92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES
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Faculty / Organisational entity
Messtechnische Bestimmung der Outputfaktoren für die roboter-gestützte Hochpräzisionsbestrahlung
(2021)
Als ein Teilbereich der Strahlentherapie fokussiert sich die Radiochirurgie auf klar abgrenzbare und nicht allzu große Tumore. Durch eine Eskalation der eingestrahlten Dosis in wenigen Fraktionen wird eine bessere Tumorkontrolle angestrebt. Allerdings wird hierbei das therapeutische Fenster weiter verkleinert. Um dieses schmale Fenster optimal zu nutzen, muss der Dosisgradient hin zum Normalgewebe extrem steil sein. Des Weiteren müssen sehr kleine Feldgrößen wählbar sein um eine sehr gute Dosiskonformität zu erzielen. Die Unschärfen der Einzelschritte der Therapiekette sollten minimal sein. Um diese Anforderungen an die geometrische, dosimetrische und letztlich an die Genauigkeit des Gesamtsystems zu erfüllen, sind dedizierte Geräte notwendig. Als dediziertes Gerät für die Radiochirurgie nutzt das Cyberknife© VSI (Fa. Accuray, Sunnyvale, CA, USA) die Kombination vieler kleiner Felder von 60 mm bis zu 5 mm Durchmesser unter verschiedenen Einstrahlrichtungen um die Dosis selbst bei irregulär geformten Tumoren hochkonformal, unter maximaler Schonung des umgebenden Gewebes, anzupassen. Durch die nichtisozentrische Feldanordnung wird dies noch einmal verbessert. Voraussetzung neben der geometrischen Präzision ist die exakte dosimetrische Berechnung der einzelnen, kleinen Felder aus denen letztlich die Gesamtdosis resultiert. Doch gerade die Kleinfelddosimetrie ist hochempfindlich und daher oftmals mit Fehlern behaftet. Neben der Positioniergenauigkeit, ist die Auswahl der geeigneten Detektoren in Bezug auf Größe und Material, für die Messung der kleinen Felder, besonders wichtig. Insbesondere die korrekte Bestimmung der Wasser-Energiedosis auf dem Zentrahlstrahl, aufgrund des fehlenden lateralen Sekundärelektronengleichgewichts, bleibt auch bei der Verwendung geeigneter Detektoren fehleranfällig. Als Outputfakor bzw. auch totaler Streufaktor, wird das Verhältnis der Dosis auf dem Zentrahlstrahl eines beliebigen Feldes zu einem Referenzfeld bezeichnet. Um eine Gesamtungenauigkeit in der Dosisberechnung von 5 % einzuhalten, ist es notwendig eben diese Outputfaktoren mit einer Unsicherheit von < 3 % zu bestimmen. Ziel der Arbeit ist es anhand verschiedener, für diesen Messzweck geeigneten, Detektoren die Outputfaktoren für die fixen Rundkollimatoren sowie für die Iriskollimatoren des Cyberknife© VSI Systems (Fa. Accuray, Sunnyvale, CA, USA) zu bestimmen. Das Augenmerk gilt hierbei den Feldgrößen kleiner als 25 mm. Ab dieser Feldgröße herrscht aufgrund der Photonengrenzenergie von 6 MeV kein laterales Sekundärelektronengleichgewicht, da die Reichweite der Elektronen größer als die betrachtete Feldgröße ist. Somit lassen sich die Outputfaktoren bzw. totale Streufaktoren nicht direkt mit den zur Verfügung stehenden Messmitteln messen, sondern müssen mit detektorspezifischen Korrekturfaktoren bestimmt werden. Die gemessenen Outputfaktoren werden ausgewertet und mit den Ergebnissen in der Literatur diskutiert. Aus den Ergebnissen der verschiedenen Detektoren soll ein gemittelter Wert abgeleitet und für die Dosisberechnungsalgorithmen als Basisdaten übernommen werden und zu einer Erhöhung der Gesamtgenauigkeit führen.
Die Funktion der c-di-GMP modulierenden Membranproteine NbdA und MucR in Pseudomonas aeruginosa
(2019)
NbdA und MucR sind Multi-Domänenproteine aus Pseudomonas aeruginosa. Beide Proteine besitzen eine ähnliche Domänenorganisation mit einer N-terminalen, membranständigen
MHYT-Domäne sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne im Cytoplasma. Die
cytosolischen Domänen von MucR sind beide aktiv, während NbdA neben der intakten
EAL-Domäne eine degenerierte GGDEF-Domäne mit dem Motiv AGDEF aufweist. Bioinformatischen
Vorhersagen zufolge soll die MHYT-Domäne eine sensorische Funktion für diatomische Gase wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoff vermitteln. Die phänotypische Charakterisierung der markerlosen PAO1-Deletionsmutanten \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR und \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR zeigte, dass NbdA und MucR nicht in die NO-induzierte
Dispersion involviert sind. Ebenso konnte in einem neu etablierten heterologen in-vivo-System in E. coli keine NO-sensorische Funktion der Proteine detektiert werden. Im Weiteren wurde festgestellt, dass die MHYT-Domäne keinen ersichtlichen Einfluss auf die
Enzymaktivität von NbdA und MucR unter aeroben Bedingungen hat. Demzufolge fungiert
die Membrandomäne vermutlich weder als Sensor für Sauerstoff, noch für NO. Anhand heterologer Komplementationstests konnte eine PDE-Aktivität des NbdA-Volllängenproteins
nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die degenerierte AGDEF-Domäne einen regulatorischen Effekt auf die EAL-Domäne hat, der essentiell für die in-
vivo-Aktivität von NbdA ist. In-vivo-Untersuchungen bestätigten die postulierte DGC-Aktivität von MucR. Weiterhin konnte belegt werden, dass MucR ein bifunktionelles Enzym
ist. Entgegen den Erwartungen scheint es jedoch im Planktonischen als DGC und im
Biofilm als PDE zu fungieren.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der homologen Überexpression
von nbdA in P. aeruginosa, welche teilweise unerwartete Phänotypen ergab. Anhand
der homologen Überproduktion einer inaktiven NbdA-Variante stellte sich heraus, dass die
Hemmung der Motilität unabhängig von der Aktivität von NbdA auftritt. Massenspektrometrische
Analysen deuteten daraufhin, dass NbdA lokal c-di-GMP hydrolysiert. Diese
Ergebnisse implizieren, dass NbdA eine Trigger-PDE ist, deren primäre Funktion die Regulation
anderer makromolekularer Zielmoleküle ist. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ist bekannt, dass das NbdA-Homolog Pfl01_1252 mit den Homologen von MucR (Pfl01_2525) und SadC (Pfl01_4451) interagiert. Ergebnisse einer früheren Arbeit lassen eine Interaktion
von NbdA und SadC ebenso in P. aeruginosa vermuten. Daher ist denkbar, dass sich
NbdA im gleichen Netzwerk wie MucR und SadC befindet und deren Aktivität reguliert.
Botrytis cinerea, der Erreger der Graufäule, infiziert hunderte verschiedene Pflanzenspezies und verursacht weltweit enorme landwirtschaftliche Verluste. Dabei tötet er das Wirtsgewebe sehr schnell mithilfe lytischer Enzyme und Nekrose-induzierender Metaboliten und Proteine ab. Das Signal-Mucin Msb2 ist in B. cinerea, wie in anderen pathogenen Pilzen, wichtig für die Oberflächenerkennung, Differenzierung von Appressorien und die Penetration des Pflanzengewebes. Msb2 agiert oberhalb der BMP1 Pathogenitäts-MAPK-Kaskade. In dieser Studie konnte eine direkte Interaktion zwischen Msb2 und BMP1, sowie zwischen den beiden Sensorproteinen Msb2 und Sho1 nachgewiesen werden. Dennoch führte die Deletion von sho1 lediglich zu geringfügigen Defekten im Wachstum, der Hyphendifferenzierung und der Bildung von Infektionsstrukturen. Sho1 zeigte nur einen geringen Einfluss auf die Aktivierung von BMP1. Das Fehlen von Sho1 verursachte keine Virulenzdefekte, während der Doppel-KO von msb2 und sho1 zu einer stärkeren Reduzierung der Läsionsausbreitung im Vergleich zu msb2 Mutanten führte. Es wurden mehrere keimungsregulierte, BMP1 abhängige Gene deletiert und die Mutanten phänotypisch charakterisiert. Keines der Gene für lytische Enzyme oder putative Effektorproteine beeinflusste die Virulenz. Mutanten, denen das für ein Ankyrin-repeat Protein codierende arp1 Gen fehlt, zeigten eine gestörte Oberflächenerkennung, gravierende Wachstumsdefekte und reduzierte Virulenz.
B. cinerea VELVET-Mutanten sind in der lichtabhängigen Differenzierung und der Ausbreitung nekrotischer Läsionen beeinträchtigt. In dieser Arbeit ermöglichte die Charakterisierung mehrerer Mutanten ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge, aufgrund derer der VELVET-Komplex die Entwicklung und Pathogenese in B. cinerea reguliert. Quantitative Vergleiche der in planta Transkriptome und Sekretome führten zur Identifizierung eines für drei VELVET-Mutanten gemeinsamen Sets an herunterregulierten Genen, welche für CAZymes, Proteasen und Virulenz-assoziierte Proteine codieren. Die meisten dieser Gene wurden zusätzlich im Wildtyp während der Infektion verstärkt exprimiert, was zusätzliche Hinweise auf deren Relevanz im Infektionsprozess lieferte. Die drastisch verringerte Expression von Genen für Proteasen konnte mit niedrigerer Proteaseaktivität und der unvollständigen Mazeration des Gewebes an der Infektionsstelle in Verbindung gebracht werden. Der neu etablierte quantitative Sekretom-Vergleich des Wildtyps und der VELVET-Mutanten mithilfe 15N-markierter Proteine korrelierte eindeutig mit den Transkriptomdaten sekretierter Proteine. Damit wurde gezeigt, dass die Abundanz der Proteine maßgeblich von deren mRNA-Level abhängt. Die Unfähigkeit zur Ansäuerung des Wirtsgewebes ist einer der interessantesten phänotypischen Aspekte der VELVET-Mutanten. Während Citrat die dominierende von B. cinerea ausgeschiedene Säure ist, sekretierten VELVET-Mutanten deutlich weniger Citrat. Weder für Oxalat noch für Gluconat konnte eine wichtige Rolle während der Infektion bestätigt werden. Die Läsionsausbreitung der Mutanten wurde sowohl durch Zugabe von Vollmedium, als auch durch künstlich konstant niedrig eingestellte pH-Werte an den Infektionsstellen gefördert, während die Einstellung auf neutrale pH-Werte die Expansion beim B. cinerea Wildtyp stark beeinträchtigte. Damit ist die Ansäuerung in Tomatenblättern ein wichtiger Virulenzmechanismus, der möglicherweise essentiell für die Aktivität der sekretierten Proteine ist.
Überraschenderweise scheint eine Ansäuerung des Gewebes für die erfolgreiche Infektion der Ackerbohne Vicia faba nicht notwendig zu sein. Weder B. cinerea noch der am nächsten verwandte Botrytis fabae, welcher sich als Spezialist auf V. faba aggressiver verhält, zeigten während der erfolgreichen Infektion eine Ansäuerung des Ackerbohnenblattgewebes. B. fabae ist auf wenige Wirtspflanzen der Fabaceae begrenzt. Die Grundlagen der Wirtsspezifität sind bisher unklar. Vergleichende Transkriptom- und Sekretom-Analysen ergaben Hinweise für die molekularen Ursachen der unterschiedlichen Wirtsspektren von B. cinerea und B. fabae. In dieser Arbeit konnte die schlechte Infektion durch B. fabae auf Tomatenblättern mit einer deutlich niedrigeren Proteaseaktivität in Verbindung gebracht werden, während artifiziell konstant niedrige pH-Werte die Läsionsausbreitung kaum förderten. Im Gegensatz zur Infektion von Tomatenblättern wurden jedoch auf V. faba insgesamt deutlich niedrigere Proteaseaktivitäten in den Sekretomen beider Spezies gemessen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die beiden Spezies nicht nur generell unterschiedliche Infektionsstrategien anwenden, sondern dass die Virulenzmechanismen zusätzlich vom infizierten Pflanzengewebe abhängig sind.
Im Verlauf dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression des tonoplastidären Dicarboxylat Transporters zu einem erhöhten Gehalt an Malat bei gleichzeitig vermindertem Citratgehalt in den Überexpressions-Pflanzen führt. Somit konnte, ähnlich wie in den k.o.-Pflanzen, ein reziprokes Verhalten von Citrat und Malat aufgezeigt werden.
Elektrophysiologische Analysen an Oozyten von X. laevis in Zusammenhang mit Aufnahmeversuchen an Proteoliposomen zeigten weiterhin, dass der Transport von Citrat ebenfalls durch den TDT katalysiert wird. Anhand eines negativen Einwärts-Strom an Oozyten konnte gezeigt werden, dass dieser Citrat-Transport elektrogen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Citrat2-H die transportierte Form von Citrat darstellt. Dieses wird vermutlich zusammen mit drei Protonen transportiert.
Die Dianionen Malat und Succinat, sowie höchstwahrscheinlich auch Fumarat, werden ebenfalls über den TDT transportiert. Unter Standardbedingungen werden diese in die Vakuole importiert. Im Gegenzug wird Citrat aus der Vakuole exportiert. Die trans-stimulierende Wechselwirkung von Malat, Succinat und Fumarat auf den Citrat Transport und vice versa bestärkt den in dieser Arbeit postulierten Antiport der jeweiligen Carboxylate über den Tonoplasten. Dieser ist jedoch nicht obligat, was an dem verringerten Transport von Citrat ohne Gegensubstrat über die Membran gezeigt werden konnte.
Unter Trockenstress und osmotischen Stress konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die erhöhte Expression des TDT maßgeblich an der Akkumulation von Malat und der Mobilisierung von Citrat unter den genannten Stressbedingungen beteiligt ist.
Letztlich konnte mittels Säurestressexperimenten nachgewiesen werden, dass die Malatakkumulation, bei gleichzeitigem Citrat Abbau nicht zwingend miteinander gekoppelt sind, unter Säurestress müssen daher weitere regulatorische Effekte auf den Malat-Import bzw. den Citrat-Export vorherrschen.
Schon bei seiner Entdeckung konnte eine Verbindung des Zwei-Komponenten Systems CiaRH mit der natürlichen Kompetenzentwicklung und der β-Laktamresistenz in S. pneumoniae beobachtet werden. Mutationen in der Histidinkinase CiaH bewirken eine sogenannte Hyperaktivierung dieses Systems, welche zu einem vollständigen Verlust der Kompetenz und einem Anstieg der β-Laktamresistenz führen. Der über das CiaRH System vermittelte Kompetenzphänotyp ist dabei abhängig von der Serinprotease HtrA und den csRNAs. Die Serinprotease HtrA reduziert hierbei, durch Proteolyse, die Menge des Kompetenz spezifische Peptid CSP.
In dieser Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass die csRNAs ihre negative Wirkung auf die Kompetenz ausüben, indem sie comC post-transkriptionell reprimieren. Wahrscheinlich wird hierbei die Initiation der Transaltion inhibiert, wobei die Stabilität der mRNA zusätzlich verringert werden könnte. ComC kodiert für das CSP Vorläuferpeptid. Daher üben die csRNAs noch vor der proteolytischen Wirkung von HtrA einen negativen Effekt auf die CSP Produktion aus. Anhand von comC-Translationsfusionen in S. pneumoniae Stämmen mit und ohne csRNAs, sowie in dem Stamm mit hyperaktivem ciaH202-Allel konnte eindeutig gezeigt werden, dass die csRNAs negativ auf die comC-Translation wirken.
Mittels weiterer comC-Translationsfusionen, in Stämmen mit einzelnen csRNAs, ließ sich eine additive Wirkung der einzelnen csRNAs auf die comC-Translation nachweisen. Das bedeutet, dass eine csRNA alleine nicht in der Lage ist die Kompetenz zu reprimieren. Eine Kombination aus csRNA1, csRNA2 und csRNA3 allerdings ist sogar ohne die Anwesenheit von HtrA in der Lage, die Kompetenzentwicklung vollständig zu unterdrücken.
Der Effekt der csRNAs auf die comC-Translation hat Auswirkungen auf die sich entwickelnde Kompetenz, was anhand von β-Galaktosidasemessungen des frühen Kompetenzpromotors PcomX gezeigt wurde. Hier konnte allerdings ein stark positiver Effekt der csRNA4 und csRNA5 auf diesen Promotor beobachtet werden. Weitere Versuche zeigten, dass dieser Effekt auch auf den frühen Kompetenzpromotor PcomC, aber nicht auf den späten Kompetenzpromotor Pcib zu beobachten ist.
Hierbei scheint es sich um einen Regulationsmechanismus der csRNAs zu handeln, welcher die CSP-Produktion erhöht, ohne die Expression der Gene, die für die DNA Aufnahme und den Einbau verantwortlich sind, zu verändern. Der einerseits negative Effekt aller csRNAs auf die comC-Translation und andererseits positive Effekt der csRNA4 und csRNA5 sprechen dafür, dass die csRNAs an der Feinabstimmung der Kompetenzentwicklung beteiligt sind. Tatsächlich lassen sich Unterschiede im Zeitverlauf der Stämme mit einzelnen csRNAs erkennen. Vor allem kann ein Kompetenzpeak, wie im Wildtyp beobachtet, nicht mehr im csRNA-Deletionsstamm nachgewiesen werden.
Die csRNAs scheinen die Kompetenzentwicklung bis zu einem gewissen Grad zu reprimieren. Ist aber der Schwellenwert überschritten, wirkt ein Teil positiv und trägt somit dazu bei, dass die Kompetenzentwicklung ohne Einschränkungen abläuft.
Des Weiteren konnten, durch gezielte Mutationen in der comC mRNA, Bereiche in dieser identifiziert werden, welche für die Bindung der csRNAs an die mRNA essentiell sind. Hierzu gehört zum einen der Bereich zwischen der Shine-Dalgarno Sequenz und dem Startkodon sowie der Bereich direkt nach dem Startkodon AUG. Zum anderen gibt es Hinweise darauf, dass Mutationen, welche die Stabilität der mRNA beeinflussen könnten, die Regulation durch die csRNAs aufheben.
Anhand einer komplementären Veränderung der csRNA4 konnte der negative Effekt dieser csRNA auf die Translation der veränderten comC mRNA wieder hergestellt werden.
Die hier erbrachten Ergebnisse konnten einen weiteren kompetenzregulierenden Faktor identifizieren. Außerdem ergaben sich einige Hinweise, die dazu beitragen können, in weiteren Studien die komplexe Regulation der Kompetenzentwicklung besser zu verstehen.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem, ebenfalls schon bei der Entdeckung des CiaRH Systems beschriebenen, Anstieg der β-Laktamresistenz. Für diesen, durch ein hyperaktives CiaRH System vermittelten Anstieg konnte, wie schon bei der Kompetenz, ein wesentlicher Effekt der csRNAs nachgewiesen werden. Eine Deletion aller csRNAs in einem Stamm mit hyperaktivem CiaRH System bewirkt einen Zusammenbruch der Resistenz auf Wildtyp Niveau. Im Gegensatz zur Kompetenz konnte hier aber kein deutlicher Effekt der Serinprotease HtrA beobachtet werden.
Wie schon bei der Kompetenz lag das Augenmerk dieser Arbeit auf dem Effekt der einzelnen csRNAs auf den Anstieg der β-Laktamresistenz. Hier konnte eine größtenteils additive Wirkung der csRNAs nachgewiesen werden. Allerdings wurden Stämme isoliert, in welchen die β-Laktamresistenz um das 10-fache im Vergleich zu dem Stamm mit hyperaktivem CiaRH System anstieg. Hierbei handelt es sich um Stämme, die csRNA4 oder csRNA5 enthalten. Da eine starke Instabilität in diesen Stämmen zu beobachten war, ist davon auszugehen, dass es hier zu Zusatzmutationen kam, welche den Resistenzanstieg bewirken. Allerdings konnte nachgewiesen werden, dass der beobachtete Resistenzanstieg nur im Zusammenhang mit csRNA4 vermittelt wird. Falls es hier zu Zusatzmutationen im Genom kam, wäre deren vermittelter Resistenzanstieg von csRNA4 abhängig.
Da im Falle der β-Laktamresistenz die computerbasierte Zielgensuche keinen geeigneten Kandidaten erbrachte und keines der bekannten csRNA regulierten Gene die Resistenz beeinflusst, wurde hier eine globale Transkriptomanalyse zur Zielgensuche durchgeführt.
Anhand dieser globalen Transkriptomanalyse konnten zwei neue potenzielle CiaR regulierte Gene, pavB und spr0091, identifiziert werden.
Des Weiteren konnten zwei Gene, spr0264 und oxlT, identifiziert werden, deren Translation negativ durch die csRNAs reguliert wird. Hier konnte gezeigt werden, dass der UTP Metabolismus der Zelle betroffen ist. Hierrüber könnte die Menge an UDP verändert werden, welches zur Aktivierung von Vorläuferstufen der Zellwandbiosynthese benötigt wird. Ob diese beiden Transporter an dem Anstieg der Resistenz beteiligt sind, wurde bisher nicht untersucht.
Die innerhalb dieser Arbeit durchgeführten globalen Transkriptomanalysen stellen allerdings eine gute Basis zur weiteren Identifikation von möglichen potenziellen csRNA Zielgenen dar. Hierüber könnte eventuell auch das β-Laktam spezifische Zielgen identifiziert werden. Das der deutliche Effekt der csRNAs, sekundär auf ein schon bekanntes β-Laktamresistenzgen zurückzuführen ist, ist dabei durchaus denkbar.
Die in dieser Arbeit nachgewiesenen Regulationen der csRNAs bezüglich der Kompetenz- und β-Laktamresistenz konnten einen großen Beitrag zum besseren Verständnis dieser Regulations-mechanismen in S. pneumoniae leisten. Des Weiteren bilden die hier ermittelten Ergebnisse eine gute Basis für weitere Experimente.
Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst mit der β-Lactamresistenz, Kompetenz, Autolyse, Bakteriocinproduktion und Virulenz eine Vielzahl an Phänotypen in Streptococcus pneumoniae und ist daher von großer physiologischer Bedeutung. Es setzt sich aus der membrangebundenen Sensorkinase CiaH und dem cytoplasmatisch lokalisierten Response Regulator CiaR zusammen. Das CiaRH System ist unter sehr vielen Wachstumsbedingungen aktiv. CiaH ist allerdings für die Aktivierung von CiaR unter bestimmten Bedingungen verzichtbar. CiaR ist jedoch in seiner phosphorylierten Form aktiv, was die Frage nach einer alternativen Phosphatquelle für CiaR aufwirft. Der sog. Crosstalk durch eine fremde Sensorkinase oder niedermolekulare Phosphodonoren wie Acetylphosphat stellen mögliche Wege zur alternativen Phosphorylierung von CiaR dar.
Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Gene des Acetylphosphat-Stoffwechsels inaktiviert, was zu einer Änderung der Produktion von Acetylphosphat führen sollte. Anschließende Messungen der zellulären Acetylphosphatmenge und der CiaR-abhängigen Promotoraktivitäten in Abwesenheit der Sensorkinase CiaH zeigten klar, dass mit sinkendem Acetylphosphat auch die CiaR-vermittelte Genexpression reduziert wurde. Diese Korrelation legt den Schluss nahe, dass Acetylphosphat tatsächlich den wesentlichen alternativen Phosphodonor für CiaR darstellt. Allerdings wurden auch Hinweise für geringfügigen Crosstalk durch eine andere Sensorkinase erhalten. Im Zuge dieser Experimente ergab sich weiterhin, dass ein Enzym des Acetylphosphat-Stoffwechsels, die Acetatkinase, eine besondere Rolle bei der alternativen Phosphorylierung von CiaR spielt. Eine Reihe von Befunden legt den Schluss nahe, dass Acetatkinase und CiaR möglicherweise interagieren. Eine solche regulatorische Rolle der Acetatkinase ist bisher nicht beschrieben.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CiaR-Aktivität durch die Bifunktionalität von CiaH auf nahezu konstantem Niveau gehalten wird. Dabei kann wahrscheinlich Acetat, ein exkretiertes Endprodukt des Acetylphosphat-Stoffwechsels, zur Stimulierung der Phosphataseaktivität von CiaH dienen. Dies könnte von physiologischer Bedeutung sein, um eine von Acetylphosphat ausgehende Phosphorylierung von CiaR durch Acetat im Medium durch Dephosphorylierung zu begrenzen. Somit könnten Acetylphosphat und Acetat Gegenspieler zur Regulation der CiaR-Aktivität darstellen.
Ein einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde auf die Auswirkungen von Mutationen in CiaH auf die CiaR-Aktivität eingegangen. Das CiaRH-System wurde als erste Nicht-PBP-Resistenzdeteminante in β-lactamresistenten Labormutanten von S. pneumoniae R6 entdeckt, wobei eine Mutation im Sensorkinasegen ciaH (ciaH306, T230P) eine Erhöhung der CiaR-abhängigen Genexpression vermittelte. Weitere ciaH-Mutationen wurden in anderen spontanresistenten Labormutanten beschrieben. Die Laborallele vermitteln eine Steigerung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität zwischen vier- und 26-fach. Phänotypische Folgen sind die Verringerung der β-Lactamsuszeptibilität, der Verlust der Kompetenz und verändertes Wachstum von S. pneumoniae R6.
Im Zuge dieser Arbeit wurden zum ersten Mal veränderte ciaH-Allele in klinischen Pneumokokken-Isolaten identifiziert und charakterisiert. Es zeigte sich eine Verbreitung in Isolaten der Serotypen 6, 7, 9, 19 und 23. Im Gegensatz zu den Laborallelen vermitteln die klinischen Allele eine bis zu dreifache Erhöhung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität. Lediglich das Allel ciaHTpVT beeinflusst die Phänotypen β-Lactamresistenz und Kompetenz. Weiterhin erfolgte die Charakterisierung der Kinase- und Phosphataseaktivitäten der klinischen ciaH-Allele. Hierbei zeigten sich Abweichungen der Stärken beider Funktionen, wobei für ciaH306 ein Phosphatasedefekt festgestellt wurde.
Bei Frauen ist Brustkrebs mit einem Viertel aller Krebserkrankungen die am häufigsten diagnostizierte Krebsart, während die Inzidenz bei Männern wesentlich geringer ist. Nur 10-15% aller Brustkrebserkrankungen können auf familiär prädisponierende Faktoren wie BRCA1 und BRCA2 zurückgeführt werden. Eine genetische Prädisposition bei hereditärem männlichem Brustkrebs wird für BRCA2 bestätigt. Funktionelle Analysen geben Grund zur Annahme, dass BRCA2 eine duale Rolle besitzt. Neben der Caretaker-Funktion für genomische Stabilität, ist auch eine Gatekeeper-Funktion bei der Transkriptionsregulation beschrieben. Die Basis dieser Arbeit beruht auf der Beobachtung, dass männliche BRCA2-Mutationsträger von 3 verschiedenen Familien mit hereditärem Brustkrebs auffällige chromosomale Veränderungen der Region 9p23-24 aufweisen. Vorarbeiten ließen einen kausalen Zusammenhang zwischen BRCA2-Mutation und 9p-Veränderung möglich erscheinen. Das Ziel der Arbeit bestand darin, durch molekularbiologische Methoden die Bruchpunkte in 9p23-24 bei BRCA2-Mutationsträgern unabhängiger Familien zu identifizieren und damit einen weiteren Hinweis auf die Entstehung dieser Instabilität zu geben. In dieser Arbeit konnten mittels FISH, PFGE und bioinformatischer Techniken sowohl Inversionen als auch Duplikationen festgestellt werden. Eine überlappende Inversion zeigte sich hierbei deutlich bei allen untersuchten Mutationsträgern. Mit einer FISH-Analyse konnte bei den Mutationsträgern der Familien 1 bis 3 eine Inversion im Bereich der STS-Marker D9S267 und D9S775 detektiert werden. Ferner konnte durch Interphasen-FISH eine Duplikation im Bruchpunktbereich um den STS-Marker D9S268 identifiziert werden. Southern-Analysen konnten Bruchpunkte in den Mutationsträgern der Familien 1 und 2 mittels der Enzyme EcoRI und SacI bestätigen. In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich die Inversionsbruchpunkte der Mutationsträger 3.3, 3.4 und 3.5 von Familie 1 in der unmittelbaren Nähe von low-copy repeats befinden, deren Größe 5kb-8kb beträgt. Die identifizierte Inversion überspannt im Wesentlichen die Gene TYRP1 und mPDZ. Bei dem durch die Inversion direkt betroffenen Gen handelt es sich um das mPDZ-Gen. Das Protein besitzt 13 PDZ-Domänen, deren Interaktionspartner beschrieben sind. Die Genexpression beider Gene konnte in lymphoblastoiden Zellen nachgewiesen werden. Die Erkenntnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass Repeat-Sequenzen in der Umgebung der Bruchpunkte bei der Entstehung von Rearrangements auch in diesen BRCA2-Mutationsträgern eine große Rolle spielen.