Refine
Year of publication
- 2004 (1)
Document Type
- Doctoral Thesis (1)
Language
- German (1)
Has Fulltext
- yes (1)
Keywords
- Antigenspezifische Immunsuppression (1) (remove)
Faculty / Organisational entity
Mit Hilfe von Trifluormethansulfonsäure gelang die chemische Deglykosylierung von natürlichem Gelonin. Durch die Charakterisierung mit Hilfe von SDS-PAGE, wurden Hinweise auf das Vorliegen der Aminosäurensequenz von Nolan et al. gefunden. Durch Auswertung massenspektrometrischer Daten wurde ein mögliches Glykosylierungsmuster vorgeschlagen. Die Expression von rekombinantem Gelonin in E.coli und anschließende Isolierung mit Hilfe der Nickel-Affinitätschromatographie führte zu einem Produkt, das trotz fehlender Glykosylierung um den Faktor 2 toxischer war als natürliches Gelonin und vergleichbare immunologische Eigenschaften aufwies. Durch molekularbiologische Arbeiten wurde der Expressionsvektor für ein AChR-Fragment (a-Untereinheit, AS 4-181) um die DNA-Information für die Aminosäuren 182-208 erweitert. Eine Expression führte zur Bildung eines nativen Produktes, während die native Isolierung des verkürzten Fragmentes nicht erfolgreich war. Ein rekombinant hergestelltes Fusionsprotein aus Gelonin und einem AChR-Fragment (a-Untereinheit, AS 4-181) konnte in hoher Ausbeute und Reinheit mit Hilfe von Nickel-Affinitätschromatographie isoliert werden. Da eine denaturierende Aufarbeitung notwendig war, wurde eine geeignete Renaturierungsmethode entwickelt. Trotz Optimierung fielen allerdings noch bis zu 80% des Fusionsproteins als falsch-gefaltete, unlösliche Proteinaggregate aus. Durch Einführung einer „Recyclingmethode“ konnte der Proteinverlust deutlich minimiert werden. Beide Domänen zeigten sich nativ gefaltet. Allerdings war das Gelonin-Fragment um den Faktor 11 untoxischer als rekombinantes Gelonin alleine. Das Fusionsprotein wurde in einem Tiermodell der Myasthenia gravis auf seine potentiellen antigenspezifischen immunsuppressiven Eigenschaften gestestet. Nach der Induktion der Erkrankung in Ratten durch Gabe von komplettem AChR, wurde die Erkrankung durch repetitive Nervenstimulation untersucht. Eine Methode die auch bei humaner Myasthenie angewendet wird. Nach der Gabe des Fusionsproteins verschwanden die myasthenen Symptome in der Ratte innerhalb einer Woche. Damit zeigte das Fusionsprotein einen therapeutischen Effekt. Langzeitstudien wurden allerdings nicht durchgeführt.