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Abstract: Colorectal cancer (CRC) is a frequently occurring malignant disease with still low survival rates, highlighting the need for novel therapeutics. Merosesquiterpenes are secondary metabolites from marine sponges, which might be useful as antitumor agents. To address this issue, we made use of a compound library comprising 11 isolated merosesquiterpenes. The most cytotoxic compounds were smenospongine > ilimaquinone ≈ dactylospontriol as shown in different human CRC cell lines. Alkaline Comet assays and γH2AX immunofluorescence microscopy demonstrated DNA strand break formation in CRC cells. Western blot analysis revealed an activation of the DNA damage response with CHK1 phosphorylation, stabilization of p53 and p21, which occurred both in CRC cells with p53 knockout and in p53-mutated CRC cells. This resulted in cell cycle arrest followed by a strong increase in the subG1 population, indicative of apoptosis, and typical morphological alterations. In consistency, cell death measurements showed apoptosis following exposure to merosesquiterpenes. Gene expression studies and analysis of caspase cleavage revealed mitochondrial apoptosis via BAX, BIM and caspase-9 as main cell death pathway. Interestingly, the compounds were equally effective in p53-wildtype and p53-mutant CRC cells. Finally, the cytotoxic activity of the merosesquiterpenes was corroborated in intestinal tumor organoids, emphasizing their potential for CRC chemotherapy.
The consumption of red meat is probably carcinogenic to humans and is associated with an increased risk to develop colorectal cancer (CRC). Red meat contains high amounts of heme iron, which is thought to play a causal role in tumor formation. In this study, we investigated the genotoxic and cytotoxic effects of heme iron (i.e., hemin) versus inorganic iron in human colonic epithelial cells (HCEC), human CRC cell lines and murine intestinal organoids. Hemin catalyzed the formation of reactive oxygen species (ROS) and induced oxidative DNA damage as well as DNA strand breaks in both HCEC and CRC cells. In contrast, inorganic iron hardly affected ROS levels and only slightly increased DNA damage. Hemin, but not inorganic iron, caused cell death and reduced cell viability. This occurred preferentially in
non-malignant HCEC, which was corroborated in intestinal organoids. Both hemin and inorganic iron were taken up into HCEC and CRC cells, however with differential kinetics and efficiency. Hemin caused stabilization and nuclear translocation of Nrf2, which induced heme oxygenase-1 (HO-1) and ferritin heavy chain (FtH). This was not observed after inorganic iron treatment. Chemical inhibition or genetic knockdown of HO-1 potentiated hemin-triggered ROS
generation and oxidative DNA damage preferentially in HCEC. Furthermore, HO-1 abrogation strongly augmented the cytotoxic effects of hemin in HCEC, revealing its pivotal function in colonocytes and highlighting the toxicity of free intracellular heme iron. Taken together, this study demonstrated that hemin, but not inorganic iron, induces ROS and DNA damage, resulting in a preferential cytotoxicity in non-malignant intestinal epithelial cells. Importantly, HO-1
conferred protection against the detrimental effects of hemin.
The consumption of red meat is associated with an increased risk for colorectal cancer (CRC). Multiple lines of evidence suggest
that heme iron as abundant constituent of red meat is responsible for its carcinogenic potential. However, the underlying
mechanisms are not fully understood and particularly the role of intestinal inflammation has not been investigated. To address
this important issue, we analyzed the impact of heme iron (0.25 μmol/g diet) on the intestinal microbiota, gut inflammation
and colorectal tumor formation in mice. An iron-balanced diet with ferric citrate (0.25 μmol/g diet) was used as reference.
16S rRNA sequencing revealed that dietary heme reduced α-diversity and caused a persistent intestinal dysbiosis, with a
continuous increase in gram-negative Proteobacteria. This was linked to chronic gut inflammation and hyperproliferation of
the intestinal epithelium as attested by mini-endoscopy, histopathology and immunohistochemistry. Dietary heme triggered
the infiltration of myeloid cells into colorectal mucosa with an increased level of COX-2 positive cells. Furthermore, flow
cytometry-based phenotyping demonstrated an increased number of T cells and B cells in the lamina propria following heme
intake, while γδ-T cells were reduced in the intraepithelial compartment. Dietary heme iron catalyzed formation of fecal
N-nitroso compounds and was genotoxic in intestinal epithelial cells, yet suppressed intestinal apoptosis as evidenced by
confocal microscopy and western blot analysis. Finally, a chemically induced CRC mouse model showed persistent intestinal
dysbiosis, chronic gut inflammation and increased colorectal tumorigenesis following heme iron intake. Altogether, this study
unveiled intestinal inflammation as important driver in heme iron-associated colorectal carcinogenesis
Dickdarmkrebs (kolorektales Karzinom, KRK) ist die dritthäufigste Krebserkrankung weltweit. Der Lebenswandel, insbesondere die Ernährungsgewohnheiten, zählen zu den bedeutendsten Risikofaktoren für KRK. Dabei steht Häm-Eisen, welches hauptsächlich durch den Verzehr von rotem Fleisch aufgenommen wird, im Verdacht, das KRK-Risiko zu erhöhen. Es wird vermutet, dass Häm-Eisen durch die Bildung endogener N-Nitrosoverbindungen (NOCs) und reaktiver Sauerstoffspezies sowie durch eine gesteigerte Proliferation des Kolonepithels die Entstehung des KRK fördert. NOC-induzierte Alkylierungsschäden der DNA, insbesondere mutagene O6-Methylguanin-Läsionen (O6-MeG), die durch die O6-MeG-DNA-Methyltransferase (MGMT) repariert werden, könnten in der Ätiologie von KRK von Bedeutung sein. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der Häm-Eisen-vermittelten kolorektalen Kanzerogenese sind jedoch wenig verstanden und wurden in der vorliegenden Arbeit näher untersucht.
Der Fokus dieser Arbeit lag einerseits auf der Untersuchung der Wirkung von Häm-Eisen auf das intestinale Mikrobiom und auf intestinale Entzündungsprozesse. Andererseits wurde die Bildung kanzerogener NOCs, sowie die durch sie verursachten DNA-Schäden und die DNA-Schadensantwort bzw. -reparatur näher analysiert. Zu diesem Zweck wurden wildtypische (WT), DNA-reparaturkompetente Mäuse mit einer Häm-Eisen-haltigen Diät gefüttert, wohingegen die Kontrollgruppe eine eisenbalancierte Diät mit Zusatz von Eisencitrat erhielt. Die Rolle der DNA-Reparatur wurde durch Verwendung transgener Mäuse, die einen Knockout des MGMT Gens (MGMT-/-) besitzen, untersucht. Zunächst konnte beobachtet werden, dass Häm-Eisen die endogene Bildung fäkaler NOCs steigerte, was mit einer erhöhten Fäkalwasser-Zytotoxizität in vitro in humanen Darmepithelzellen verbunden war. Weiterhin reduzierte Häm-Eisen die Zellviabilität intestinaler Kryptorganoide ex vivo. In vivo induzierte diätisches Häm-Eisen DNA-Doppelstrangbrüche (γH2AX) in intestinalen Epithelzellen, welche mit der Stabilisierung von p53 einhergingen. Zudem wurde in peripheren Blutzellen aus MGMT-/- Mäusen ein Anstieg von γH2AX in T-Zellen nach Häm-Eisen beobachtet. Eine Hyperproliferation des Kolonepithels durch Häm-Eisen zeigte sich als Zunahme PCNA-positiver Zellen sowie mitotischer Figuren, die zusammen mit der beobachteten reduzierten Apoptoserate einen kompensatorischen Mechanismus gegenüber den Häm-Eisen-vermittelten Schäden im Kolonepithel darstellen könnte. Die Analyse des intestinalen Mikrobioms mittels 16S rRNA-Sequenzierung ergab eine Häm-Eisen-abhängige Reduktion der α-Diversität sowie eine frühe intestinale Dysbiose, die über 162 Tage persistierte. Diese korrelierte mit einem Anstieg gramnegativer Bakterien, während die Abundanz der grampositiven Arten abnahm. Weiterhin wurde das intestinale Entzündungsmuster mittels nicht-invasiver Mini-Endoskopie mit anschließender Bestimmung des Inflammationsgrades (murine endoscopic index of colits severity, MEICS) analysiert. Diese Untersuchungen ergaben eine chronische Kolitis nach der Häm-Eisendiät, die zudem mit einer Aktivierung des intestinalen Immunsystems, einer Infiltration von B- und T-Zellen und einem Anstieg inflammatorischer Marker (pSTAT-3, COX-2) im Dickdarmgewebe einherging. Zur Analyse der tumorpromovierenden Eigenschaften von Häm-Eisen wurde WT Mäusen der kolonotrope Tumorinitiator Azoxymethan (AOM) verabreicht und diese in einer Langzeitstudie mit Häm-Eisen- oder Eisencitrat-haltiger Diät gefüttert. Durch die Anwendung einer Mini-Endoskopie wurde gezeigt, dass Häm-Eisen tumorpromovierend wirkt und die Anzahl sowie die Größe der AOM-induzierten Tumore erhöht. Interessanterweise wurden sogar tumorinitiierende Eigenschaften von diätischem Häm-Eisen in MGMT-/- Tieren festgestellt, wohingegen keine Initiation in WT Tieren beobachtet wurde.
Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass diätisches Häm-Eisen eine chronische Kolitis auslöst, die mit einer Aktivierung des intestinalen Immunsystems und einer persistierenden Dysbiose des Darmmikrobioms verbunden ist. Zusätzlich förderte Häm-Eisen kolorektale Tumore durch die beobachteten tumorpromovierenden Eigenschaften. In MGMT-/- Mäusen, nicht aber in WT Mäusen, führte diätisches Häm-Eisen sogar ohne initiale AOM-Injektion zur signifikant vermehrten Entstehung kolorektaler Tumore. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Häm-Eisen bei einer Inaktivierung von MGMT, was in 40 % der sporadischen kolorektalen Karzinome beim Menschen der Fall ist, KRK sowohl initiieren als auch promovieren kann.
The consumption of red meat is associated with an increased risk for colorectal cancer (CRC). Multiple lines of evidence suggest
that heme iron as abundant constituent of red meat is responsible for its carcinogenic potential. However, the underlying
mechanisms are not fully understood and particularly the role of intestinal inflammation has not been investigated. To address
this important issue, we analyzed the impact of heme iron (0.25 μmol/g diet) on the intestinal microbiota, gut inflammation
and colorectal tumor formation in mice. An iron-balanced diet with ferric citrate (0.25 μmol/g diet) was used as reference.
16S rRNA sequencing revealed that dietary heme reduced α-diversity and caused a persistent intestinal dysbiosis, with a
continuous increase in gram-negative Proteobacteria. This was linked to chronic gut inflammation and hyperproliferation of
the intestinal epithelium as attested by mini-endoscopy, histopathology and immunohistochemistry. Dietary heme triggered
the infiltration of myeloid cells into colorectal mucosa with an increased level of COX-2 positive cells. Furthermore, flow
cytometry-based phenotyping demonstrated an increased number of T cells and B cells in the lamina propria following heme
intake, while γδ-T cells were reduced in the intraepithelial compartment. Dietary heme iron catalyzed formation of fecal
N-nitroso compounds and was genotoxic in intestinal epithelial cells, yet suppressed intestinal apoptosis as evidenced by
confocal microscopy and western blot analysis. Finally, a chemically induced CRC mouse model showed persistent intestinal
dysbiosis, chronic gut inflammation and increased colorectal tumorigenesis following heme iron intake. Altogether, this study
unveiled intestinal inflammation as important driver in heme iron-associated colorectal carcinogenesis.