmstoffe DC-TA-46 und Vinpocetin getestet. Diese beiden Substanzen hemmten die Aktivität der rekombinanten PDE1C um durchschnittlich 42 % (DC-TA-46) bzw. 28 % (Vinpocetin). Ein in vitro-Tiermodell zur näheren Untersuchung der PDE-Ausstattung und cAMP-Homöostase von nicht-malignen ZNS-Zellen und Glioblastomzellen sollte aus subkultivierten Ratten-Astrocyten und der Ratten-Glioblastomzellinie C6 entwickelt werden. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, entgegen Daten für Keratinocyten (Marko et al., 1998), daß die PDE-Aktivität in nicht-malignen Ratten-Astrocyten deutlich höher liegt als in der Glioblastomzellinie C6. Die Ratten-Astrocyten zeigen eine höhere Ca2+/CaM-stimulierbare PDE1-Aktivität. In der Zellinie C6 hingegen ist der PDE4-Anteil im Vergleich zu Ratten-Astrocyten höher. Diese Ergebnisse werden durch RT-PCR-Versuche gestützt. Die Gehalte der „second messenger“ cAMP, cGMP und Ca2+ sind in nicht-malignen Ratten-Astrocyten und malignen C6-Zellen vergleichbar. Allerdings weisen die C6-Zellen einen größeren CCE auf. Der Einsatz von DC-TA-46 in Cytotoxizitätstests weist sowohl in Ratten-Astrocyten als auch in C6-Tumorzellen vergleichbare Hemmwirkungen (IC50-Wert ~ 1.5 µM) auf. Der CaM-Antagonist Calmidazoliumchlorid wirkt in subkultivierten Ratten-Astrocyten bereits in geringsten Konzentrationen wachstumshemmend; der IC50-Wert der Wachstumshemmung von C6-Zellen liegt bei 2.3 µM. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen allerdings, daß das untersuchte Ratten-Zellmodell – auch aufgrund der unterschiedlichen Kulturbedingungen, welche die PDE-Expression beeinflussen – nur mit Einschränkungen einsetzbar ist. Aufgrund der aktuellen Daten scheint die PDE1C als Target für eine anti-neoplastischen Therapie von ZNS-Tumoren kaum geeignet. Der Vergleich von nicht-malignen und malignen ZNS-Zellen deutet eher auf eine „down“-Regulation der PDE1C und eine „up“-Regulation der PDE4 hin. Dies konnte sowohl in humanen als auch in Rattenzellen gezeigt werden und müßte in weiteren Untersuchungen vertiefend untersucht werden.
Durch vorangegangene Arbeiten wurden transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die eine verringerte Aktivität des plastidären ATP/ADP Transporters aufweisen (NTT-antisense). Die Knollen dieser Pflanzen zeigen nicht nur veränderte Gehalte an Primärmetaboliten sondern auch eine erhöhte Pathogen-Resistenz, zum Beispiel gegen den bakteriellen Krankheitserreger Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). In diesem Zusammenhang deuten neuere Veröffentlichungen auf eine Bedeutung von Transportproteinen für Wirt-Pathogen Wechselwirkungen hin. Im Zuge dieser Arbeit konnte durch die Herstellung eines Systems zur gezielten Erzeugung von Eca „K.O.“-Mutanten die Bedeutung von ausgewählten Sequenzen, welche für Transportproteine kodieren, analysiert werden. Hierbei zeigte sich, dass im Bezug auf die Virulenz von Eca, sowohl der Prolin- als auch der d-Galaktonattransport nur von untergeordneter Bedeutung ist. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings der Karbonsäuremetabolismus und -transport von Eca als zentrales Element in der Entfaltung maximaler bakterieller Virulenz erkannt. Hierbei wurde das Cit1-Protein als hoch-affiner Citrattransporter, welcher über die bakterielle pmf energetisiert wird, identifiziert. Dieses Protein ist für ein Wachstum von Eca auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle notwendig und essentiell zur Etablierung einer vollständigen Pathogenese auf Kartoffelknollenscheibchen. So weisen Eca cit1 „K.O.“-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp Zellen nicht nur eine geringere pektolytische Aktivität und Gewebemazeration, sondern auch ein reduziertes in planta Wachstum, auf. Des Weiteren wurde ermittelt, dass sich NTT-antisense Gewebe nicht nur durch eine erhöhte Pathogen-Resistenz auszeichnet, sondern auch erniedrigte Citratgehalte aufweist. Analog führte eine artifizielle Erhöhung des Citratgehaltes durch Infiltration von Knollengewebe zu einer deutlich erhöhten Gewebemazeration durch Eca sowie einer verringerten Akkumulation von Abwehrrelevanten pflanzlichen Gentranskripten (PR-Gene). Weitere untersuchte Eca-Mutanten belegten, dass im gemeinsamen Wirken mit anderen enzymatischen Komponenten, Citrat ein ambivalentes Molekül für pflanzliche Resistenz und bakterielle Virulenz ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Transportproteine nicht nur für die Virulenz von Eca, sondern auch für phytopathogene Pilze wie Magnaporthe grisea, von Bedeutung sind. So konnte durch die Kooperation mit der AG Thines (IBWF) das Genprodukt eines bei Pathogenese induzierten Genes (rig2), biochemisch charakterisiert werden. Hierbei wurde mittels Komplementation einer Hefemutante (22∆8AA) nachgewiesen, dass es sich bei diesem Protein um einen Prolin-Transporter handelt. Diese Arbeit zeigt, dass Transportproteine als ein wichtiges Element in Wirt-Pathogen Beziehungen wirken können und eine Charakterisierung solcher Proteine zum Verständnis dieser Wechselwirkungen unerlässlich ist.
Untersuchungen zur Struktur und Spezifität der Phycobiliproteinlyase CPES aus Guillardia theta
(2020)
Cryptophyten verwenden neben Chlorophyll zusätzliche Lichtsammelproteine für die Photo-synthese – die Phycobiliproteine (PBP). In Cyanobakterien, Rotalgen und Glaukophyten sind PBP ebenfalls ubiquitär verbreitet. Für den Zweck der Lichtsammlung tragen die PBP- Untereinheiten kovalent gebundene offenkettige Tetrapyrrol-Chromophore an konservierten Cysteinresten. Diese Phycobiline sind in der Lage, grünes Licht zu absorbieren und es für die Photosynthese zur Verfügung zu stellen. Die Fähigkeit zur Photosynthese erlangten Crypto-phyten bei der sekundären Endosymbiose durch Aufnahme einer früheren Rotalge. Die evolutionäre Entwicklung brachte schließlich modifizierte PBP hervor. In Gegensatz zu ande-ren Organismen liegen die PBP in Cryptophyten in löslicher Form im Thylakoidlumen des Plastiden vor. Cryptophyten besitzen lediglich einen Typ an PBP, Guillardia theta verwendet Phycoerythrin PE545. Die α-Untereinheiten sind jeweils mit einem Molekül 15,16-Dihydrobi-liverdin (DHBV) und die β-Untereinheiten mit drei Molekülen Phycoerythrobilin (PEB) chromophoryliert. Die Chromophorylierung cryptophytischer Apo-PBP ist bisher wenig un-tersucht und verstanden. Aus Cyanobakterien ist jedoch bekannt, dass die Chromophorylie-rung häufig mit Hilfe von Phycobiliproteinlyasen (PBP Lyasen) stattfindet, welche die Phyco-bilinübertragung unterstützen.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der eukaryotischen S-Typ-PBP Lyase GtCPES aus G. theta. Mittels Fluoreszenzspektroskopie und Zink-induzierter Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass GtCPES den Transfer von 3(Z)-PEB auf Cys82 der PBP-β-Untereinheit aus Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB) vermittelt. An der PEB-Bindung sowie am -Transfer beteiligte Aminosäuren wurden mit Hilfe Zielgerichteter Muta-genese identifiziert. Anhand spektroskopischer Binde- und Transferstudien mit den Protein-varianten wurden drei Aminosäuren in der Ligandenbindetasche ermittelt, die relevant für die Bindung sind (Trp69, Glu136, Glu168). Diese koordinieren vermutlich PEB in der Bindetasche und stabilisieren somit die Konformation. Zusätzlich konnten zwei im PEB-Transfer involvierte Aminosäuren eindeutig identifiziert werden (Trp75, Ser150). Trp75 kommt dabei eine essenzielle Bedeutung für den Transfer zu. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Met67 für die auf PEB und DHBV beschränkte Substratspezifität von GtCPES verantwortlich ist. Die Variante GtCPES_M67A bindet sowohl PEB als auch das rigide Phycocyanobilin (PCB) stabil unter Bildung eines farbigen Komplexes in vitro und in vivo in Escherichia coli. GtCPES_M67A scheint zudem in der Lage zu sein, PCB auf geeignete Apo-Proteine zu transfe-rieren. Neben der sterischen und elektrostatischen Umgebung entscheidet damit zusätzlich die Substratspezifität der PBP Lyase über die gebundenen Chromophore am PBP.
Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.
Die Entwicklung eines neuartigen Therapiekonzeptes erfordert umfangreiche Prüfungen insbesondere für die Sicherheit der Anwendung am Menschen. Die Verwendung des apathogenen, onkoselektiven, replikationskompetenten Parvovirus H-1 (H-1PV) zur onkolytischen Virotherapie bei bösartigen Hirntumoren (Glioblastome) ist eine vielversprechende Alternative (oder Ergänzung) zu den bisherigen Therapien, wie Operation, Chemotherapie und Bestrahlung. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass H-1PV in der Lage ist, nach einmaliger intratumoraler oder mehrfacher intravenöser Applikation im Rattengliom-Modell eine vollständige Regression des Tumors ohne pathologische Nebenwirkungen herbeizuführen. In Vorbereitung einer klinischen Studie Phase I/IIa mit H-1PV wurden in dieser Arbeit wichtige Aspekte dieser neuartigen Virotherapie untersucht:
1. Ausscheidung und Übertragung von H-1PV in vivo in der Ratte
Es konnte gezeigt werden, dass infektiöse Viren in Urin und Speichel unabhängig von der Applikationsart und der Anwesenheit eines Tumors ausgeschieden werden, was bedeutet, dass eine Übertragung von H-1PV durch Tröpfcheninfektion stattfinden könnte. In klinischen Studien muss daher geprüft werden, ob das Virus auch vom Menschen ebenso im Urin und Speichel ausgeschieden wird.
2. Intranasale Applikation von H-1PV zur Behandlung von Glioblastomen in der Ratte
Es konnte gezeigt werden, dass H-1PV auch nach intranasaler Applikation den Tumor erreicht, dort virale Proteine gebildet werden und in infizierten tumortragenden Tieren die Überlebenszeit signifikant verlängert werden konnte im Vergleich mit den nicht-infizierten Kontrolltieren. Diese Applikationsart wäre eine einfach durchzuführende Art der Anwendung, da sie keinen chirurgischen Eingriff am Gehirn erfordert.
3. Replikation von H-1PV in vivo im Rattenmodell
Durch die Fähigkeit von H-1PV in Tumorzellen repliziert zu werden, können nach einer einzigen Virusapplikation einer geringen Dosis initial nicht infizierte Zellen der Tumormasse infiziert und lysiert werden. In vivo im Rattengliom-Modell konnte gezeigt werden, dass H-1PV zunächst im ganzen Organismus verteilt wird, nach kurzer Zeit aber im Tumorgewebe angereichert und die Viruskonzentration dort länger aufrecht erhalten bleibt als bei Tieren ohne Tumor. Die Expression des viralen, zytotoxischen Proteins NS-1 war bei allen Applikationsarten auf das Tumorgebiet beschränkt. Die Daten sprechen für eine zumindest begrenzte Vermehrung von H-1PV im Tumorgewebe.
4. Adaptierung von H-1PV an humane Glioblastomzellen
H-1PV gehört zu der Gruppe der Nager-Parvoviren und wird daher in Rattentumorzellen effizienter vermehrt als in humanen Glioblastomzellen. In dieser Arbeit wurden durch Passagieren an eine humane Glioblastomzelllinie adaptierte virale Einzelklone von H-1PV in verschiedenen humanen Glioblastomzellen charakterisiert. Alle Klone konnten sich stärker in diesen vermehren und diese effizienter lysieren. In vivo führte einer der Klone zu einem signifikant langsameren Tumorwachstum und verlängerter Überlebenszeit der Tiere im Vergleich zum Wildtyp. Bei der Analyse der genetischen Mutationen der Klone konnten verschiedene Alterationen detektiert werden, wobei sich die Mutationsgeschwindigkeit von H-1PV als eher gering erwies, was für eine sichere Anwendung von H-1PV beim Menschen ein Vorteil ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Onkoselektivität von H-1PV durch die Adaptierung nicht verloren ging, was bedeutet, dass auch die adaptierten viralen Klone weiterhin apathogen für nicht transformierte Zellen sind.
Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zur Erprobung von H-1PV im Hinblick auf die klinische Anwendung im Menschen. H-1PV erwies sich als einfach zu applizierendes, in vivo replikationskompetentes, sicheres und anpassungsfähiges Virus für die onkolytische Virotherapie von Gliomen beim Menschen. Dass H-1PV seine Onkoselektivität durch Adaptation an humane Gliomzellen nicht einbüßte, eröffnet die Möglichkeit das Virus an weitere Krebsentitäten anzupassen und auch dort zur onkolytischen Therapie einzusetzen.
Sepsis ist eine lebensbedrohliche Infektion, welche eine der häufigsten Todesursachen bei Patienten der Intensivstation ist. Die Mortalität des septischen Schocks hat sich während der letzten 25 Jahre trotz Verbesserung lebenserhaltender Maßnahmen nicht wesentlich verringert. Bei der Sepsis lösen externe Faktoren (die invadierenden Mikroorganismen) die Erkrankung aus, körpereigene Reaktionskaskaden jedoch entscheiden letztlich über den Verlauf, der in der Sepsis ein sehr heterogenes Erscheinungsbild zeigen kann. Darum führt eine allein gegen den Mikroorganismus gerichtete Therapie bei der Sepsis häufig nicht zum Erfolg. Eine therapeutische Intervention in körpereigene Abläufe setzt jedoch voraus, dass diese Vorgänge, die involvierten Proteine sowie die molekularen Mechanismen bekannt sind. Da klinische Studien darauf hinweisen, dass während der Pathogenese der Sepsis eine aktivierungsabhängige, exzessive Verminderung der T-Lymphozyten im Blutbild (Lymphopenie) infolge verstärkter Apoptose auftritt und damit die Abwehr der Pathogene negativ beeinträchtigt wird, bildeten Untersuchungen an aktivierten T-Zellen den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Aktivierte T-Lymphozyten sind wichtige Zellen der natürlichen Immunantwort und spielen eine entscheidende Rolle im Verlauf von Infektionserkrankungen. Eine therapeutische Modulation ihrer Apoptose könnte die Ereigniskaskade früh unterbrechen und möglicherweise den dramatischen klinischen Verlauf der Sepsis dämpfen. Der Befund der Lymphopenie in Sepsis führte mich zu der Hypothese dieser Arbeit, dass PPARg hierfür verantwortlich sein könnte, da eine Aktivierung von PPARg nicht nur antiinflammatorisch, sondern auch proapoptotisch wirken kann. Eine diesbezügliche Verbindung zwischen Lymphopenie bei Sepsis und PPARg-Expression wurde noch nicht untersucht. Deshalb habe ich im Rahmen dieser Arbeit analysiert, inwieweit PPARg zur Lymphopenie von T-Zellen septischer Patienten beiträgt. Den Ausgangspunkt bildeten dabei Untersuchungen an aktivierten T-Zellen. Sowohl an der T-Zelllinie Jurkat, als auch an primären CD3+ T-Zellen konnte ich Folgendes zeigen: 1. Die Aktivierung von humanen T-Zellen mit dem T-Zell-Mitogen PHA induziert die Expression des Liganden-abhängigen Transkriptionsfaktors PPARg, führt jedoch nicht autokrin zu dessen Aktivierung. 2. Physiologische Mediatoren wie Stickstoffmonoxid oder synthetische PPARg-Liganden wie Ciglitazon bewirken eine Aktivierung von PPARg in den PHA-aktivierten T- Zellen. 3. Der durch spezifische Agonisten aktivierte Transkriptionsfaktor PPARg ruft in aktivierten T-Zellen Apoptose hervor. 4. SR-202 greift in die PPARg-vermittelte Apoptose ein. Die Vorinkubation mit diesem spezifischen PPARg-Antagonist führt zu einer verminderten Apoptose der aktivierten T-Zellen. 5. Fas-vermittelte Apoptose ist der am besten untersuchte Apoptose-auslösende Reaktionsweg in T-Zellen. Vorliegende Untersuchungen mit einem anti-Fas-neutralisierenden Antikörper zur näheren Charakterisierung der PPARg-vermittelten Apoptose verweisen jedoch auf Fas-unabhängige Mechanismen. Um die klinische Relevanz der Daten zu prüfen, versuchte ich, die Ergebnisse auf das Modell der Sepsis zu übertragen. Folgende Zusammenhänge ließen sich dabei erkennen: 1. Es ist bekannt, dass die T-Lymphozyten im septischen Geschehen im Vergleich zum gesunden Spender deutlich vermindert sind. Dies ist in Übereinstimmung mit meinen Befunden. Zusätzlich bestätigte sich die Annahme, dass der Zelltod apoptotisch, also gerichtet, verläuft. 2. In den T-Zellen der septischen Patienten ist im Gegensatz zu den T-Zellen gesunder Probanden die Expression von PPARg erhöht, so dass, aufbauend auf die Vorversuche an aktivierten T-Zellen, eine PPARg-vermittelte Apoptose postuliert werden konnte. 3. Die Zugabe von PPARg-Agonisten zu den septischen T-Zellen erhöht die Apoptose, während die Vorinkubation mit dem Antagonisten SR-202 vor der Agonisten-Behandlung die Apoptose hemmt. 4. Basierend auf Untersuchungen mit einem Fas-neutralisierenden Antikörper, ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose in septischen T-Zellen ebenfalls Fas-unabhängig sind. In Erkrankungen, deren Verlauf wie bei der Sepsis durch Lymphopenie gekennzeichnet ist, könnte der hier aufgezeigte Mechanismen der PPARg-vermittelten Apoptose von pathophysiologischer Signifikanz sein. Das bessere Verstehen der Signaltransduktionswege, die zu der PPARg-Expression sowie der PPARg-abhängigen Apoptose in aktivierten T-Zellen führen, könnten eine Basis für neue therapeutische Strategien im Kampf gegen die Sepsis bilden. Erste Anhaltspunkte dafür liefert der Nachweis der Modulation der T-Zell-Apoptose durch den spezifischen PPARg-Antagonist SR-202.