Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
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Der kausale Zusammenhang zwischen der Dominanz von Mikroflechten gegen über Makroflechten in Tieflandregenwäldern war nicht bekannt und wird in vorliegender Studie erörtert. In der Literatur wird eine unvorteilhafte Kombination von hohen Temperaturen, niedrigen Lichtintensitäten und hoher Feuchtigkeit für die weitgehende Abwesenheit von Makroflechten in tropischen Tieflandregenwäldern verantwortlich gemacht. Aufgrund der hohen Abundanz in diesen Habitaten, kann diese Aussage für krustige Flechten nur bedingt zutreffen. Es wurden eine Reihe von Arbeitshypothesen entwickelt, die klären sollten, ob corticole Grünalgenflechten bestimmte funktionelle Lebensstrategie aufweisen, in welcher Weise das Mikroklima ihren Stoffwechselprozess beeinflusst, und warum sie im tropischen Tiefland-Regenwald dominieren. Die Fragenstellungen wurden unter Verwendung von ökophysiologischen Methoden in vivo und in situ in einem für die Flechten mikroklimatisch unvorteilhafte, tropischen immergrünen Tieflandregenwald im National Park Les Nouragues (Französisch-Guyana) untersucht. Aufgrund des intensiven Kontakts mit ihrem Substrat werden corticole Flechten stark von den mikroklimatischen Bedingungen des Phorophyten beeinflusst. Sie zeigen morphologisch-anatomische Anpassungen, die einen physiologisch vorteilhaften Zustand zwischen Wasserübersättigung und Austrocknung ermöglichen. Ihre Photosynthese ist an niedrige Lichtintensitäten angepasst und nutzt unterschiedliche Lichtqualitäten aufgrund physiologischer Strategien verschieden aus. Weitere Ergebnisse zeigten dass Krustenflechten neben funktionellen morphologisch-anatomischen und physiologischen Strategien, auch durch ein hohes Oberflächen zu Volumen Verhältnis, durch ein hohes Biomassenverhältnis des Photobionten zum Mycobionten und wahrscheinlich durch die Fähigkeit, saprophytisch Kohlenstoff zu gewinnen, befähigt sind, mikroklimatisch unvorteilhafte Habitate, wie die eines tropischen Tieflandregenwaldes, zu besiedeln
Der erhebliche Anstieg an Penicillin-resistenten Bakterienstämmen stellt ein weltweit immer größer werdendes Problem in der Medizin dar. Für die Bekämpfung solcher resistenten Stämme ist es wichtig, die Entstehung und den Mechanismus der Penicillin-Resistenz auf molekularer Ebene zu verstehen und dadurch Targets für neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zu identifizieren. Die Lösung dieser Problemstellung war somit der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit. Die Arbeit befasste sich mit der Übertragung der beta-Laktam-Resistenz von einem hochresistenten klinischen S. oralis Isolat aus Ungarn auf den sensitiven S. pneumoniae R6 Stamm. Dabei sollte durch Transformationsexperimente überprüft werden, ob und wie weit S. oralis als Donor für die Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae fungieren kann und welche Gene dabei eine Rolle spielen. Solche Experimente bilden die Grundlage für das bessere Verständnis der Evolution und Ausbreitung der beta-Laktam-Resistenz in kommensalen und pathogenen Streptokokken. Durch sukzessive DNA-Transformation konnte der Resistenzphänotyp des Donorstammes zu einem hohen Grad in den sensitiven S. pneumoniae Stamm R6 übertragen werden. Von Interesse war zunächst, welche S. oralis PBPs dabei eine Rolle spielen. Für die bekannten Resistenzdeterminanten PBP2x, PBP2b und PBP1a konnte nachgewiesen werden, dass sie auch hier einen entscheidenden Beitrag für die Resistenzentwicklung leisten. Nach insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Transformationsstufen mit chromosomaler S. oralis DNA konnte das Resistenzniveau des Rezipienten ca. 600- bis 700-fach erhöht werden; PBPs waren nur bei den ersten drei Stufen beteiligt. Microarray-Analysen mit DNA der Transformanten gaben Hinweise darauf, welche anderen Gene übertragen wurden und erlaubten in einem Fall die Identifizierung einer neuen Resistenzdeterminante: MurE. Die gesamte Resistenz des Donors konnte nicht in S. pneumoniae übertragen werden; die Gründe hierfür sind denkbar vielfältig und wurden in der Diskussion aufgegriffen. Die Charakterisierung der Nicht-PBP-Resistenzdeterminate MurE standen nach deren Identifizierung im Mittelpunkt der Analysen in der vorliegenden Arbeit. Die Selektion von beta-Laktam-resistenten Transformanten mit modifiziertem MurE zeigten zum ersten Mal die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung der Penicillin-Resistenz in S. pneumoniae. Austausche in diesem Gen führten zu einer ca. 3- bis 5-fachen Erhöhung der Resistenz gegenüber Cefotaxim und Piperacillin und bewirkten einen 40-fachen Anstieg der Cefotaxim-Resistenz und 20-fachen Anstieg der Oxacillin-Resistenz in Verbindung mit einem Mosaik-PBP2x. In Verbindung mit einem Mosaik-PBP2b führte das ausgetauschte MurE zu einem 20-fachen Anstieg der Piperacillin-Resistenz. Durch Herstellung von Stämmen mit ektopischer Kopie von murE mit unterschiedlichen Promotor- und Genfragmenten und anschließender Deletion des Wildtyp-Allels im Genom konnte nachgewiesen werden, dass sowohl veränderte Bereiche im Strukturgen als auch der murE-Promotorbereich von S. oralis Uo5 zu einem Anstieg der Resistenz in S. pneumoniae führen. Einige der Veränderungen, die Aminosäuren betreffen, sind in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert und könnten die Bindung zum Substrat bzw. ATP beeinflussen. Die Bestimmung der Promotoraktivität von murE aus S. oralis Uo5 und S. pneumoniae R6 ergab, dass das Gen aus S. oralis etwa zweifach stärker exprimiert wird. Die stärkere Expression von murE hat allerdings keinen Einfluss auf die Produktion von PBP2x, PBP1a oder PBP2b, wie durch spezifische Antikörper und Western-Blots für alle drei PBPs festgestellt werden konnte. Dies konnte auch mit Hilfe von Reporter-Assays zur Bestimmung der Promotoraktivität von pbp2x bestätigt werden. Signifikante Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung der murE-Transformanten konnten ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine Hypothese geht davon aus, dass sowohl die erhöhte Promotoraktivität als auch die Mutationen im Strukturprotein dasselbe bewirken, nämlich die Bereitstellung von mehr MurE-Produkt (durch mehr Enzym oder durch aktiveres Enzym). Möglicherweise ist dadurch der Pool an Muropeptidvorstufen erhöht, was wiederrum Einfluss auf die Mureinbiosynthese hat und somit ein besseres Wachstum in Gegenwart von beta-Laktamen erlaubt, d.h. unter den hier verwendeten Selektions- und Testbedingungen.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde Knochenmarksmaterial von 110 Leukämiepatienten auf das Vorliegen von p53-Gen-Deletionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Interphasezellkerne als auch Metaphasen der Leukämiezellen mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) mit der p53-Gen-Sonde untersucht. Dabei konnte in keinem der 55 untersuchten Patienten mit lymphatischer Leukämie eine Alleldeletion des p53-Gens nachgewiesen werden. Da die p53-Gen-Deletion nach den Literaturangaben bei etwa 7% der Patienten mit lymphatischer Leukämie vorkommt, widersprechen die eigenen Ergebnisse diesen Angaben. Als Grund kann die zu geringe Anzahl der untersuchten Fälle genannt werden. Bei den 55 hier untersuchten Patienten, die an myeloischer Leukämie erkrankt waren, konnte in 7 Fällen (13%) eine Deletion im p53-Gen mittels FISH nachgewiesen werden. Der Anteil der gefundenen p53-Gen-Deletionen war deutlich höher als aufgrund der Literaturangaben erwartet. Die sieben Patienten, bei denen eine p53-Gen-Deletion nachgewiesen wurde, waren alle an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt. Alle Patienten, die eine p53-Gen-Deletion aufwiesen, zeigten auch einen numerisch und strukturell aberranten Karyotyp. Im zweiten Arbeitsabschnitt wurden Knochenmarkszellen von 21 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen mittels spektraler Karyotypisierung (SKY) untersucht und mit dem zytogenetischen Routinebefund verglichen. Ziel der Untersuchung war die Identifizierung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen, die durch die konventionelle zytogenetische Untersuchung nicht identifiziert werden konnten. Bei 17 (81%) der Fälle wurden durch SKY zusätzliche Chromosomenaberrationen festgestellt. Nur bei 4 (19%) der Fälle wurde der zytogenetische Befund bestätigt. Im dritten Arbeitsabschnitt wurden Meningeome untersucht. Bei 22 Meningeomen (17 benigne und 5 atypische Meningeomen) wurde mittels Interphase-FISH nach einer Alleldeletion des p53-Gens gesucht. Es konnte jedoch in keinem Fall eine solche Deletion nachgewiesen werden. Weiterhin wurden bei 24 Meningeomen 96 frische Biopsieproben von verschiedenen Tumorarealen mit G-Bänderungstechnik zytogenetisch analysiert. Zur besseren Aufklärung komplex aberranter Karyotypen wurden zwei Fälle (Nr. 1 und Nr. 7) auch mittels SKY-Analyse untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob zytogenetische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors vorliegen. Es gab bei 13 von 24 Meningeomen (54%) zytogenetische Unterschiede zwischen den verschiedenen Arealen innerhalb eines Tumors. 24 (83%) von 29 Meningeomen wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft und 5 (17%) von 29 Meningeomen in den Tumorgrad II. Die Tumorgradverteilung in dieser Arbeit entspricht den Literaturangaben. 13 von 24 Tumoren wiesen entweder einen normalen Karyotyp oder nur eine Monosomie 22 auf. Alle 13 Tumoren wurden nach der WHO-Klassifikation von Meningeomen in den Tumorgrad I eingestuft. Vier Meningeome wiesen stark aberrante Karyotypen auf, was vermutlich ein Zeichen für die Tumorprogression darstellt. Es wurde auch untersucht, ob eine Korrelation zwischen dem zytogenetischen und histologischen Befunden vorliegt. In der vorliegenden Arbeit hat bei sechs Fällen der histologische Befund nicht mit dem zytogenetischen Befund übereingestimmt, da die Tumore in den Tumorgrad I eingestuft wurden, der zytogenetische Befund aber einen aberranten Chromosomensatz aufwies, der normalerweise nicht bei niedriggradigen Meningeomen, sondern bei atypischen und anaplastischen Meningeomen vorkommt. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination verschiedener zytogenetischer und molekularzytogenetischer Methoden zur Charakterisierung Chromosomaler Aberrationen bei Meningeomen sinnvoll ist.
Im Verlauf dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression des tonoplastidären Dicarboxylat Transporters zu einem erhöhten Gehalt an Malat bei gleichzeitig vermindertem Citratgehalt in den Überexpressions-Pflanzen führt. Somit konnte, ähnlich wie in den k.o.-Pflanzen, ein reziprokes Verhalten von Citrat und Malat aufgezeigt werden.
Elektrophysiologische Analysen an Oozyten von X. laevis in Zusammenhang mit Aufnahmeversuchen an Proteoliposomen zeigten weiterhin, dass der Transport von Citrat ebenfalls durch den TDT katalysiert wird. Anhand eines negativen Einwärts-Strom an Oozyten konnte gezeigt werden, dass dieser Citrat-Transport elektrogen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Citrat2-H die transportierte Form von Citrat darstellt. Dieses wird vermutlich zusammen mit drei Protonen transportiert.
Die Dianionen Malat und Succinat, sowie höchstwahrscheinlich auch Fumarat, werden ebenfalls über den TDT transportiert. Unter Standardbedingungen werden diese in die Vakuole importiert. Im Gegenzug wird Citrat aus der Vakuole exportiert. Die trans-stimulierende Wechselwirkung von Malat, Succinat und Fumarat auf den Citrat Transport und vice versa bestärkt den in dieser Arbeit postulierten Antiport der jeweiligen Carboxylate über den Tonoplasten. Dieser ist jedoch nicht obligat, was an dem verringerten Transport von Citrat ohne Gegensubstrat über die Membran gezeigt werden konnte.
Unter Trockenstress und osmotischen Stress konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die erhöhte Expression des TDT maßgeblich an der Akkumulation von Malat und der Mobilisierung von Citrat unter den genannten Stressbedingungen beteiligt ist.
Letztlich konnte mittels Säurestressexperimenten nachgewiesen werden, dass die Malatakkumulation, bei gleichzeitigem Citrat Abbau nicht zwingend miteinander gekoppelt sind, unter Säurestress müssen daher weitere regulatorische Effekte auf den Malat-Import bzw. den Citrat-Export vorherrschen.
Verteilung von Na+/Ca2+-Austauschern während der Ontogenese des auditorischen Hirnstamms der Ratte
(2009)
Die Homöostase der intrazellulären Ca2+-Konzentration ist eine essenzielle Aufgabe in allen Zellen, da Ca2+ an diversen zellulären Prozessen beteiligt ist. Besonders Neurone des auditorischen Hirnstamms sind auf eine optimale Ca2+-Regulation angewiesen, da ihr Überleben und ihre Entwicklung von der intrazellulären Ca2+-Konzentration abhängen. Neben Ca2+-bindenden Proteinen und Ca2+-ATPasen sind besonders Na+/Ca2+-Austauscher, welche sich in die Familien NCX (NCX1-3), NCKX (NCKX1-5) und CCX (NCKX6) gliedern, in vielen neuronalen und nicht-neuronalen Strukturen maßgeblich für die Ca2+-Regulation verantwortlich. In meiner Arbeit wurde die Verteilung von NCX1-3 sowie NCKX2-6 im Nucleus cochlearis(CN), superioren Olivenkomplex (SOC) und inferioren Colliculus (IC), welche Strukturen des auditorischen Hirnstamms darstellen, untersucht. Dies erfolgte auf Boten-Ribonukleinsäure(messenger ribonucleic acid, mRNA)-Ebene qualitativ mittels reverser Transkription (RT)gefolgt von genspezifischer Polymerasekettenreaktion (PCR) sowie quantitativ mittels realtime-PCR, auf Proteinebene qualitativ mittels Immunhistochemie. Um auch ontogenetische Aspekte der Ca2+-Homöostase zu berücksichtigen, wurden Ratten in einem unreifen Entwicklungsstadium (P4) sowie junge adulte Ratten (P60) analysiert. Die Genexpression aller untersuchten ncx- und nckx-Isoformen wurde mittels RT-PCR in beiden Entwicklungsstadien in CN, SOC und IC nachgewiesen. Besonders auffallend war bei den ncx-Isoformen eine im Verlauf der Entwicklung meist verstärkte Transkription, während die nckx-Isoformen in den meisten Fällen eine verminderte Transkription im adulten Tier zeigten. Mittels Immunhistochemie zeigt meine Arbeit zum ersten Mal eine entwicklungsabhängige Umverteilung der Austauscher. Während die Isoformen bei P4 hauptsächlich im Neuropil lokalisiert waren, zeigte sich im Gegensatz dazu bei P60 eine verstärkte Immunfluoreszenz innerhalb der Somata. Ausnahme war hier NCKX2, welcher im CN auch bei P60 hauptsächlich im Neuropil exprimiert wurde. Die Expression von NCX1-3 und NCKX2 im Neuropil junger auditorischer Hirnstammneurone legt eine Ca2+-regulierende Funktion im Bereich dendritischer Synapsen nahe. Die Synapsen befinden sich in diesem Alter noch in einem unreifen Zustand, so dass die Na+/Ca2+-Austauscher einen maßgeblichen Einfluss auf die synaptische Plastizität ausüben können. Abschließend deutet die Verteilung der Na+/Ca2+-Austauscher darauf hin, dass alle NCX- und NCKX-Isoformen, im Zusammenspiel mit weiteren Ca2+-regulierenden Proteinen, an der Ca2+-Homöostase in den Strukturen des auditorischen Hirnstamms beteiligt sind.
Die hier vorgelegte Arbeit konzentrierte sich auf den vakuolären Ribonukleinsäure- (RNA) Abbau in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) und die Integration in den Nukleotid- Metabolismus unter Berücksichtigung von Nukleosidtransportprozessen. Insbesondere die physiologische Bedeutung des Verlustes der RNS2-Aktivität auf die vakuolären RNA-Abbauprozesse sollte untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass RNS2 den größten Anteil an der vakuolären Ribonuklease- (RNase-) Aktivität ausmacht, wobei die Restaktivität von circa 30 Prozent ein Hinweis auf mindestens eine weitere vakuoläre RNase ist. Die vakuolären Adenylatgehalte, Abbauprodukte der RNA, in RNS2-T-DNA-Insertionslinien zeigten, dass RNS2, ähnlich wie die intrazellulären RNasen in L. esculentum, 2‘,3‘-zyklische Nukleotidmonophosphate (2‘,3‘-cNMPs) produzieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass in diesen Linien die vakuolären Enzyme sowohl RNA, als auch 2‘,3‘-cNMPs langsamer abbauen als vakuoläre Enzyme aus Wildtyp-Pflanzen. Die Akkumulation dieses zyklischen Intermediates des RNA-Abbaus lässt darauf schließen, dass die Transphosphorylierung schneller verläuft als die Hydrolyse (Abel & Glund, 1987; Löffler et al., 1992; Nürnberger et al., 1990). Es kann angenommen werden, dass ein weiteres Enzym, wie etwa eine zyklische Phosphodiesterase oder eine weitere Ribonuklease, an der Hydrolyse beteiligt ist. Ein weiterer Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der wichtigen Frage der Qualität von Vakuolenisolationen. Protoplastenkontaminationen konnten mikroskopisch ausgeschlossen werden. Die chloroplastidäre Verunreinigung war mit circa 5 Prozent gering, die cytosolische Kontamination lag jedoch je nach Isolationsmethode bei bis zu 30 Prozent im Vergleich zu Protoplasten. Es konnte darüber hinaus erstmals durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden, dass Vakuolen RNA besitzen. Diese Oligonukleotide sind vornehmlich kleine Fragmente im Größenbereich bis 50 nt.
Next Generation Sequencing ermöglichte eine detaillierte Analyse von cDNA- Bibliotheken, gewonnen aus vakuolärer RNA. Diese Technik wurde unter anderem angewandt, um die Reliabilität des Experimentes zu untersuchen. Es zeigte sich eine große Varianz in der Verteilung der Counts auf die verschiedenen RNA-Loci innerhalb biologischer Replikate und unterschiedlicher Vakuolenisolationsmethoden. Erstmals konnte jedoch gezeigt werden, dass circa 70 Prozent der RNA-Fragmente in der
Vakuole von mRNA stammen. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass der Abbau der wenigen rRNA-Transkripte in diesem Organell verstärkt abläuft.
In A. thaliana existiert mit ENT7 lediglich ein Vertreter, der einen Export von RNA- Abbauprodukten aus der Zelle ermöglicht. Da er den namensgebenden Vertretern aus dem Reich der Säugetiere strukturell und funktionell ähnelt, ist ENT7 ein geeignetes ENT-Protein für zukünftige Kristallisations- und Strukturanalysen. In dieser Arbeit konnte ENT7-eGFP in Pichia pastoris mit großer Ausbeute (2 mg Protein pro Liter Hefekultur) synthetisiert und in stabiler Form gereinigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ENT7 ohne eGFP ebenfalls stabil und als Dimer vorliegt. Durch Bindungsstudien erfolgte der Nachweis der erfolgreichen Bindung an bekannte Substrate. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass neben Nukleosiden auch Nukleobasen, aber nicht ATP gebunden werden.
Die vorliegende Arbeit gliedert sich in die drei Themenschwerpunkte FICTION-Technik (Fluorescence-Immunophenotyping and Interphase Cytogenetic as a Tool for Investigation of Neoplasms), SKY-Technik (Spectral Karyotyping) und Kultivierungsverfahren. Mittels der FICTION-Technik konnte gezeigt werden, dass die Trisomie 12 bei 53 untersuchten B-CLL-Patienten mit etwa 11% deutlich seltener auftrat, als in der Literatur beschrieben. Es scheint eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer Trisomie 12 und einer atypischen B-CLL vorzuliegen, da drei der sechs Fälle mit Trisomie 12 eine atypische B-CLL Variante darstellten. Bei einem Fall konnte der Trisomie 12 tragende Klon über 13 Monate beobachtet werden und zeigte in diesem Zeitraum keine signifikante Veränderung. Der Klon blieb weitestgehend stabil. Eine aus Vorversuchen von Doris Herrmann vermutete Existenz einer Monosomie 12 bei B-CLL-Patienten (persönliche Miteilung) hat sich nicht bestätigt. Bei allen untersuchten Proben lagen die Zellen mit Monosomie 12 unter dem ermittelten cut off level von 10,2% für die Hybridisierung. Als zweiter Schwerpunkt wurde die Einsatzfähigkeit der SKY-Technik in der Tumorzytogenetik durch die Analyse von 20 Tumorfällen ausgetestet. Unter den 20 untersuchten tumorzytogenetischen Fällen konnte bei 12 der durch G-Bänderung erhobene Befund verbessert und erweitert werden. Bei drei Fällen wurden neue, in der G-Bandenanalyse nicht gefundene Aberrationen identifiziert und in fünf Fällen bestätigte sich der G-Bandenbefund. Die SKY-Technik erwies sich als wertvolle Methode zur weiteren Charakterisierung von komplex aberranten Karyotypen oder zur Identifikation von Markerchromosomen, wobei nicht alle Aberrationen aufklärt werden konnten. Unter den 20 untersuchten Fällen wurde bei zwei myeloischen Erkrankungen neben einer Monosomie 7 die Translokation t(3;21)(q26;q22) gefunden. Möglicherweise kommt diese häufiger als bisher beschrieben in myeloischen Erkrankungen vor, weil sie durch die G-Bandenanalyse nicht sicher erkannt wird. Vorzugsweise scheint sie neben einer Monosomie 7 aufzutreten. In dem Schwerpunkt, der sich mit der Kultivierung von neoplastischen B-Zellen beschäftigte, konnte ein neues Kultivierungsverfahren für B-Zellen entwickelt werden. Eine Kultivierung mit MP-6 Zellen konditioniertem ISCOVE-Medium und dem Phorbolester TPA zeigte in 15 von 20 Proben einen synergistischen Effekt auf die Proliferationssteigerung (um das 1,5-21 fache) gegenüber dem TPA-Standardansatz in RPMI-Medium. Durch eine Metaphasenanalyse von fünf Fällen mit numerischen Mosaikbefunden konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen aberranten und normalen Klonen bei beiden Kultivierungsarten etwa gleich blieb. Eine Lebend-Tot-Bestimmung vor und nach der Kultivierung zeigte, dass nach 72-stündiger Kultivierung in den Kulturen mit dem höchsten Mitoseindex die durchschnittlich Lebendzellzahl am geringsten (ca. 70%) war.
Untersuchungen zur Struktur und Spezifität der Phycobiliproteinlyase CPES aus Guillardia theta
(2020)
Cryptophyten verwenden neben Chlorophyll zusätzliche Lichtsammelproteine für die Photo-synthese – die Phycobiliproteine (PBP). In Cyanobakterien, Rotalgen und Glaukophyten sind PBP ebenfalls ubiquitär verbreitet. Für den Zweck der Lichtsammlung tragen die PBP- Untereinheiten kovalent gebundene offenkettige Tetrapyrrol-Chromophore an konservierten Cysteinresten. Diese Phycobiline sind in der Lage, grünes Licht zu absorbieren und es für die Photosynthese zur Verfügung zu stellen. Die Fähigkeit zur Photosynthese erlangten Crypto-phyten bei der sekundären Endosymbiose durch Aufnahme einer früheren Rotalge. Die evolutionäre Entwicklung brachte schließlich modifizierte PBP hervor. In Gegensatz zu ande-ren Organismen liegen die PBP in Cryptophyten in löslicher Form im Thylakoidlumen des Plastiden vor. Cryptophyten besitzen lediglich einen Typ an PBP, Guillardia theta verwendet Phycoerythrin PE545. Die α-Untereinheiten sind jeweils mit einem Molekül 15,16-Dihydrobi-liverdin (DHBV) und die β-Untereinheiten mit drei Molekülen Phycoerythrobilin (PEB) chromophoryliert. Die Chromophorylierung cryptophytischer Apo-PBP ist bisher wenig un-tersucht und verstanden. Aus Cyanobakterien ist jedoch bekannt, dass die Chromophorylie-rung häufig mit Hilfe von Phycobiliproteinlyasen (PBP Lyasen) stattfindet, welche die Phyco-bilinübertragung unterstützen.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der eukaryotischen S-Typ-PBP Lyase GtCPES aus G. theta. Mittels Fluoreszenzspektroskopie und Zink-induzierter Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass GtCPES den Transfer von 3(Z)-PEB auf Cys82 der PBP-β-Untereinheit aus Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB) vermittelt. An der PEB-Bindung sowie am -Transfer beteiligte Aminosäuren wurden mit Hilfe Zielgerichteter Muta-genese identifiziert. Anhand spektroskopischer Binde- und Transferstudien mit den Protein-varianten wurden drei Aminosäuren in der Ligandenbindetasche ermittelt, die relevant für die Bindung sind (Trp69, Glu136, Glu168). Diese koordinieren vermutlich PEB in der Bindetasche und stabilisieren somit die Konformation. Zusätzlich konnten zwei im PEB-Transfer involvierte Aminosäuren eindeutig identifiziert werden (Trp75, Ser150). Trp75 kommt dabei eine essenzielle Bedeutung für den Transfer zu. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Met67 für die auf PEB und DHBV beschränkte Substratspezifität von GtCPES verantwortlich ist. Die Variante GtCPES_M67A bindet sowohl PEB als auch das rigide Phycocyanobilin (PCB) stabil unter Bildung eines farbigen Komplexes in vitro und in vivo in Escherichia coli. GtCPES_M67A scheint zudem in der Lage zu sein, PCB auf geeignete Apo-Proteine zu transfe-rieren. Neben der sterischen und elektrostatischen Umgebung entscheidet damit zusätzlich die Substratspezifität der PBP Lyase über die gebundenen Chromophore am PBP.
Es wurde zuerst das intrinsische Puffersystem der Oozyte charakterisiert, als Grundlage für eine weitere Untersuchung des \(CO_2/HCO_3^{-}\)-Puffersystem. Der \(pK_s\) des intrinsischen Puffersystem betrug 6,9 bei einer totalen Konzentration von 40 mM. Auf Basis des bestimmten \(pK_s\) von 6,9 wurden Carnosin und dessen Derivate als mobile Puffer identifiziert, die die Mobilität der \(H^+\) bestimmen. Aus der apparenten Diffusionskonstanten der \(H^+\) konnte der Anteil an mobilen Puffern am gesamten intrinsischen Puffersystem bestimmt werden, er betrug 37,5% bzw. 15 mM. Intrazelluläre CA erhöhte die Effektivität (Geschwindigkeit) des \(CO_2/HCO_3^{-}\)-Puffersystems, aber nicht die Pufferkapazität im Gleichgewicht. Damit dieser Effekt quantifiziert werden kann, musste die bestehende Definition der Pufferkapazität von Koppel & Spiro aus dem Jahre 1914 um eine zeitliche Komponente erweitert werden. Dafür wurde die Nettoreaktionsgeschwindigkeit r als Maß für die Dynamik eines Puffer oder einer Mischung aus verschiedenen Puffern hergeleitet und durch die numerische Lösung eines Systems an ODEs ausgerechnet . Ohne CA befand sich das \(CO_2/HCO_3^{-}\) bei der Applikation von Butyrat nicht mehr zu jeder Zeit im Gleichgewicht \( ( r\neq 0 ) \), was zu einer erhöhten \(\Delta pH_i/\Delta t\) führte. Nicht nur die Effektivität der Pufferung wurde durch die CA erhöht, auch die apparente Mobilität der Protonen wurde in Anwesenheit von \(CO_2/{HCO_3^{-}}\) erhöht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass \(H^+\) alle theoretisch nötigen Voraussetzungen erfüllt, die es braucht, um als Signalmolekül, ähnlich dem Calcium, fungieren zu können. So wird über die hohe Pufferung und den geringen Anteil an mobilen Puffern (37,5 % in der Oozyte) die Mobilität der \(H^+\) gesenkt, so dass sich Mikrodomänen mit aktiven Konzentrationen ausbilden können. Damit sich unter diesen Umständen eine Mikrodomäne ausbilden kann, ist ein Flux von \(0,8\cdot 10^6 H^+ /s\) nötig. Die Ausbildung von solchen Mikrodomänen kann physiologisch zur lokalen Modulation zellulärer Prozesse führen, da wichtige Bestandteile von Signalkaskaden, wie G-Proteine, pH-sensitiv sind. Die CA spielt für die Signalwirkung der \(H^+\) eine wichtige Rolle, so konnte gezeigt werden, dass CA-Aktivtät zu einer Unterscheidbarkeit von metabolischer und respiratorischer Ansäuerung führt, die ohne CA-Aktivität nicht möglich wäre.